CN102417909A - 玉米逆境诱导型启动子及活性分析 - Google Patents

Abstract

玉米逆境诱导型启动子及活性分析属生物工程技术领域，本发明提供获得的玉米逆境诱导型启动子序列包含相对于SEQ ID NO：1的转录起始位点的-1bp至-1299bp区的DNA核苷酸序列；提供用于玉米转化的逆境诱导型的植物表达载体包含玉米逆境诱导型启动子序列和玉米DRE结合蛋白基因的5’非翻译区；提供用植物表达载体转化的转基因植物包含玉米逆境诱导型启动子序列和玉米DRE结合蛋白基因的5’非翻译区；SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的PCR引物适于扩增包含SEQ ID NO：1的序列DNA片段；本发明可用于启动抗旱基因的高效表达，用于抗旱的转基因植物中，对于解决干旱地区粮食危机并提高其产量具有积极意义。

Description

玉米逆境诱导型启动子及活性分析

技术领域

本发明属生物工程技术领域，具体涉及一种来源于玉米干旱DRE-binding protein3基因并在植物中高度表达的干旱诱导型启动子序列，还涉及含有该启动子序列的植物干旱诱导型表达载体，以及应用该启动子生产转基因植物。

背景技术

逆境胁迫是目前农业生产中影响粮食产量最重要的因素和挑战之一。土壤退化、淡水匮乏、气候(象)多变等因素导致扣除零产出的荒芜、盐碱、滩涂地(15亿亩以上)外，每年直接由盐碱、干旱、低温等逆境胁迫造成的农作物减产仍超过总产的20％左右。在这些严重影响农作物生产的逆境因子中，干旱和盐胁迫是最主要的因素。据统计，全国每年有7亿亩农田受旱灾威胁，干旱所造成的损失几乎是其它自然灾害所造成损失的总和。特别是担负我国粮食生产任务65％以上的华北、东北和西北，恰恰是我国最缺水和最干旱的地区。

解决粮食生产中严重的多元逆境胁迫问题，提高其产量，除了常规育种技术以外，基于基因遗传转化的生物育种技术是一个重要的选择。通过转基因技术提高作物抗逆性是有效应对逆境挑战的根本途径，而分离、克隆抗逆关键基因是解决这一重要问题的核心与关键，克隆和组建逆境诱导型启动子是进行多抗基因转化实现分子育种目标的重要保障。目前，从实践上应用的启动子来看，仍以CaMV35S、玉米Ubiquitin promoter等组成型表达启动子为主，而且多为天然分离DNA片段的直接应用，无法实现高效、可控和特异(定点、定时、定量)的调控，而且由35S启动的基因过表达会使转基因植物表型产生一些负面效应，如矮化等。因此克隆并应用胁迫诱导型启动子来启动抗逆基因的表达，在提高植物的抗性方面具有重要作用。

