CN102433388B

CN102433388B - 一种肝癌早期诊断试剂盒

Info

Publication number: CN102433388B
Application number: CN 201210000735
Authority: CN
Inventors: 李三强; 冯书营; 席守民; 冯艳铭; 马灵筠; 杨五彪; 蒙宏叶; 李世朋
Original assignee: Henan University of Science and Technology
Current assignee: Henan University of Science and Technology
Priority date: 2012-01-04
Filing date: 2012-01-04
Publication date: 2013-03-20
Anticipated expiration: 2032-01-04
Also published as: CN102433388A

Abstract

一种肝癌早期诊断试剂盒，该试剂盒中包括RNA提取试剂、RT-PCR反应试剂、ADAM7核心基因引物、beta-actin核心基因引物和阴性质控标准品，通过半定量RT-PCR方法从基因水平上检测早期肝癌患者血清中高表达且不易被降解的金属蛋白酶ADAM7进行早期肝癌的诊断，通过GelPro4.0软件对结果进行分析，检测结果准确可靠。该试剂盒特异性和灵敏度高，简单容易操作，可重复性高，检测成本低，便于大规模推广应用。

Description

一种肝癌早期诊断试剂盒

技术领域

本发明涉及生物制剂技术领域，具体说是一种肝癌早期诊断试剂盒。

背景技术

肝癌是目前最常见的恶性肿瘤之一，为当今世界第三位致死性肿瘤，占我国肿瘤死亡原因的第二位，全世界约有100万患者，每年约有30万新增病例。在新增的病例中，45%发生在中国，主要分布在东南及沿海流域。肝癌的发生是多因素、多途径、多步骤长期作用的结果，包括外环境致癌因素(病毒、寄生虫、细菌的感染、黄曲霉毒素的摄入、水源污染以及吸烟、饮酒)和自身遗传因素(癌基因的激活和抑癌基因的失活)。在众多病因中，乙型肝炎病毒( HBV)、丙型肝炎病毒( HCV )和黄曲霉素诱导的癌基因激活和抑癌基因失活是引起肝细胞癌变的主要原因。根据流行病学调查，我国目前约有9300万HBV 携带者，其中患者98万余人，约有4000万HCV感染者，其中患者7万余人。而且近年来，随着乙型肝炎病毒的流行，我国肝癌的地域分布及发病趋势发生明显变化，其发病年龄高峰移向青壮年，死亡率也向小年龄组推移。这一基本现状是造成我国肝癌发生率在今后一个较长的时期内仍处于较高水平的重要原因。诸多研究结果表明，早期发现是提高肝癌治疗效果、降低病死率的有效手段。国际上对肝癌主要应用甲胎蛋白(AFP)、超声和其他影像学相结合的诊断技术进行筛查，但是超声检查依赖于操作者的经验和设备，而其他影像学手段需要高昂的费用，广泛应用受到限制。目前市场上用的肝癌诊断试剂盒存在以下缺点：1. 对早期肝癌的检出率不高，极大限制了现有肝癌治疗手段的疗效；2. 操作手段繁琐，检测时必须加入标准抗原作为参照，检测的成本较高；

解整合素-金属蛋白酶(a disintegrin and metalloproteases, ADAMs) 是一类Ⅰ型跨膜分泌型糖蛋白家族，也称金属蛋白酶解聚素或MDC (metalloprotease/disintegrin/cysteinerich)，ADAM基因编码的蛋白质通常由800-1200个氨基酸组成，包含有8个结构域，自N-端至C-端依次为：信号域、前导域、类金属蛋白酶功能域、解整合素样功能域、富含半胱氨酸功能域、类表皮生长因子功能域、跨膜域和胞质尾域。ADAMs家族的作用广泛，涉及膜组织融和、细胞因子和生长因子的解离脱落、细胞迁移的控制，以及一些诸如受精，肌肉发育，神经系统细胞的生长发育过程的调控等；ADAMs在调节细胞-细胞和细胞-基质的相互作用中至关重要。近年来研究发现该家族成员在炎症反应、肿瘤发生发展转移、免疫性疾病和过敏反应疾病中有着重要作用。迄今为止，文献报道的ADAMs家族成员共有30余种。ADAM7是ADAMs家族的成员之一，其编码的蛋白ADAM7是具有824个氨基酸的膜蛋白，具有金属蛋白酶活性，参与一系列与膜结合的受体、细胞因子等蛋白的水解过程。ADAM7和其他去整合素金属蛋白酶家族成员虽然来源不同，但是基本结构均由高度保守的序列组成，含8个结构域。

