CN102433306A - 一种来源于人肺多形性癌的细胞株及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种来源于人肺多形性癌的细胞株，所述细胞株命名为人肺癌细胞株L1022，保藏号为CCTCC NO：C201032。同时，本发明还公开了所述细胞株的制备方法。

Description

一种来源于人肺多形性癌的细胞株及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种人肺癌细胞株及其制备方法，尤其是一种来源于人肺多形性癌的细胞株及其制备方法。

背景技术

肿瘤是严重危害人类健康的主要疾病之一，世界卫生组织发表的一项研究报告表明，全球癌症状况将日益严重，因此，深入研究肿瘤发生、发展和转移的分子机制，寻找更为有效的肿瘤治疗方案，成为当今医学研究的前沿课题。随着肿瘤生物学研究的不断深入，肿瘤的早期诊断及预防水平有了较大的提高，但是肿瘤治疗后的高转移及高复发仍是肿瘤临床治疗中一个亟待解决的难题。近年来，“肿瘤干细胞”学说的提出及其研究进展，从一个全新的角度去认识肿瘤。该学说认为，肿瘤中存在一部分独特的具有自我更新和分化功能的干细胞样亚群并将之称为肿瘤干细胞，这一亚群细胞正是肿瘤的起源细胞并维持肿瘤的生长。因此，肿瘤细胞株是研究细胞癌变机理、肿瘤转移、肿瘤放疗和化疗敏感性分子基础等生物医学问题的重要材料，建立和鉴定不同的肿瘤细胞株是一项很有意义的工作。

发明内容

本发明的目的是提供一种来源于人肺多形性癌的细胞株，所述细胞株具有典型的肿瘤细胞生物学特性；同时，还提供一种所述细胞株的制备方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种来源于人肺多形性癌的细胞株，命名为人肺癌细胞株L1022，保藏号为CCTCC NO：C201032。

所述细胞株在电镜下观察显示，癌细胞整齐排列成腔样结构，游离面绒毛长，舒展；细胞间连接丰富；核异型性高，怪异型核较多，核内异染色质少；线粒体、内质网与溶酶体数量众多，其他细胞器明显稀少。

所述细胞株在倒置显微镜下观察可见细胞体积大，核大，胞浆丰富，细胞间连接紧密，与平皿之间紧密贴附，不易消化分散。。

所述细胞株的体外倍增时间为55.335h。

所述细胞株的蛋白表达特征为vimentin、CK7和TTF-1均表达阳性，表皮生长因子受体EGFR的表达也呈阳性。

本发明所述人肺癌细胞株L1022，是一株EGFR阳性的中国南方人肺大细胞癌伴腺癌分化细胞系，来源于一位69岁男性肺癌病人的肺部癌组织。病人在接受手术前未接受任何化疗，放疗及靶向治疗等治疗。

来源于人肺多形性癌的细胞株L1022是发明人从病理类型为多形性癌的肺癌病人肺部肿块切除物中培养成功，经病理鉴定为肺多形性癌。为上皮细胞，具有典型的肿瘤细胞生物学特性。它能在体外连续长期传代，在体外培养一年，传100多代，细胞仍然生长增殖活跃。

本发明细胞系经检测，其一般生物学特性表明该细胞系为多边形上皮样细胞，含巨细胞和小多边形样细胞两种形态。部分贴壁生长，部分悬浮生长，贴壁生长和悬浮生长细胞两种状态可以相互转换。接触性生长抑制消失。