目前，许多学者对逆境胁迫诱导型启动子进行了研究。如：rd29A启动子是缺水等逆境诱导启动子。Kasuga等用组成型的CaMV 35S启动子和rd29A启动子分别驱动DREB1A基因转化拟南芥(Kasuga M，Liu Q，Miura S，，1999)。CaMV 35S启动子驱动的DREB1A基因的过量表达激活了许多其他耐胁迫基因的表达，例如rd29A、Kin 1、Cor6.6等。转基因植株都比非转基因植株的抗旱、抗盐、抗冻能力显著提高。但是，过量表达DREB1A基因也导致了植株在正常生长条件下生长迟缓；与之相反，由胁迫诱导型启动子rd29A驱动的基因表达不仅使植株有更强的胁迫耐受力还对其生长有着最小的负面影响。OsABA2基因编码玉米黄质环氧化酶。OsABA2基因启动子含有一个MYBR元件和5个MYCR元件，表明它的表达与响应ABA诱导有关。Rai等用OsABA2基因启动子与GUS构建的表达载体转化玉米，实验表明在没有胁迫的条件下，由OsABA2基因启动子驱动的的转基因株系的GUS活性要比由Act1驱动的对照组低得多。缺水处理后，叶片中由OsABA2基因启动子驱动的GUS的表达量是无缺水处理对照组的5倍；而由Act1启动子驱动的对照组GUS的表达量没有任何增加(Rai M，He CK，2009)。cor15a基因启动子具有低温诱导表达的特性，朱青等从拟南芥Columbia生态型的基因组中扩增出cor15a基因的启动子片段，将其插入pBI121的GUS基因和NOS终止子上游构成表达载体pLB，获得转化株。GUS组织染色结果表明，经过低温处理的转基因马铃薯的叶片均表达了GUS产物，而没有经过低温处理的转基因马铃薯及非转基因植株则检测不到GUS活性(朱青，宋波涛等，2004)。Rrandl等分析了大豆Gmhsp17.32B热诱导启动子在转基因烟草中的调节作用，并在转基因植物的种子上测得GUS活性，发现该启动子具有一段热诱导因子(HSE)的同功序列。杜鹃等从小麦中克隆了mwcs120启动子，构建了诱导型瞬时表达质粒pmwGUS，用pmw-GUS转化玉米愈伤组织和烟草叶片证明，mwcs120启动子在单子叶和双子叶植物中均可受低温等逆境诱导，可以用于驱动结构基因的表达(杜娟，朱祯，李晚忱，2005)。Nazmul等分离了1.6kb的AmCMO基因上游启动子片段，5′端缺失分析发现，翻译起始点上游410bp片段中含有盐胁迫响应序列，300mmol/L NaCl处理24h后，GUS活性显著提高，AmCMO基因上游410bp片段可以作为盐诱导启动子(Nazmul HB，Akira H，Nana Y，2007)。

利用逆境诱导型启动子驱动抗逆基因在转基因植物中表达是培育抗逆作物新品种的有效方法。目前能应用于转基因研究的诱导型启动子仍然很少，对于新的抗逆相关启动子的发现、克隆、顺式作用元件分析以及与顺式元件相互作用的转录因子的研究仍然是今后研究的重点，将功能明确的抗逆启动子成功应用到转基因植物中调控抗逆基因的表达是植物抗逆基因工程的一个重要研究方向。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种干旱诱导型启动子序列，该启动子序列能够诱导目标基因高水平表达，而且该启动子来源于玉米DRE结合蛋白基因(Zm DBF3)。

本发明的第二个目的是提供一种用于植物转化的干旱诱导型启动子载体，该载体指导高水平表达目标基因Zm DBF3的干旱诱导型启动子序列和5’非翻译区。

本发明的第三个目的是提供一种所述载体转化的转基因植物。该转基因植物能反映启动子诱导活性的高低。

为实现上述目的，本发明克隆了玉米DRE结合蛋白基因(Zm DBF3)干旱诱导型启动子区，并构建了用于植物转化的载体，所述载体包含带有Zm DBF3基因的5’非翻译区的上述启动子。

本发明提供一种获得的玉米干旱诱导型启动子序列，包含相对于SEQ ID NO：1的转录起始位点的-1bp至-1299bp区(见序列表)的DNA核苷酸序列，干旱可以在植物中诱导本发明所述的启动子的高水平活性。

获得的玉米干旱诱导型启动子序列源自玉米DRE结合蛋白基因(Zm DBF3)。

一种克隆得到的玉米DRE结合蛋白基因(Zm DBF3)的5’非翻译区包含相对于SEQ IDNO：1的转录起始位点的+1bp至+148bp区(见序列表)的DNA核苷酸序列，本发明所述的非翻译区能通过增强导入植物中的目标外源基因的翻译效力，而诱导目标基因的高水平表达。

为实现另一个目的，本发明提供一种用于植物转化的干旱诱导型的植物表达载体，所述植物表达载体包含玉米干旱诱导型启动子序列和玉米DRE结合蛋白基因(Zm DBF3)的5’非翻译区。

