CN104849339B - 金枪鱼鱼肉双向电泳蛋白质图谱的获取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种金枪鱼鱼肉双向电泳蛋白质图谱的获取方法，依次进行以下步骤：1)、金枪鱼鱼肉蛋白质提取及纯化，得蛋白提取液；2)、一向等电聚焦；3)、二向SDS‑PAGE电泳；4)、染色及图像分析。采用本发明方法对金枪鱼鱼肉蛋白进行分离，能获得较多的蛋白质点，重复性好，背景清晰，无横纵条纹现象，结果稳定。此发明适用于各种金枪鱼鱼肉蛋白双向电泳凝胶方法，为进一步对金枪鱼蛋白组学和分子生物学的研究奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及了一种适用于金枪鱼双向电泳凝胶技术，属于生物技术领域。该技术可直接应用于各类金枪鱼蛋白质组学的研究。
背景技术
金枪鱼也称鲔鱼、吞拿鱼，属大洋性高度洄游鱼类。常见的金枪鱼类计有5个属，17个种，其中对渔业影响较大的主要品种是大眼金枪鱼、黄鳍金枪鱼、长鳍金枪鱼和鲣鱼4个种类，这4种金枪鱼产量从1998的382.6万吨增加到2008的430万吨。金枪鱼肉质柔嫩鲜美，富含多种蛋白质、氨基酸、脂肪等营养物质，是不可多得的健康美食，被世界营养学会推荐为三大营养鱼之一。
金枪鱼种类繁多，且价值差异较大，因此常有低值金枪鱼冒充高值金枪鱼的事件发生。利用基于双向电泳的蛋白质组学技术，可以通过不同品种潜在的特征性蛋白点(Target)来区别鱼种，从而对鱼种高效准确的鉴别，保证水产品质和安全。此外金枪鱼鱼肉品质影响着产品营养价值和经济价值，鱼肉鲜度是衡量金枪鱼品质好坏的重要指标。蛋白质是水产品肌肉中最重要的组分，在冷藏过程中鱼肉蛋白质降解引起水产品鲜度下降，尤其与鱼肉质构特性变化具有密切相关，是导致鱼肉品质变化最主要因素。利用差异蛋白质组学技术体系研究冷藏过程中金枪鱼肉鲜度变化机制，能够为控制鱼肉品质变化提供了一个新思路。目前利用双向电泳获得蛋白图谱的方法在水产品领域有一定程度的应用。而在金枪鱼应用方面几乎空白。
现有报道的“水产品双向电泳获得蛋白图谱的方法”主要为大黄鱼双向电泳方法建立，其主要步骤为用液氮研磨，加入裂解液裂解，离心后直接水化上样，然后依次进行等电聚焦和SDS-PAGE电泳，最后染色得到图谱。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种金枪鱼鱼肉双向电泳蛋白质图谱的获取方法，本发明是一种适用于金枪鱼的双向电泳凝胶技术，是针对金枪鱼鱼肉蛋白采用双向电泳技术制备，能获得较高质量的双向电泳图谱。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种金枪鱼鱼肉双向电泳蛋白质图谱的获取方法，依次进行以下步骤：
1)、金枪鱼鱼肉蛋白质提取及纯化；得蛋白提取液；
2)、一向等电聚焦；
取步骤1)所得的蛋白提取液，按上样量150μg用水化液稀释至460μL的上样体积，得样品液；
将样品液加入等电聚焦盘中，再将pH4-7、24cm的IPG胶条胶面向下放入盘中，除去胶面与样品液之间的气泡，加入6ml矿物油，覆盖胶条，进行一向等电聚焦；
设定参数如下：
上述水化液的配方为：在1ml的蛋白质裂解液中加入0.01g的二硫苏糖醇(DTT)和10μL的IPG Buffer(pH4-7)；
3)、二向SDS-PAGE电泳，包括以下步骤：
①胶条平衡：向步骤2)所得的聚焦好后的胶条加入平衡液I，平衡12～17min(较佳为15min)，倒净平衡液I后加入平衡液II，避光平衡12～17min(较佳为15min)；
备注说明：平衡液I、平衡液II的用量只需确保将胶条覆盖即可，第一处平衡不需要避光；
平衡缓冲液母液为：在500ml的Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L，pH8.8)中加入3mol的尿素、10g十二烷基磺酸钠(SDS)、150ml的甘油、0.01g的溴酚蓝；