一种来源于人肺多形性癌的细胞株的制备方法，包括以下步骤：

(1)组织块机械解离：将切除的人肺多形性癌组织解离，清洗去除杂质，分离肺癌实质组织，去除正常肺泡及支气管组织和间质组织后，得到剩余的组织；

(2)胶原酶消化：将步骤(1)得到的剩余的组织切成组织片，清洗，然后向组织片加入胶原酶，孵育，过滤，然后收集肿瘤细胞，进行接种培养，得到存活细胞；

(3)对步骤(2)得到的存活细胞进行纯化，去除纤维细胞等杂质，纯化后的肺癌细胞连续培养并传代大于12个月，即得细胞株。

作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述制备方法包括以下步骤：

(1)组织块机械解离：将切除的人肺多形性癌组织解离，清洗去除粘液和红细胞等杂质，分离肺癌实质组织，去除正常肺泡及支气管组织和间质组织后，得到剩余的组织；

(2)胶原酶消化：将步骤(1)得到的剩余的组织切成1mm³的组织片，清洗组织片，让组织片沉淀，去除上清液，把剩余组织再细切，清洗组织碎片，然后向组织片加入胶原酶，在37℃下孵育4-18小时；过滤，然后收集肿瘤细胞，在含20％胎牛血清的高糖DMEM培养基中悬浮细胞，进行接种培养，得到存活细胞；

(3)对步骤(2)得到的存活细胞进行纯化，去除纤维细胞等杂质，纯化后的肺癌细胞在含20％胎牛血清的高糖DMEM培养基中连续培养并传代大于12个月，即得细胞株。

作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)为：将切除的人肺多形性癌组织解离成0.5cm³，用100％的青-链霉素双抗溶液浸泡移至生物安全柜，用消毒的PBS缓冲液反复清洗组织去除粘液和红细胞等杂质，再浸泡于培养基中移至解剖显微镜下，用两个10号注射器针头分离肺癌实质组织，并去除正常肺泡及支气管组织和间质组织后，得到剩余的组织。

作为本发明所述制备方法的优选实施方式，步骤(2)为：使用无菌的解剖刀和剪子把步骤(1)得到的剩余的组织切成1mm³的组织片，用PBS缓冲液清洗组织片，让组织片沉淀，去除上清液，用无菌解剖刀和剪子把剩余组织再细切，用PBS清洗组织碎片数次，然后加入胶原酶(50-200单位/ml，溶解在PBS中)，在37℃下孵育4-18小时，通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，然后收集肿瘤细胞，在含20％胎牛血清的高糖DMEM培养基中悬浮细胞，进行接种培养，得到存活细胞。更优选地，步骤(2)中，加入胶原酶的同时还加入有3mM的CaCl₂。加入CaCl₂可提高胶原酶对组织的解离效率。

作为本发明所述制备方法的优选实施方式，步骤(3)中纯化后的肺癌细胞的培养温度为37℃，气体环境为5％CO₂/95％空气，湿度为饱和湿度，每3天更换一次培养液，每5天传代一次。

附图说明

图1为本发明所述细胞株倒置光学相差显微镜下(400倍放大)生长活细胞像；

图2为本发明所述细胞株的电镜超微结构图；

图3为本发明所述细胞株的又一电镜超微结构图；

图4为本发明所述细胞株种植在NOD-SCID鼠肩胛部皮下移植瘤组织的形态图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述。

实施例1

本发明一种来源于人肺多形性癌的细胞株，按照以下制备方法所得：

(1)组织块机械解离：将手术切除的肺癌组织以消毒小剪刀迅速解离到0.5cm³大小，用100％青-链霉素双抗溶液浸泡移至生物安全柜，消毒PBS缓冲液反复清洗组织去除粘液和红细胞等杂质，再浸泡于培养基中移至解剖显微镜下，用两个10号注射器针头细心分离肺癌实质组织，尽量去除正常肺泡及支气管组织和间质组织后，得到剩余的组织；

(2)胶原酶消化：在解剖显微镜下去除肺癌标本中的间质组织后，使用无菌的解剖刀和剪子把步骤(1)所得的剩余的组织切成1mm³组织片，用PBS缓冲液清洗组织片。让组织片沉淀，去除上清液，用无菌解剖刀和剪子把剩余组织再细切，用PBS清洗组织碎片数次，然后加入胶原酶(50-200单位/ml，溶解在PBS中)，在37℃孵育4-18小时后。在胶乳胶原酶的同时可加入3mM CaCl₂，以提高胶原酶对组织的解离效率。通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片；对较大的组织碎片可以加入新鲜的胶原酶进行进一步的解离。消化完全后，收集肿瘤细胞，在含20％胎牛血清的高糖DMEM培养基中悬浮细胞，进行接种培养，得到存活细胞；