上述用于植物转化的干旱诱导型载体是指能够在转基因植物中持久表达外源基因的二元载体。所述二元载体可以是任何包含T-DNA(转移DNA)的RB(右边界序列)和LB(左边界序列)，能够在根癌农杆菌(Agrobaterium tumefaciens)Ti质粒存在下转化植物的二元载体。该载体可以是经常用于相关领域的二元载体，例如pCAMBIA1301载体、pBI121载体。

一种用植物表达载体转化的转基因植物，包含玉米干旱诱导型启动子序列和玉米DRE结合蛋白基因(Zm DBF3)的5’非翻译区。

本发明提供SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的PCR引物，适于扩增包含SEQ ID NO：1的序列DNA片段。

关于本发明所述的用于植物的诱导型载体(pCAMBIA1301)，所述的玉米DRE结合蛋白基因(Zm DBF3)的启动子和5’非翻译区在植物表达载体中位于外源基因的前面。本发明提供通过插入本发明所述的玉米DRE结合蛋白基因(Zm DBF3)的启动子和5’非翻译区至含有GUS报告基因的载体中而构建的pCAMBIA1301。但是，所述GUS报告基因是外源基因，并预期可以用任意其它有用的外源基因来代替。

本发明提供一种应用干旱诱导型二元载体的转基因植物，以及一种应用本发明所述进行瞬时表达的玉米成熟胚。

植物能通过使用例如根癌农杆菌(An，G.1987，Plant Physiology)或粒子轰击方法(Lacorte等，1997，Plant Cell Reports)由上述植物干旱诱导型启动子二元载体进行转化。在本发明中，例如烟草可以用叶盘转化法进行转化。

本发明提供来自玉米DRE结合蛋白基因(Zm DBF3)的干旱诱导型启动子和5’非翻译区，根据本发明的启动子和5’非翻译区使得能够在植物中进行干旱诱导型表达。

本发明的有益效果在于可用于启动抗旱基因的高效表达，应用于抗旱的转基因植物中，对于解决干旱地区粮食危机并提高其产量具有积极意义。

附图说明

图1为玉米(B73)基因组电泳图

其中：1.2.3.代表目的条带扩增的模板B73玉米基因组DNA

图2为Zm DBF3pro PCR电泳图

其中：1.Zm DBF3pro M：Markerv

图3为pCAMBIA 1301::Zm DBF3 pro质粒酶切鉴定电泳图

其中：1.pCAMBIA 1301::ZmDBF3质粒酶切2.pCAMBIA 1301::ZmDBF3质粒M：Markerv

图4为pCAMBIA 1301::Zm DBF3pro植物表达载体构建示意图

图5为Zm DBF3pro启动子的GUS检测(用20％的PEG处理)照片

图6为Zm DBF3pro启动子的GUS检测(未处理)照片

图7为pCAMBIA 1301::Zm DBF3pro农杆菌侵染烟草筛选照片

图8为pCAMBIA 1301::Zm DBF3pro农杆菌侵染烟草筛选后生根照片

图9为转基因(Zm DBF3pro)侵染烟草根的GUS染色(未处理)照片

图10为转基因(Zm DBF3pro)侵染烟草根的GUS染色(用20％的PEG处理)照片

具体实施方式

下面结合附图介绍具体实施例：以下的实施将能够使本领域技术人员更清楚地理解如何实施本发明。尽管已经结合本发明优选的具体实施方式来对本发明进行了描述，但是以下描述的目的是示例性的，而不是限制本发明的范围。

实施例1：玉米DRE结合蛋白基因(Zm DBF3)的干旱诱导型启动子的克隆

玉米DRE结合蛋白基因(Zm DBF3)的启动子(启动子序列包含相对于SEQ ID NO：1的转录起始位点的-1bp至-1299bp区的DNA核苷酸序列)，在玉米DRE结合蛋白基因(ZmDBF3)的5’非翻译区序列中得到鉴定。