RT-PCR是研究检测特定基因表达的一个简便、准确的方法。通过RT-PCR在mRNA水平上检测某个基因的表达情况，可以提高检测的准确率。

发明内容

本发明针对现有技术存在的缺点和不足，提供一种肝癌早期诊断试剂盒。本发明试剂盒是一种体外诊断试剂，通过检测早期肝癌患者血清中金属蛋白酶ADAM7核心基因的相对表达量诊断早期肝癌，适用于一般PCR仪，操作简单，特异性和敏感性好，市场前景广阔。

一种肝癌早期诊断试剂盒，采用以下技术方案：

一、肝癌早期诊断试剂盒的组成：

该试剂盒有RNA提取试剂，RT-PCR反应试剂，ADAM7核心基因引物和beta-actin核心基因引物，阴性质控标准品组成；以下以一个可以检测20位病人的试剂盒为例说明本发明试剂盒各组份及其用量：

1、RNA提取试剂：Trizol：10ml；氯仿：10ml；异丙醇：10ml；75％乙醇：40ml；无RNA酶的无菌水：2ml；

2、RT-PCR反应试剂：50μmol/L随机六聚体引物：20μl；10 mmol/L dNTP 混合物：20μl；40 U/μl RNA酶抑制因子：10μl；200 U/μl AMV反转录酶:20μl ；5倍反转录酶反应缓冲液：1ml；10倍PCR缓冲液：1ml；25 mmol/L MgCl₂ : 1ml; 5U/μl Taq酶 :10μl;

3、10μmol/L ADAM7基因上游引物：100μl；10μmol/LADAM7基因下游引物：100μl；10μmol/Lbeta-actin基因上游引物：100μl；10μmol/L beta-actin基因下游引物：100μl；

ADAM7核心基因引物序列为：

上游引物:5’-CTGATACAGAAGCGAGAT-3’

下游引物5’-GAATAATTGGCACCATAC-3’

beta-actin核心基因引物序列为：

上游引物：5’-GTGGACATCCGCAAAGAC-3’

下游引物: 5’- AAAGGGTGTAACGCAACTAA-3’

4、阴性质控标准品: 正常人血清: 2ml；

二、本试剂盒的检测方法：

1、RNA提取：分别提取待检测病人血清RNA和阴性质控标准品（正常人血清）RNA，提取方法如下：

把0.1ml待测血清或正常对照血清加入装有0.5mlTrizol的1.5ml离心管中立即振荡搅拌，室温静置5min，于4℃，12000 g，离心10 min。小心吸取上清液转入新的1.5 ml 离心管，向匀浆液中加入0.5ml氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管，在15-30℃放置3 min。于4℃，12000 g，离心15 min。从离心机中小心地取出离心管，吸取上清至另一1.5 ml 离心管。向上清加入0.5ml异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，在15-30℃放置10 min。于4℃，12000 g，离心10 min。弃去上清，缓慢地沿管壁加入75％乙醇1 ml，轻轻颠倒洗涤离心管管壁，小心弃去乙醇。再加入75％乙醇1ml，在涡旋器上短暂涡旋；于4℃，8000g 离心10 min。小心弃上清，短暂离心，用移液枪吸去所有上清，在超净工作台中干燥沉淀5 min。加入无RNA酶的无菌水50μl完全溶解RNA 沉淀后，-80℃保存，备用；

2、取待病人血清RNA和正常人血清RNA分别进行RT-PCR反应：

1）RT反应：

a、在PCR管a中配制下列混合液:

50μmol/L随机六聚体引物 l μl

10 mmol/L dNTP 混合物 1 μl

待测血清 RNA 3 μl

无RNA酶的无菌水 5μl

总体积 10μl

在PCR仪上进行65℃ 5 min变性、退火反应，冰上急冷,得到反应液；

b、在上述PCR管a中加入反转录反应液:

5倍反转录酶反应缓冲液 4 μl

40 U/μl RNA酶抑制因子 0.5 μl

200 U/μl AMV反转录酶 1 μl

无RNA酶的无菌水 4.5 μl

总体积 20 μl

在PCR仪上30℃，10 min；42℃，30 min；95℃ 5 min进行反转录反应后，然后置于冰上，得到cDNA模板溶液;

2）PCR反应：

在PCR管b中配置下列PCR 反应液：

10倍PCR缓冲液 2.5 μl

25 mmol/L MgCl₂ 1.5 μl

10 mmol/L dNTP混合物 0.5 μl

cDNA 模板 1 μl

10 μmol/L ADAM7核心基因上游引物 0.75 μl

10 μmol/L ADAM7核心基因下游引物 0.75 μl

5U/μl Taq酶 0.15 μl

H₂O 17.85 μl

总体积 25 μl

在PCR管c中配置下列PCR 反应液:

10倍PCR缓冲液 2.5 μl

25 mmol/L MgCl₂ 1.5 μl

10 mmol/L dNTP混合物 0.5 μl

cDNA 模板 1 μl

10 μmol/L beta-actin 核心基因上游引物 0.75 μl

10 μmol/L beta-actin 核心基因下游引物 0.75 μl

5U/μl Taq酶 0.15 μl

H₂O 17.85 μl

总体积 25 μl

将上述PCR管b、c置于PCR仪中进行PCR扩增，条件为：94℃预变性3 min，然后进行94℃变性，1 min，55℃退火1.5 min，72℃延伸1 min，进行28个循环扩增；最后进行72℃，10 min终延伸，扩增出ADAM7核心基因片段(基因序列如序列表序列1)和beta-actin核心基因片段（基因序列如序列表序列2）；

3、检测结果分析：取RT-PCR反应产物5μl进行1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统照相，利用Gel Pro 4.0软件计算ADAM7核心基因和beta-atctin核心基因条带灰度值；被检测的ADAM7核心基因相对表达量=ADAM7核心基因条带灰度值/beta-actin核酸条带灰度值。待测血清样本中ADAM7核心基因相对表达量是阴性质控标准品的1.5倍以上定义为待测样本中ADAM7核心基因的相对表达量显著上调表达，可判断为待测病人患肝癌；

本试剂盒的检测依据及工作原理：

1、通过对30例肝癌组织及相应的癌旁组织和5例正常肝组织运用RT-PCR方法检测ADAM7 mRNA的表达水平，免疫组化法对ADAM8蛋白表达进行定位和半定量分析显示：ADAM7 mRNA在肝癌组织及癌旁组织中均有表达，癌组织明显高于癌旁，在正常组织中仅有少量表达；ADAM7蛋白高表达于肝癌组织，癌旁组织也有所表达，在正常组织仅有少量表达。且其表达与患者的年龄、性别无关，但在肿瘤大小超过3cm、细胞低分化、伴门静脉栓塞及有淋巴结转移的肝癌组织中表达明显升高；

2、通过在体外培养的人肝癌细胞株(HepG2)与正常肝细胞株(L02)中分别加入人ADAM7分子，来观察ADAM7分子对正常肝细胞和肝癌细胞增殖与凋亡的影响。结果表明，加入ADAM7分子后，促进了正常肝细胞的增殖，对肝癌细胞增殖几乎没什么影响；增加了肝癌细胞对TNF-α诱导凋亡的抵抗性，对TNF-α诱导正常肝细胞的凋亡无明显影响；

3、通过对肝癌患者和正常人血清ADAM7的表达水平的检测，发现ADAM7在肝癌患者的血清中显著上调表达，而在其它类型的癌症患者中，ADAM7表达无显著差异。而且半定量RT-PCR结果显示，肝癌患者肝组织中金属蛋白酶ADAM7基因的相对表达量(被检测的ADAM7基因相对表达量=ADAM7核酸条带灰度值/beta-actin核酸条带灰度值)是正常对照的1.5倍甚至两倍以上，证明ADAM7基因的相对表达量比正常增高1.5倍以上可以判断为肝癌；

4、通过实验证明ADAM7核心基因片段（序列表序列1）的相对表达量（ADAM7核心基因片段相对表达量= ADAM7核心基因条带灰度值/beta-actin核心基因条带灰度值)，是正常对照相对表达量的1.5倍以上也可以判断为肝癌，其中beta-actin核心基因序列如序列表序列2。通过Gel Pro 4.0软件分析ADAM7核心基因片段相对表达量，检测结果准确可靠。

