CN102430163A

CN102430163A - 一种术中自体血液回收方法

Info

Publication number: CN102430163A
Application number: CN201110258399XA
Authority: CN
Inventors: 刘进; 杜磊; 丁五行
Original assignee: Saipuruite Blood Technology Beijing Co ltd; West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: Saipuruite Blood Technology Beijing Co ltd; West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2011-09-02
Filing date: 2011-09-02
Publication date: 2012-05-02

Abstract

本发明提供一种术中自体血液回收方法，采用血液回收机对术中自体血液进行回收，其中洗涤液采用MAP（甘露醇—腺嘌呤—磷酸盐）红细胞保存液，抗凝液由所述MAP红细胞保存液与肝素钠以1000ml:200-400mg的比例配制，血液回收机处理后的血液经孔径为11-20μm的7-40层叠压的醋酸酯无纺布滤膜过滤后存于血袋内。与现有的技术相比，本发明的术中自体血液回收方法，去除了包括肿瘤细胞在内的血液内有核细胞，最大限度的保护了红细胞数量和功能，保证了所回收血液的质量。

Description

一种术中自体血液回收方法

技术领域

本发明涉及一种血液回收方法，具体涉及一种术中自体血液回收方法。

背景技术

术中自体血液回收对很多人来说已不是一个新的名词，它主要通过负压吸引将自体血液与一定量的肝素混合吸入储血罐内，通过高速离心将红细胞离心浓缩于处理容器（离心杯）内，而较轻的物质（血浆、凝血因子、冲洗液、游离血红蛋白、细胞碎片）则从处理容器中溢出排入废液袋中。当处理容器中充满红细胞时，注入生理盐水清洗。细胞被生理盐水清洗处理，白细胞、血小板、游离血红蛋白等被反复稀释和排出，停止离心处理，洗涤后的红血球被泵入输血袋中即完成了自体血液的回收。上述整个过程可以通过血液回收机来实现，在手术中已被广泛应用。

术中自体血液回收具有显著的优越性，表现在：①为病人节约了开支，尤其是出血量较多需大量输血的病人；②为特殊血型的病人（如血型为Rh阴性的病人）解决了术中用血的后顾之忧；③大大减少了通过异体输血传播的各种传染性疾病的发生，如乙肝、艾滋病等；④大大减少了因异体输血所致的过敏反应的发生；⑤节约血源，减少血库面临的用血压力。

但术中自体血液回收也有它的禁忌证，因血液回收机不具备消毒和去除肿瘤细胞的功能，故开放性损伤及肿瘤病人的血液不能回收，以防止因败血症而导致的全身感染及肿瘤扩散。另外，经过生理盐水洗涤的红细胞数量和功能都有很大损伤。如何能够在术中自体血液回收中保证回收血液的安全性，并最大限度地保护所洗涤血液红细胞的数量和功能，以达到最佳的血液回收质量，一直是本领域的学者们不断探索的课题。

发明内容

有鉴于此，为了克服现有技术的不足，本发明提供一种术中自体血液回收方法，该方法能够保证所回收血液的安全性，并能最大限度地保护所洗涤血液红细胞的数量和功能。

本发明提供一种术中自体血液回收方法，采用血液回收机对术中自体血液进行回收，其中洗涤液采用MAP（甘露醇—腺嘌呤—磷酸盐）红细胞保存液，抗凝液由所述MAP红细胞保存液与肝素钠以1000ml:200-400mg的比例配制，血液回收机处理后的血液经孔径为11-20μm的7-40 层叠压的醋酸酯无纺布滤膜过滤后存于血袋内。

所述MAP（甘露醇—腺嘌呤—磷酸盐）红细胞保存液，其1000ml的主要组分为：枸橼酸钠（C₆H₅O₇Na₃·2H₂O）1.5g、枸橼酸（C₆H₈O₇·H₂O）0.2g、葡萄糖（C₆H₁₂O₆·H₂O）7.93g、磷酸二氢钠（NaH₂PO₄·2H₂O）0.94g、腺嘌呤（C₅H₅N₅）0.14g、氯化钠（NaCl）4.97g、甘露醇（C₆H₁₄O₆）14.57g。

进一步，所述滤膜为一次性使用，每12～200 cm²滤膜过滤血量50～1200ml。

进一步，所述7-40 层叠压滤膜形成的过滤器经并联后使用。

进一步，所述7-40层叠压滤膜形成的过滤器经串联后使用，串联个数为2-6个。

进一步，所述过滤中驱动血液通过滤膜的的正向压强差为37.0mmHg- 148.1mmHg。

本发明方法的有益效果在于：

1．能够去除血液内所有完整有核细胞，包括肿瘤细胞；

2．与现有的技术相比，最大限度地保护了红细胞数量和功能，保证了所回收血液的质量。

附图说明

图1：为血液回收机安装示意图；

图2A：为本发明术中自体血液回收方法中经醋酸酯无纺布滤膜过滤前的细胞HE染色图（采用MAP液洗涤）；

图2B：为本发明术中自体血液回收方法中经醋酸酯无纺布滤膜过滤后的细胞HE染色图（采用MAP液洗涤）；

图3：回收血液内CK19/CD133免疫荧光染色；

图4：技术处理前后回收血液内有核细胞培养后的荧光染色；

图5A：为采用MAP液洗涤后红细胞的形态；

图5B：为采用生理盐水洗涤液洗涤后红细胞的形态。

其中：1-废液袋，　2-离心杯，　3-抗凝剂袋，　4-储血罐，5-洗涤液袋，

6-血袋

，7-细胞过滤器，8-血袋。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述，优选实施例仅为了说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。