玉米DRE结合蛋白基因(Zm DBF3)登录在NCBI GenBank(登录号：NM_001112181.1)，序列表显示本发明上述基因的植物干旱诱导型启动子和5’非翻译区的DNA序列。在图1中，蛋白合成的起始密码子ATG带有下划线，而且转录起始位点的碱基A用+1示出。并用启动子分析网站分析了启动子的核心元件。启动子分析网站为http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/。以玉米基因组DNA(图1)为模板，扩增得到目的片段，经1％琼脂糖凝胶电泳分析，扩增出长度为1446bp的特异条带，并进行回收(图2)。电泳后回收目的片段，与pMD 18-T载体连接得到重组质粒pMD 18-T::Zm DBF3Pro，提取质粒并进行琼脂糖凝胶电泳检测，酶切验证，并测序。

更具体地说，通过PCR扩增克隆的DRE结合蛋白基因(Zm DBF3)的启动子和148bp的5’非翻译区(见序列表)，上述PCR所用引物详细显示在表1中。对于PCR扩增，反应程序：94℃4min；94℃50S，52℃50S，72℃2min，29个循环；72℃10min；

表1：引物

上游引物	5’ggaattcTGAGCCGGAC GGTCTGCTAT 3’	SEQ ID NO：2
			下游引物	5’tgccatggCTGCTGCTGTGACTGTGA 3’	SEQ ID NO：3

实施例2：植物干旱诱导型载体的构建

将在实施例1中所克隆的玉米DRE结合蛋白基因(Zm DBF3)的启动子和148bp的5’非翻译区Zm DBF3Pro(见序列表)插入到载体中，从而构建植物干旱诱导型载体。

更具体地说，将植物表达载体pCAMBIA1301及重组质粒pMD 18-T::Zm DBF3Pro用EcoRI和NcoI分别进行双酶切，然后将它们插入载体pCAMBIA1301的EcoRI和NcoI酶切位点。该载体被称作pCAMBIA 1301::Zm DBF3Pro，用于驱动GUS基因的表达，经酶切鉴定(图3)获得了启动子片段，与预期结果相同。

在图4中，以编码β-葡糖酸醛酶的基因GUS为报告基因，选择标记为潮霉素抗性基因。此外35s-pro代表HPTII的启动子，而35s-ter代表HPTII的终止子，Zm DBF3Pro代表GUS的启动子，而Nos-ter代表GUS的终止子。

实施例3：鉴定玉米干旱诱导型启动子的活性

通过热激转化法，将在实施例2中构建的载体pCAMBIA 1301::Zm DBF3Pro转移到根癌农杆菌EHA105中，提取质粒并进行酶切鉴定。

为鉴定启动子的干旱诱导活性，利用Jefferson等(EMBO J，1987)的方法对农杆菌侵染后的玉米的胚干旱处理再检测GUS的活性。

更具体地说，将玉米种子浸泡催芽，然后将种子纵切，切成两半，用20％PEG诱导培养24h，将玉米种子在GUS检测液中于37℃过夜，GUS检测液：3mg/ml X-gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸)、50mM磷酸钠缓冲溶液(PH＝7.0)，10mM EDTA，0.5mM铁氰化钾、0.5mM亚铁氰化钾、0.1％TritonX-100，20％甲醇。如图所示(图5，图6)，经过PEG诱导的胚根组织显示出高水平的GUS活性，而未经诱导的显示出很低的GUS活性。

实施例4：烟草的叶盘转化

4.1受体材料的准备

将烟草种子(NC89)用10％的次氯酸钠消毒，用无菌水冲洗三次，接种在MS培养基上，得到无菌烟草苗。待幼叶长至2～3cm时，将叶片取下用直径为7mm的打孔器制成叶盘，近轴面向下接种在分化培养基(MS+2.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA，PH＝5.8，0.8％琼脂)上，预培养2～3d。叶盘切口处刚刚开始膨大时即可进行侵染。

4.2农杆菌菌液的制备

将农杆菌EHA105接种于YEP(50mg/L rif、50mg/L kan)固体培养基上，28℃暗培养，至长出单菌落。挑取单菌落，接种在5mL含有相应抗生素的YEP液体培养基中，于28℃，200r/min振荡培养24～36小时，将菌液按1∶20的比例进行二次活化。当OD₆₀₀＝0.4～0.6时，吸取菌液置于无菌离心管中，5000rpm离心5min，弃上清，用等体积的MS液体培养基重悬，备用。