(3)对步骤(2)所得存活细胞进行纯化，去除纤维细胞等杂质细胞，纯化后的肺癌细胞在含20％胎牛血清的高糖DMEM培养基中培养，培养温度为37℃，气体环境为5％CO₂/95％空气，湿度为饱和湿度，每3天更换一次培养液，每5天传代一次，连续培养并传代超过12个月，得细胞株。

所述步骤(1)中的肺癌组织，来源于一位59岁女性肺癌病人的左下肺癌病灶。病人在接受手术前未接受任何化疗、放疗及靶向治疗等治疗，术中发现肺部肿瘤位于左下肺，质地脆软，大量坏死，局部侵润生长，壁胸膜广泛转移。

所述步骤(3)中得到的细胞株，于2010年4月1日送达中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：C201032，命名为人肺癌细胞株L1022。

实施例2

本发明所述人肺癌细胞株L1022的检测鉴定

1、G6PD同工酶检测物种来源(由中国典型制备物保藏中心检测)。

L1022是一株EGFR阳性的中国南方人肺大细胞癌伴腺癌分化细胞系，来源于一位69岁男性肺癌病人的肺部癌组织。病人在接受手术前未接受任何化疗，放疗及靶向治疗等治疗。

2、形态观察

主要观察细胞的一般形态，如大体形态、核浆比例、染色质和核仁大小、多少等，以及细胞骨架微丝微管的排列状态等。

2.1倒置光学显微镜观察

主要在正常生长状态下观察细胞的一般形态，如大体形态、核浆比例、粘附特性等。

倒置光学相差显微镜下观察本发明所述人肺癌细胞株L1022，可见细胞体积大，核大，胞浆丰富，细胞间连接紧密，与平皿之间紧密贴附，不易消化分散。如附图1所示。

2.2投射电镜观察

(1)从2.5％戊二醛固定液中取出样品，用0.2mol/L PBS(pH7.4)漂洗3次，每次15min；

(2)1％OsO₄后固定，室温1h；

(3)0.2mol/L PBS(pH7.4)漂洗3次，每次15min；

(4)50％、70％、90％及100％的丙酮逐级脱水，每梯度浓度15min；

(5)浸透：用丙酮∶树脂＝1∶1浸1h，然后用丙酮∶树脂＝1∶2浸2h最后纯树脂浸过夜；

(6)样品包埋后进行聚合，70℃，24h；

(7)超薄切片，厚度80nm；

(8)铅-铀染色后，上机观察。

电镜超微结构显示，本发明所述人肺癌细胞株L1022细胞整齐排列成腔样结构，游离面绒毛长，舒展；细胞间连接丰富；核异型性高，怪异型核较多，核内异染色质少；线粒体、内质网与溶酶体数量众多，其他细胞器明显稀少。如附图2、3所示。

2.3免疫组化检测细胞标记蛋白

采用S-P法进行免疫组化染色，免疫组化染色S-P试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。所用的抗体为：CK7、TTF-1、vimentin、EGFR、VEGF和NSE。

具体步骤为：

(1)待检测细胞株提前24小时爬片于消毒载玻片上，24小时后，用PBS缓冲液冲洗2次，冷丙酮固定15分钟，浸泡于PBS中备用；

(2)取所需玻片加1滴或50μl过氧化物酶阻断溶液(试剂A)室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性；PBS冲洗三次，每次3分钟；