实施例1

本发明的一种实施方式，如图1所示，采用血液回收机对术中自体血液进行回收，其中洗涤液5采用MAP红细胞保存液，抗凝液3由MAP红细胞保存液与肝素钠按1000ml：300mg 的比例配制，血液回收机处理后的血液经叠压形成的16 层孔径为11μm醋酸酯无纺布滤膜过滤后存于血袋内。

实施例2

本发明的另一种实施方式，如图1所示，采用血液回收机对术中自体血液进行回收，其中洗涤液5采用MAP红细胞保存液，抗凝液3由MAP红细胞保存液与肝素钠按1000ml：200mg 的比例配制，血液回收机处理后的血液经孔径为20μm醋酸酯无纺布滤膜7 层过滤后存于血袋内。

实施例3

本发明提供的一种术中自体血液回收方法，如图1所示，采用血液回收机对术中自体血液进行回收，其中洗涤液5采用MAP红细胞保存液，抗凝液3由MAP红细胞保存液与肝素钠按1000ml：400mg 的比例配制，血液回收机处理后的血液经孔径为15μm醋酸酯无纺布滤膜28 层过滤后存于血袋内。

以下提供本发明技术效果的实验数据：

（1）最大限度减少有核细胞数量：通过采用本发明技术中的红细胞洗涤液，改变了有核细胞的粘附特性，使其与滤膜的粘附能力进一步增强，从而对有核细胞的去除能力大大增强

剩余细胞核数量比较

表1. 使用不同洗涤液洗涤红细胞，然后使用相同层数的醋酸酯无纺布滤膜过滤后

表1可见，如使用NS洗涤红细胞，再使用醋酸酯无纺布滤膜过滤处理，则仅能将有核细胞数量从10⁹/L降低至10⁷/L，而且通过醋酸酯无纺布滤膜过滤的红细胞内，随处可见完整的有核细胞（不能排除肿瘤细胞的可能性）；当将洗涤液变成MAP红细胞保存液后，再使用醋酸酯无纺布滤膜过滤处理，则能将有核细胞数量从10⁹/L降低至10⁵/L，而且通过醋酸酯无纺布滤膜过滤的红细胞液内，仅见裸露细胞核（见下，仅剩细胞核的不完整细胞不能存活）。

根据有核细胞的形态结构，本研究中发明人将仅存在细胞核（蓝色）的细胞定义为“裸核”，同时存在细胞核和细胞浆（红色）的细胞定义为“完整细胞”。为观察通过醋酸酯无纺布滤膜过滤的有核细胞的形态，发明人取20 ml经醋酸酯无纺布滤膜过滤处理后的回收血液（n=10），经溶血、浓缩、涂厚片、HE染色后发现，90%均为裸核（图2B），“完整细胞”仅为通过滤器的细胞核的10.9%（5%-16%，表2），而在处理前的血标本内，97%的细胞均是“完整”细胞（图2A）。这一结果提示当将洗涤液变成MAP红细胞保存液后，再使用醋酸酯无纺布滤膜过滤处理，能够明显破坏有核细胞。因此，上述洗涤液变成MAP红细胞保存液后对实际有核细胞清除率至少为5个log。

（2）进一步，采用本发明技术，可完全清除回收血液中肿瘤细胞和肿瘤干细胞

采用荧光染色的方法寻找回收血液内的肿瘤细胞。如图3所示，在使用上述技术处理前，20例肝癌患者的回收血液内均能找到大量CK19+（肿瘤细胞）和CK19+/CD133+细胞（肿瘤干细胞），干细胞约占肿瘤细胞总数的50%，远高于肿瘤组织内干细胞/肿瘤细胞的比例，提示肿瘤干细胞更容易脱落。然而，使用本发明技术处理后，20例患者血液内未见有核细胞，更未见肿瘤细胞和肿瘤干细胞。

（3）进一步，采用本发明技术，能够完全清除回收血液内的活性肿瘤细胞

为避免肿瘤细胞的漏检，使用细胞培养的方法检测本发明技术对剩余细胞活性和增殖能力的影响。分别将使用本发明技术处理前、后的血液进行细胞培养，染色鉴定细胞的性质。结果显示，处理前的8ml回收血液内，20例患者中17例（85%）培养出细胞克隆株，将克隆株使用CD133和CK19同时标记后发现，这些细胞均为双阳性细胞，提示这些细胞为肿瘤干细胞。因此，如直接输入这些未经本发明技术处理的回收血液可能造成医源性肿瘤转移。