本发明试剂盒和现有技术相比有以下优点：

1、半定量RT-PCR的检测方法从基因水平进行检测早期肝癌血清中高表达且不易被降解的金属蛋白酶ADAM7来提高早期肝癌的诊断效果结果更加准确可靠；

2、本发明的试剂盒适用于一般PCR仪，操作简便，可重复性高；

3、通过Gel Pro 4.0软件对结果进行分析快速准确，显著提高了方法的实用性和技术水准，便于大规模推广应用；

4、检测成本低，特异性和敏感性好；

附图说明：

图1为待测患者1、2、3、4、5和6试剂盒检测琼脂糖凝胶电泳图；

图2为待测患者1、2、3、4、5和6试剂盒检测结果分析图；

图3为待测患者7、8、9、10、11和12的试剂盒检测琼脂糖凝胶电泳图；

图4为待测患者7、8、9、10、11和12的试剂盒检测结果分析图；

图5为待测患者13、14、15、16、17、、18的试剂盒琼脂糖凝胶电泳图；

图6为待测患者13、14、15、16、17、、18试剂盒检测结果分析图；

图中标号：C为正常对照；DC：待测患者；* 和**分别代表与正常对照相比在(P<0.05)和(P<0.01)水平上有显著差异；

具体实施方式：

结合下列实施例进一步阐述本发明试剂盒的检测方法和检测效果。

本试剂盒中包括RNA提取试剂、RT-PCR反应试剂、ADAM7核心基因引物、beta-actin核心基因引物和阴性质控标准品；其中RNA提取试剂由分装的Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇和无RNA酶的无菌水组成；RT-PCR反应试剂由分装的随机六聚体引物、dNTP 混合物、 RNA酶抑制因子、 AMV反转录酶、5倍反转录酶反应缓冲液、10倍PCR缓冲液、 MgCl₂和Taq酶组成；

ADAM7核心基因引物序列为：

上游引物:5’-CTGATACAGAAGCGAGAT-3’

下游引物5’-GAATAATTGGCACCATAC-3’；

beta-actin核心基因引物序列为：

上游引物：5’-GTGGACATCCGCAAAGAC-3’

下游引物: 5’- AAAGGGTGTAACGCAACTAA-3’；

阴性质控标准品为正常人血清。

本发明试剂盒用于检测18名待测病人是否患肝癌：

1、RNA提取：分别提取18名待测病人血清RNA和阴性质控标准品（正常人血清）RNA，提取方法如下：

把0.1ml待测血清或正常对照血清加入装有0.5mlTrizol的1.5ml离心管中立即振荡搅拌，室温静置5min，于4℃，12000 g，离心10 min。小心吸取上清液转入新的1.5 ml 离心管，向匀浆液中加入0.5ml氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管，在15-30℃放置3 min。于4℃，12000 g，离心15 min。从离心机中小心地取出离心管，吸取上清至另一1.5 ml 离心管。向上清加入0.5ml异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，在15-30℃放置10 min。于4℃，12000 g，离心10 min。弃去上清，缓慢地沿管壁加入75％乙醇1 ml，轻轻颠倒洗涤离心管管壁，小心弃去乙醇。再加入75％乙醇1ml，在涡旋器上短暂涡旋；于4℃，8000g 离心10 min。小心弃上清，短暂离心，用移液枪吸去所有上清，在超净工作台中干燥沉淀5 min。加入无RNA酶的无菌水50μl完全溶解RNA 沉淀后，即得到RNA溶液，-80℃保存，备用；

2、取步棸1所提取的18名待测病人血清RNA和阴性质控标准品RNA分别进行 RT-PCR反应，操作方法如下：

1）RT反应：

a、在PCR管a中配制下列混合液:

50μmol/L 随机六聚体引物 l μl

10 mmol/LdNTP 混合物 1 μl

待测血清 RNA 3 μl

无RNA酶的无菌水 5μl

总体积 10μl

在PCR仪上进行65℃ 5 min变性、退火反应，然后置于冰上，得到反应液；

b、在上述PCR管a中加入反转录反应液:

5倍反转录酶反应缓冲液 4 μl

40 U/μl RNA酶抑制因子 0.5 μl

200 U/μl AMV反转录酶 1 μl

无RNA酶的无菌水 4.5 μl

总体积 20 μl

2）PCR反应：

在PCR管b中配置下列PCR 反应液：

10倍PCR缓冲液 2.5 μl

25 mmol/L MgCl₂ 1.5 μl

10 mmol/LdNTP 混合物 0.5 μl

cDNA 模板 1 μl

10 μmol/LADAM7核心基因上游引物 0.75 μl

10 μmol/L ADAM7核心基因下游引物 0.75 μl

5U/μl Taq酶 0.15 μl

H₂O 17.85 μl

总体积 25 μl

在PCR管c中配置下列PCR 反应液:

10倍PCR缓冲液 2.5 μl

25 mmol/L MgCl₂ 1.5 μl

10mmol/LdNTP混合物 0.5 μl

cDNA 模板 1 μl

10μmol/L beta-actin 核心基因上游引物 0.75 μl

10μmol/L beta-actin 核心基因下游引物 0.75 μl

Taq酶 (5U/μl) 0.15 μl

H₂O 17.85 μl

总体积 25 μl

将上述PCR管b、c置于PCR仪中进行PCR扩增，条件为：94℃预变性3 min，然后进行94℃变性，1 min，55℃退火1.5 min，72℃延伸1 min，进行28个循环扩增；最后进行72℃，10 min终延伸；扩增出的ADAM7核心基因(基因序列如序列表序列1)和beta-actin核心基因（基因序列如序列表序列2）；