平衡液I：在平衡缓冲液母液加入100mM的二硫苏糖醇(DTT)；
平衡液II：在平衡缓冲液母液加入250mM的碘乙酰胺；
②SDS-PAGE电泳：将步骤①所得的平衡好的胶条置于12.5％的SDS-PAGE凝胶上，用琼脂糖封顶液封胶，加入电泳缓冲液进行二向电泳，设定参数如下：
先用2w/胶，1h；再用17w/胶直至溴酚蓝跑出胶面；
4)、染色及图像分析。
作为本发明的金枪鱼鱼肉双向电泳蛋白质图谱的获取方法的改进：
所述步骤4)为：
将步骤3)所得的胶片进行银染或考马斯亮蓝显色后通过UMAX公司的PowerLook2100XL-USB扫描分析仪获取图像，采用PD-Quest软件进行处理从而得金枪鱼双向电泳凝胶图谱。
作为本发明的金枪鱼鱼肉双向电泳蛋白质图谱的获取方法的进一步改进：
所述蛋白质裂解液为：在每10ml水中加入70mmol的尿素、20mmol的硫脲、0.4g的3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)、0.01mmol的苯甲基磺酰氟。
即，蛋白质裂解液为：7M尿素、2M硫脲、4％(w/v)3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)、1mM苯甲基磺酰氟。
备注说明：上述蛋白质裂解液分装成1ml。置于-80℃保存。
作为本发明的金枪鱼鱼肉双向电泳蛋白质图谱的获取方法的进一步改进：
所述步骤1)包括以下步骤：
①、取干冰运输的金枪鱼鱼肉，置于-70～-90℃(例如为-80℃)保存；
②、称取步骤①所得的0.1g鱼肉作为样品放入液氮预冷后的研钵中，加液氮研磨成粉末状；
③、在步骤②所得的粉末中加入750～850μL(较佳为800μL)蛋白质裂解液，充分溶解粉末后离心(例如为：4℃，12000r/min，离心20min)，收集上清液Ⅰ；
④、对步骤③所得的上清液Ⅰ进行超声处理，从而破碎核酸；离心(例如为：4℃，12000r/min，离心20min)，收集上清液Ⅱ，在上清液Ⅱ中加入3.5～4.5体积倍(较佳为4体积倍)的丙酮后，于-18～-22℃(较佳为-20℃)沉淀10～14小时(过夜)；然后离心(例如为：4℃，12000r/min，离心20min)，对去除上清液后的沉淀物干燥，得纯化的蛋白质团块(-80℃保存备用)；
⑤、在步骤④所得的蛋白质团块中加入500～700μL(较佳为600μL)蛋白质裂解液，超声助溶直至蛋白质团块溶解，离心(例如为：4℃，12000r/min，离心20min)，得蛋白提取液。
作为本发明的金枪鱼鱼肉双向电泳蛋白质图谱的获取方法的进一步改进：
所述步骤3)的步骤②中：
12.5％的SDS-PAGE凝胶为：在180ml的超纯水中加入220ml的30％(w/v)丙烯酰胺储液、125ml的Tris-Hcl缓冲液(1.5mol/L，pH8.8)、5.3ml的10％(w/v)十二烷基磺酸钠(SDS)水溶液、2.1mL的10％(w/v)过硫酸铵水溶液、138μL的N,N,N',N'-四甲基乙二胺；
上述30％(w/v)丙烯酰胺储液为：在1000ml水中加入290g丙烯酰胺和10g N,N'-甲叉双丙烯酰胺。
上述10％(w/v)十二烷基磺酸钠(SDS)水溶液为：在1000ml水中加入100g十二烷基磺酸钠。
上述10％(w/v)过硫酸铵水溶液为：在1000ml中加入100g过硫酸铵。
作为本发明的金枪鱼鱼肉双向电泳蛋白质图谱的获取方法的进一步改进：
琼脂糖封胶液为：在每100ml水中加入0.8g低熔点琼脂糖、0.002g溴酚蓝；
即，琼脂糖封胶液为：0.8％(w/v)的低熔点琼脂糖，0.002％(w/v)的溴酚蓝；
电泳缓冲液为：在1L水中加入1g SDS、0.192mol的甘氨酸、25mmol的Tris-base。
即，电泳缓冲液：0.1％(w/v)SDS，25mM Tris-base，192mM甘氨酸。
整个过程中所有“水”均为超纯水。