经本发明技术处理后，将标本量扩大5倍，培养后观察，无一例出现细胞附壁生长，如图4所示，提示使用本发明技术处理后的回收血液内无增殖能力细胞，可以安全用于肿瘤患者术中的血液回收。

（４）采用本发明技术中的红细胞洗涤液，红细胞破坏减少

游离血红蛋白含量（mg/L）比较

MAP	NS	P=
			19±17	55±33	0.02

表2 使用不同洗涤液洗涤红细胞，使用相同层数的醋酸酯无纺布滤膜过滤后回收血液内

红细胞破坏后，血红蛋白从红细胞内释放进入血液，变成游离血红蛋白，因此游离血红蛋白成为红细胞破坏的一个重要指标。表2可见，如将洗涤液NS变为MAP液，则能够显著减少游离血红蛋白含量，即减少红细胞破坏。

（4）采用本发明技术中的红细胞洗涤液，红细胞能量代谢改善

	MAP	NS	P=
				ATP（10^-9ug/RBC）	43±17	20±18	0.005
ADP（10^-9ug/RBC）	16±5	15±5	0.818
				AMP（10^-9ug/RBC）	4±3	12±5	0.005
EC	0.81±0.07	0.56±0.10	0.001

表3使用不同洗涤液洗涤红细胞，用醋酸酯无纺布滤膜过滤处理，测定的红细胞内高能磷酸盐含量比较

EC(能荷) =（ATP+1/2ADP）/（ATP+ADP+AMP）

MAP液洗涤能显著提高红细胞内ATP含量。当细胞不能进行能量合成时，细胞内ATP会分解成ADP，ADP在分解成AMP。因此，当ATP下降，ADP，甚至AMP升高时，表示细胞能量缺乏，正在分解储存的高能磷酸盐，以提供能量。根据上述公式可以计算出红细胞能荷，当能荷下降时，表示细胞正在进行分解代谢；当EC提高时，细胞正在进行合成代谢。

表3可见，使用MAP液洗涤后，红细胞的ATP含量和EC显著高于NS洗涤液，而AMP则显著低于NS洗涤液，表明MAP液洗涤能显著改善红细胞的能量代谢。

（5）采用本发明技术中的红细胞洗涤液，红细胞形态能维持正常

图5可见，使用MAP液洗涤后，红细胞均匀的分散于溶液中，细胞形态能维持正常的双凹圆盘状，细胞保持完整，大小正常。然而，NS洗涤后，多个红细胞出现黏附，并堆积在一起，同时细胞膜出现破口（箭头所示）。提示MAP洗涤能够较好地维持红细胞形态和功能。

（6）采用本发明技术中的红细胞洗涤液，红细胞变形能力大大提高

生理情况下，红细胞必须变狭长，才能通过狭窄的毛细血管，称为红细胞的变形能力。如变形能力下降，意味着红细胞难以通过较为狭窄的毛细血管，甚至造成毛细血管阻塞。

为测定红细胞变形能力，给红细胞施加切应力（转速越快，切应力越大），导致红细胞拉长。

转/S	MAP	NS	P=
				30	0.148±0.016	0.160±0.023	0.143
100	0.234±0.038	0.198±0.048	0.001
				200	0.344±0.039	0.308±0.057	0.003
1000	0.608±0.044	0.581±0.058	0.044

表4 两种不同的洗涤液对红细胞变形指数的影响

变形指数=（L-W）/（L+W） L：红细胞变形时最长距离； W：红细胞变形时最短距离。

表4可见，使用MAP洗涤能显著改善红细胞的变形能力。

尽管通过参照本发明的某些优选实施例，已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims

1.一种术中自体血液回收方法，其特征在于，采用血液回收机对术中自体血液进行回收，其中洗涤液采用MAP红细胞保存液，抗凝液由所述MAP红细胞保存液与肝素钠以1000ml:200-400mg的比例配制，血液回收机处理后的血液经孔径为11-20μm的7-40 层叠压的醋酸酯无纺布滤膜过滤后存于血袋内。

2.按照权利要求1所述的术中自体血液回收方法，其特征在于，所述滤膜为一次性使用，每12～200 cm²滤膜过滤血量50～1200ml。

3.按照权利要求1所述的术中自体血液回收方法，其特征在于，所述7-40 层叠压滤膜形成的过滤器经并联后使用。

4.按照权利要求1所述的术中自体血液回收方法，其特征在于，所述7-40层叠压滤膜形成的过滤器经串联后使用，串联个数为2-6个。

5.按照权利要求1所述的术中自体血液回收方法，其特征在于，所述过滤中驱动血液通过滤膜的的正向压强差为37.0mmHg- 148.1mmHg。