3、检测结果分析：取RT-PCR反应产物5μl进行1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统照相，利用Gel Pro 4.0软件计算ADAM7核心基因和beta-atctin核心基因条带灰度值；被检测的ADAM7核心基因相对表达量=ADAM7核心基因条带灰度值/beta-actin核心基因灰度值。待测样本中ADAM7核心基因相对表达量比阴性质控标准品高于1.5倍的定义为待测样本中ADAM7核心基因的相对表达量显著上调表达，可判断为待测病人患肝癌；检测结果（如附图1-附图6）显示金属蛋白酶ADAM7在待测患者3、4、5、6、9、10、11、12、15、16、17、18的血清中的相对表达量是正常对照血清中ADAM7相对表达量的1.5倍以上，可以判断为肝癌。待测患者1、2、7、8、13、14血清中ADAM7的相对表达量与正常对照相比小于1.5倍，则不是肝癌患者。* 和**分别代表和正常对照相比在(P<0.05)和(P<0.01)水平上有显著差异；

4、利用CT和肝组织活检病理分析对18名待测患者进行肝癌诊断，诊断结果如表1，患者3、4、5、6、9、10、11、12、15、16、17和18诊断为肝癌，患者1、2、7、8、13和14诊断为不是肝癌患者。此结果和试剂盒检测结果完全一致，说明本试剂盒检测结果准确。

表1、CT和肝组织活检病理分析对18名待测患者肝癌诊断结果

患者1

患者2

患者3

患者4

患者5

患者6

患者7

患者8

患者9

患者10

患者11

患者12

患者13

患者14

患者15

患者16

患者17

患者18

肝癌诊断结果

阴性

阳性

阴性

阳性

阴性

阳性

阴性：诊断不是肝癌患者；阳性：诊断为肝癌患者。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南科技大学

<120> 一种肝癌早期诊断试剂盒

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 398

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

ctgatacaga agcgagatac tggacacacc catgatgatg acatactgaa aacgtatgaa 60

gaagaattgt tgtatgaaat aaaactaaat agaaaaacct tagtccttca tcttctaaga 120

tccagggagt tcctaggctc aaattacagt gaaacattct actccatgaa aggagaagcg 180

ttcaccaggc atcctcagat catggatcat tgtttttacc aaggatccat agtacacgaa 240

tatgattcag ctgccagtat cagtacgtgt aatggtctaa ggggattctt cagaataaac 300

gaccaaagat acctcattga accagtgaaa tactcagatg agggagaaca tttggtgttc 360

aaatataacc tgagggtgcc gtatggtgcc aattattc 398

<210> 2

<211> 302

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

gtggacatcc gcaaagacct gtacgccaac acagtgctgt ctggcggcac caccatgtac 60

cctggcattg ccgacaggat gcagaaggag atcactgccc tggcacccag cacaatgaag 120

atcaagatca ttgctcctcc tgagcgcaag tactccgtgt ggatcggcgg ctccatcctg 180

gcctcgctgt ccaccttcca gcagatgtgg atcagcaagc aggagtatga cgagtccggc 240

ccctccatcg tccaccgcaa atgcttctag gcggactatg acttagttgc gttacaccct 300

tt 302

Claims

1.一种肝癌早期诊断试剂盒，其特征在于：试剂盒中由RNA提取试剂、RT-PCR反应试剂、ADAM7核心基因引物、beta-actin核心基因引物和阴性质控标准品组成；

其中RNA提取试剂由分装的Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇和无RNA酶的无菌水组成；RT-PCR反应试剂由分装的随机六聚体引物、dNTP 混合物、 RNA酶抑制因子、 AMV反转录酶、5倍反转录酶反应缓冲液、10倍PCR缓冲液、 MgCl₂和Taq酶组成；

ADAM7核心基因引物序列为：

上游引物：5’-CTGATACAGAAGCGAGAT-3’

下游引物：5’-GAATAATTGGCACCATAC-3’；

beta-actin核心基因引物序列为：

上游引物：5’-GTGGACATCCGCAAAGAC-3’

下游引物：5’- AAAGGGTGTAACGCAACTAA-3’；

阴性质控标准品为正常人血清。