(3)除去PBS液，每张切片加1滴或50μl正常非免疫动物血清(试剂B)，室温下孵育10分钟；

(4)除去血清，每张切片加1滴或50μl的第一抗体，室温下孵育60分钟；

(5)PBS冲洗三次，每次3-5分钟；除去PBS液，每张切片加一滴或50μl生物素标记的第二抗体(试剂C)，室温下孵育10分钟；PBS冲洗三次，每次3分钟；

(6)除去PBS液，每张切片加1滴或50μl链霉菌抗生物素过氧化酶溶液(试剂D)，室温下孵育10分钟；PBS冲洗三次，每次3分钟；

(7)除去PBS液，每张切片加2滴或100μl新鲜配制的DAB或AEC溶液，显微镜下观察3-10分钟；

(8)自来水冲洗，苏木素复染，PBS或自来水冲洗返蓝；

(9)DAB显色，切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。

免疫组化检测结果判断方法：按细胞着色评分：棕褐色3分；棕黄色2分；淡黄色1分；无着色0分。同样物镜下计数阳性细胞数，按阳性细胞的数量评分：一个视野内着色细胞＞70％为4分；51％-75％为3分；11％-50％为2分；1％-10％为1分；阴性为0分。两项得分相乘，满3分为“+”；4分为“++”；5分以上为“+++”。“+～+++”为阳性表达。

本发明所述人肺癌细胞株L1022的免疫组织化学染色显示，其与来源的转移灶肿瘤组织有着相似的蛋白表达，其突出的表达特征为vimentin，CK7和TTF-1均表达阳性，表皮生长因子受体EGFR的表达也呈阳性。

vimentin是波形蛋白，是一种间质细胞广泛表达的标记物，CK7和TTF-1则是上皮来源的肺腺癌最常表达的标记物，三者同时表达往往显示肿瘤开始出现了上皮间质样转化(EMT)的倾向，肿瘤细胞的转移能力提高。这从侧面提示，L1022是一株有着较高转移潜能的细胞系。

EGFR的表达往往与EGFR抑制剂的有效率有一定关系，L1022可以作为研究EGFR靶向药物的一个有用的工具细胞。

3、细胞生长增殖

检测细胞生长曲线、细胞分裂指数、倍增时间、细胞周期时间。

3.1MTT法测定细胞生长增殖和对药物的敏感性

(1)取96孔细胞制备板，每孔中加0.1ml含2×10⁴～10×10⁴靶细胞的制备液(含10％小牛血清的DMEM制备液)，在37℃5％CO2的饱和水汽二氧化碳制备箱中制备2-3小时，让细胞贴壁；

(2)用DMEM制备液0.1～100倍递次配置药物，每孔加0.1ml稀释的药物和待检细胞，每个稀释度3个重复孔。对照孔9个∶3个阳性对照孔，每孔加0.1ml含1000倍药物的DMEM制备液和细胞，3个阴性对照孔，每孔加不含药物的0.1ml DMEM制备液和细胞，3个空白对照孔，每孔加0.1ml DMEM制备液，不加细胞。在37℃5％CO₂的饱和水汽二氧化碳制备箱中制备24～48小时或预定的时间；

(3)吸去制备液，用PBS洗涤一次(如为悬浮细胞，应在吸去上清液前离心制备板)；

(4)每孔加0.1ml PBS和10μl MTT染液，在37℃5％CO₂的饱和水汽二氧化碳制备箱中制备4～6小时；

(5)每孔加0.1ml酸化异丙醇，也可用含10％SDS的10mmol/L HCl代替酸化异丙醇，在振荡器上振荡混匀，让还原产物充分溶解。置酶联检测仪上测定光密度(OD)值，检测波长570nm，参考波长630nm。以OD值对样品稀释度作图，比较标准曲线和待测样品曲线即可求得待测样品中细胞因子的含量。

3.2细胞流式细胞仪检测细胞周期与凋亡

流式细胞仪是美国BECKMAN-COULTER(贝克曼-库尔特)公司生产。机器型号：ELITE，激光波长488nm，功率15MW。取10⁶已固定的细胞，用PBS洗两遍，去上清后加入300μl DNA染液(内含碘化丙啶100μg/ml和RNase 20单位/ml)，室温30min。上机：激光管预热30min后用荧光微球(美国BECKMAN-COULTER公司)调整仪器，使各放大器接收的信号的HCV值＜2％，收集12000个细胞，DNA周期分析用美国PHEONIX公司的MULTYCYCLE软件，最后计算出细胞各期的百分数。另外，细胞凋亡是用仪器自带软件处理，直接得出细胞的凋亡率。