本发明的发明点主要在于(并不仅仅指如下3点)：
1、蛋白质裂解液的配方中多添加了1mM苯甲基磺酰氟作为蛋白酶抑制剂，从而抑制蛋白质降解。
2、现有技术中，直接将鱼肉蛋白研磨，然后经裂解液裂解、离心作为上样液。本发明采用了不同的蛋白质提取方法，对鱼肉核酸进行破碎，并进行蛋白质的纯化步骤。
金枪鱼属于深海鱼类，其鱼肉盐分含量相对较高，其肉质蛋白提取后需要进行一定的纯化过程。此外，金枪鱼捕捞后，常直接分割后于-50℃保存运输。整个过程不像大黄鱼等鱼类处于鲜活状态，因此其蛋白质极易降解。根据此特性，本发明在裂解液中需要加入一定量的蛋白酶抑制剂，抑制蛋白降解。本发明在此理论基础上优化，希望得到优质的金枪鱼双向电泳图谱。
3、设置优化后的一向等电聚焦工艺参数和二向SDS-PAGE电泳工艺参数。
本发明具有如下优点：
1、操作简易，易于推广实施；
2、金枪鱼双向电泳图谱中蛋白质点清晰、数目较多、分布均匀；
3、蛋白图谱背景清晰，结果稳定，重复率高。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为大目金枪鱼蛋白质组双向电泳图谱；
图2为长鳍金枪鱼蛋白质组双向电泳图谱；
图3为黄鳍金枪鱼蛋白质组双向电泳图谱；
图4为对比例1所得的图谱；
图5为对比例2所得的图谱。
具体实施方式
实施例1、一种金枪鱼鱼肉双向电泳蛋白质图谱的获取方法，使用的金枪鱼材料为大目金枪鱼，取其鱼肉；依次进行以下步骤：
1)、金枪鱼鱼肉蛋白质提取及纯化；
①、取金枪鱼鱼肉样品，干冰运输(确保运输时的温度为≤-50℃)，置于实验室-80℃保存备用；
②、称取步骤①所得的0.1g鱼肉作为样品放入液氮预冷后的研钵中，加液氮研磨成粉末状；
③、在步骤②所得的粉末中加入800uL蛋白质裂解液(7M尿素、2M硫脲、4％(w/v)3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)、1mM苯甲基磺酰氟)，充分溶解粉末后转移至1.5mL EP管中，4℃，12000r/min，离心20min，收集上清液Ⅰ；
即，蛋白质裂解液的配方为：在每10ml水中加入70mmol的尿素、20mmol的硫脲、0.4g的3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)、0.01mmol的苯甲基磺酰氟。
该蛋白质裂解液分装成1ml，置于-80℃保存。
④、对步骤③所得的上清液Ⅰ进行超声处理(超声功率40W，超声10s，间歇15s，反复8次)，破碎核酸。4℃，12000r/min，离心20min，收集上清液Ⅱ。
将上清液Ⅱ均匀分装成3管，每管约250μL，每管再加入1mL丙酮于-20℃沉淀过夜(12小时)。然后于4℃，12000r/min，离心20min，倒去上清液，所得的沉淀物-20℃干燥至恒重，得到纯化的蛋白质团块，-80℃保存备用。
⑤、在步骤④每管对应所得的蛋白质团块中加入200μL蛋白质裂解液，超声助溶(超声功率为80W，超声0.8秒，间歇0.8秒，反复4次后放于冰上冷却5～10秒，然后再重复上述超声、间歇、冰上冷却，直至蛋白质团块溶解)，4℃，12000r/min，离心20min，得蛋白提取液。
2)一向等电聚焦；
取步骤1)所得的含150μg蛋白质的蛋白提取液，上样体积460μL，即用水化液对上述已定量好的蛋白样品稀释至460μL，得样品液。将样品液加入等电聚焦盘中，再将pH4-7，24cm的IPG胶条胶面向下放入盘中，除去胶面与样品间气泡，加入6ml矿物油，覆盖胶条，进行一向等电聚焦。设定参数如下：
上述水化液的配方为：在1ml的蛋白质裂解液中加入0.01g的二硫苏糖醇(DTT)和10μL的IPG Buffer(pH4-7)；
3)、二向SDS-PAGE电泳；
①胶条平衡：将步骤2)所得的聚焦好后的胶条加入平衡液I，平衡15min，倒净平衡液I后加入平衡液II，避光平衡15min。
备注说明：平衡液I、平衡液II的用量只需确保将胶条覆盖即可，第一处平衡不需要避光；
平衡液配制如下：
平衡缓冲液母液：6M尿素，2％(w/v)十二烷基磺酸钠(SDS)，50mM pH8.8的Tris-HCl，30％(v/v)甘油，0.002％(w/v)溴酚蓝；
即，平衡缓冲液母液为：在500ml的Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L，pH8.8)中加入3mol的尿素、10g十二烷基磺酸钠(SDS)、150ml的甘油、0.01g的溴酚蓝；
平衡液I：在平衡缓冲液母液加入100mM二硫苏糖醇(DTT)；
平衡液II：在平衡缓冲液母液加入250mM的碘乙酰胺；
②SDS-PAGE电泳：将步骤①所得的平衡好的胶条置于12.5％的SDS-PAGE凝胶上，确保胶条与凝胶紧贴，无气泡产。
12.5％的SDS-PAGE凝胶为：在180ml的超纯水中加入220ml的30％(w/v)丙烯酰胺储液、125ml的Tris-Hcl缓冲液(1.5mol/L，pH8.8)、5.3ml的10％(w/v)十二烷基磺酸钠(SDS)水溶液、2.1mL的10％(w/v)过硫酸铵水溶液、138μL的N,N,N',N'-四甲基乙二胺。
上述30％(w/v)丙烯酰胺储液为：在1000ml水中加入290g丙烯酰胺和10g N,N'-甲叉双丙烯酰胺。
上述10％(w/v)十二烷基磺酸钠(SDS)水溶液为：在1000ml水中加入100g十二烷基磺酸钠。
上述10％(w/v)过硫酸铵水溶液为：在1000ml中加入100g过硫酸铵。
然后，用琼脂糖封胶液封胶，再加入电泳缓冲液进行二向电泳，设定参数如下：
先用2w/胶，1h；再用17w/胶直至溴酚蓝跑出胶面。
备注说明：
琼脂糖封胶液为：在100ml水中加入0.8g低熔点琼脂糖、0.002g溴酚蓝。
电泳缓冲液为：在1L水中加入1g十二烷基磺酸钠(SDS)、0.192mol的甘氨酸、25mmol的Tris-base。
4)、染色及图像分析；
将步骤3)所得的胶片进行银染或考马斯亮蓝显色后通过UMAX公司的PowerLook2100XL-USB扫描分析仪获取图像，用PD-Quest软件对图像进行处理，从而得金枪鱼双向电泳凝胶图谱。如图1所示。
根据图1，我们能得出以下结论：
针对大目金枪鱼鱼肉蛋白质，利用本发明方法能得到蛋白质点较多，重复性好，背景清晰，无横纵条纹现象的双向电泳图谱。
实施例2、
以金枪鱼品种长鳍金枪鱼替代实施例1中的大目金枪鱼，其余等同于实施例1进行检测。
最终所得的图谱如图2所示。根据图2，我们能得出以下结论：
针对长鳍金枪鱼鱼肉蛋白质，利用本发明得到的双向电泳图谱，图谱清楚，蛋白点数目多，背景清晰，无横纵条纹现象。
实施例3、
以金枪鱼品种黄鳍金枪鱼替代实施例1中的大目金枪鱼，其余等同于实施例1进行检测。
最终所得的图谱如图3所示。根据图3，我们能得出以下结论：
针对黄鳍金枪鱼鱼肉蛋白质，利用本发明同样可以得到稳定且高质量的双向电泳图谱。
采用本技术方案对三种金枪鱼进行的实验均取得了成功且重复性好，结果可靠，证明此方法适用于各种金枪鱼的双向电泳凝胶技术，为进一步对金枪鱼蛋白组学和分子生物学的研究奠定基础。
对比例1、将实施例1步骤1)蛋白质提取改成上述背景技术告知的提取步骤：
即，取消步骤1)中的步骤④～⑤；直接以步骤③所得的上清液Ⅰ作为蛋白提取液；
其余等通于实施例1。
最终所得的图谱如图4所示。根据图4，我们得知：采用现有的蛋白质提取方法对金枪鱼鱼肉进行双向电泳，由于金枪鱼鱼肉中脂肪、核酸、盐分等因素影响，导致其图谱横竖条纹多，背景不清晰，且有多数蛋白点未分离。
对比例2、将实施例1步骤1)步骤③中的蛋白质裂解液配方改成成如下配方
蛋白质裂解液：7M尿素、2M硫脲、4％(w/v)3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)，其余同实施例1。