本发明所述人肺癌细胞株L1022的体外倍增时间为55.335h。

4、细胞核型分析

检测核型特点，染色体数量、标记染色体的有无、带型等。

4.1准备：秋水仙碱(秋水仙素)，生理盐水配制成10μg/ml浓度，15磅20分钟灭菌，分装，置-20℃；低渗液：0.35％KCl；固定液(Carnoy固定液)甲醇∶冰乙酸(3∶1)，临时配制；Giemsa工作液：1份原液和10份磷酸缓冲液，临时配制。

4.2秋水仙素处理：终止制备前2-4小时，在制备液中加入秋水仙碱(用1ml注射器5号针尖滴加2滴，使终浓度为0.07μg/ml)。

4.3染色体制备

(1)收集细胞：将制备物全部转入洁净离心管中，以1000rpm离心8-10分钟，弃上清液；

(2)低渗处理：向刻度离心管中加入预温37℃的低渗液8ml，用滴管混匀，置37℃恒温水浴中低渗15-25分钟；

(3)预固定：低渗后加入0.5ml固定液，轻轻混匀后1000rpm离心8-10分钟；

(4)一固定：弃上清液，加入5ml固定液，轻轻混匀，静置20分钟；1000rpm离心，弃上清液；

(5)二固定、三固定：同一固定；

(6)制悬液：弃上清液后，视细胞数量多少加入适量固定液制成细胞悬液；

(7)滴片：吸取细胞悬液自10-20cm高滴在一张干燥洁净的载玻片上，轻吹散，气干；

(8)染色：1：10Giemsa染色5-10分钟，细水洗去多余染液，气干；

(9)镜检：低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂相，油镜下观察染色体形态并计数。

5、异体动物接种

向异体动物体内接种细胞悬液，观察成瘤能力。采用皮下注射的方法，注射时用左手拇指及食指轻轻捏起皮肤，右手持注射器将针头刺入，固定后在小鼠背部或前肢腋下进行注射。

10⁶个本发明所述人肺癌细胞株L1022细胞种植在5只4周龄的NOD-SCID鼠肩胛部皮下，第5周种植部位均出现直径约2mm的移植瘤，2.5个月后，瘤体增大到1.2cm，麻醉后处死动物，移植瘤组织经包埋切片HE染色，形态如附图4所示，细胞体积巨大，与来源的病人组织相似。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (6)

1.一种来源于人肺多形性癌的细胞株，其特征在于，命名为人肺癌细胞株L1022，保藏号为CCTCC NO：C201032。

2.如权利要求1所述的来源于人肺多形性癌的细胞株，其特征在于，所述细胞株在电镜下观察显示，癌细胞整齐排列成腔样结构，游离面绒毛长，舒展；细胞间连接丰富；核异型性高，怪异型核较多，核内异染色质少；线粒体、内质网与溶酶体数量众多，其他细胞器明显稀少。

3.如权利要求1所述的来源于人肺多形性癌的细胞株，其特征在于，所述细胞株在倒置显微镜下观察可见细胞体积大，核大，胞浆丰富，细胞间连接紧密，与平皿之间紧密贴附，不易消化分散。

4.如权利要求1所述的来源于人肺多形性癌的细胞株，其特征在于，所述细胞株的体外倍增时间为55.335h。

5.如权利要求1所述的来源于人肺多形性癌的细胞株，其特征在于，所述细胞株的蛋白表达特征为vimentin、CK7和TTF-1均表达阳性，表皮生长因子受体EGFR的表达也呈阳性。

6.一种来源于人肺多形性癌的细胞株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)组织块机械解离：将切除的人肺多形性癌组织解离，清洗去除杂质，分离肺癌实质组织，去除正常肺泡及支气管组织和间质组织后，得到剩余的组织；

(2)胶原酶消化：将步骤(1)得到的剩余的组织切成组织片，清洗，然后向组织片加入胶原酶，孵育，过滤，然后收集肿瘤细胞，进行接种培养，得到存活细胞；

(3)对步骤(2)得到的存活细胞进行纯化，去除纤维细胞等杂质，纯化后的肺癌细胞连续培养并传代大于12个月，即得细胞株。 

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