最终所得的图谱如图5所示。根据图5，我们得知：采用现有的裂解液得到的金枪鱼鱼肉电泳蛋白质图谱，由于鱼肉蛋白质点被降解，导致蛋白点数明显减少。
需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (4)
1.金枪鱼鱼肉双向电泳蛋白质图谱的获取方法，其特征是依次进行以下步骤：
1)、金枪鱼鱼肉蛋白质提取及纯化，包括以下步骤：
①、取干冰运输的金枪鱼鱼肉，置于-70～-90℃保存；
②、称取步骤①所得的0.1g鱼肉作为样品放入液氮预冷后的研钵中，加液氮研磨成粉末状；
③、在步骤②所得的粉末中加入750～850μL蛋白质裂解液，充分溶解粉末后离心，收集上清液Ⅰ；
④、对步骤③所得的上清液Ⅰ进行超声处理，从而破碎核酸；离心，收集上清液Ⅱ，在上清液Ⅱ中加入3.5～4.5体积倍的丙酮后，于-18～-22℃沉淀10～14小时；然后离心，对去除上清液后的沉淀物干燥，得纯化的蛋白质团块；
⑤、在步骤④所得的蛋白质团块中加入500～700μL蛋白质裂解液，超声助溶直至蛋白质团块溶解，离心，得蛋白提取液；
2)、一向等电聚焦；
取步骤1)所得的蛋白提取液，按上样量150μg用水化液稀释至460μL的上样体积，得样品液；
将样品液加入等电聚焦盘中，再将pH4-7、24cm的IPG胶条胶面向下放入盘中，除去胶面与样品液之间的气泡，加入6ml矿物油，覆盖胶条，进行一向等电聚焦；
设定参数如下：
上述水化液的配方为：在1ml的蛋白质裂解液中加入0.01g的二硫苏糖醇和10μL pH4-7的IPG Buffer；
所述蛋白质裂解液为：在每10ml水中加入70mmol的尿素、20mmol的硫脲、0.4g的3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、0.01mmol的苯甲基磺酰氟；
3)、二向SDS-PAGE电泳，包括以下步骤：
①胶条平衡：向步骤2)所得的聚焦好后的胶条加入平衡液I，平衡12～17min，倒净平衡液I后加入平衡液II，避光平衡12～17min；
平衡缓冲液母液为：在500ml 0.05mol/L、pH8.8的Tris-HCl缓冲液中加入3mol的尿素、10g十二烷基磺酸钠、150ml的甘油、0.01g的溴酚蓝；
平衡液I：在平衡缓冲液母液加入100mM的二硫苏糖醇；
平衡液II：在平衡缓冲液母液加入250mM的碘乙酰胺；
②SDS-PAGE电泳：将步骤①所得的平衡好的胶条置于12.5％的SDS-PAGE凝胶上，用琼脂糖封顶液封胶，加入电泳缓冲液进行二向电泳，设定参数如下：
先用2w/胶，1h；再用17w/胶直至溴酚蓝跑出胶面；
4)、染色及图像分析。
2.根据权利要求1所述的金枪鱼鱼肉双向电泳蛋白质图谱的获取方法，其特征是：
所述步骤4)为：
将步骤3)所得的胶片进行银染或考马斯亮蓝显色后通过UMAX公司的PowerLook2100XL-USB扫描分析仪获取图像，采用PD-Quest软件进行处理从而得金枪鱼双向电泳凝胶图谱。
3.根据权利要求2所述的金枪鱼鱼肉双向电泳蛋白质图谱的获取方法，其特征是：
所述步骤3)的步骤②中：
12.5％的SDS-PAGE凝胶为：在180ml的超纯水中加入220ml的30％丙烯酰胺储液、125ml1.5mol/L、pH8.8的Tris-HCl缓冲液、5.3ml的10％十二烷基磺酸钠水溶液、2.1mL的10％过硫酸铵水溶液、138μL的N,N,N',N'-四甲基乙二胺；
上述30％丙烯酰胺储液为：在1000ml水中加入290g丙烯酰胺和10g N,N'-甲叉双丙烯酰胺。
4.根据权利要求3所述的金枪鱼鱼肉双向电泳蛋白质图谱的获取方法，其特征是：
所述步骤3)的步骤②中：
琼脂糖封顶液为：在每100ml水中加入0.8g低熔点琼脂糖、0.002g溴酚蓝；
电泳缓冲液为：在1L水中加入1g SDS、0.192mol的甘氨酸、25mmol的Tris-base。
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