4.3侵染取预培养2～3d的外植体叶片于无菌三角瓶中，加入适量活化好的农杆菌菌液，侵染5～10min左右。

4.4共培养将侵染过的外植体接种在共培养培养基上，28℃暗培养2d。

4.5除菌及筛选培养将经过共培养的外植体用无菌水冲洗3～4次，然后用附加除菌剂的液体培养基振荡培养30min，用无菌滤纸吸干表面水分，再转移到附加选择压力的除菌筛选培养基上，28℃光照培养，每10d继代一次(图7)。

4.6继代筛选培养筛选培养2～3周后，外植体的转化细胞将分化出抗性芽，将抗性芽转入相应的筛选培养基中进行继代培养。

4.7生根培养待不定芽长到3～4cm时，将其切下并插入生根培养基上进行生根培养，两周左右长出不定根。(图8)

实施例5：转化烟草的组织化学法染色

将实施例4中的烟草根在含有20％PEG的MS培养基中诱导24h，浸入GUS检测液，于37℃保温过夜。GUS检测液：1mg/ml X-gluc、50mM磷酸钠缓冲溶液(PH＝7.0)，10mM EDTA，0.5mM铁氰化钾、0.5mM亚铁氰化钾、0.1％TritonX-100，20％甲醇。如图9、图10所示，经过PEG诱导的根显示出高水平的GUS活性，而未经诱导的没有检测到GUS活性。

工业实用性

如上所述，本发明提供玉米DRE结合蛋白基因(Zm DBF3)的干旱诱导型启动子和5’非翻译区。

本发明提供分别将启动子和5’非翻译区插入至pCAMBIA1301而制得的植物表达载体。

经使用所述的植物表达载体进行鉴定，本发明所述的玉米DRE结合蛋白基因(Zm DBF3)的启动子和5’非翻译区使得能够进行干旱诱导型的表达。因此，本发明可用于提高耐旱基因的启动活性，最终获得能用于生产的耐旱植物。

SEQ ID NO.1的序列(带功能元件标记)

(i)序列特征：(A)长度：-1bp 至-1299bp；+1bp 至+148bp；(B)类型：核苷酸；(C)链性：单链。

(ii)分子类型：核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.1

-1299   TGAGCCGGAC GGTCTGCTAT CTGAGCGTAG GAGTGACCCC TTCTCTGCGT ACGTCCATAC GATCCACGTC←A-box                    ABRE元件G-box

-1229   TGGTGTTTGG ATAGTTCGCG ATGGCGCAGA TAGTCGTCTT GTTCGCAGCA GATCTATATC TCGTCTTCCG

-1159   GGAGAGACCC CATAGGGGAG GAGAGAACCT AGGGTGTGTC TTCAGGTCGT TAGACCACCA AGACGTCTCT←TGA-element

-1089   AGTCGACGTA GAGCCGAAAA AAGTGAAGAT TCGAGGTAGA GGAAGGCTAA ACTAGAACTA CTCCTAATACLTR

-1019   ATAAGATAAA ATCATAACTA AAATTGTTTT AATCGATTGT GTGAGTTTAA TCGGTCGTAA CCCTTTATCT

-949    ATATAAAAGG AATGTCTAGA CCCGTTACAA ATCAGTTCTC GAGTAATCTG ATTGATTTAG CTAACAAATTATCT-motif

-879    CGACAATAAA TCCTGAATAC GTGGACGGAT CGTGCCGCTA AAGAGACAGT CCGGACTGCT TTTAGTTCTC←CAAT-box       ABRE             CCGTCC-box

-809    AACAAAAATT ACAAAACCAT  CACTCACTTA CTTCCCAGCT  GCCTAGGAGC CTAGGAGGCTAGGACCTAGG←ARE

-739    AGCTGGTGAG GCTATCCGCA ACCGTTCCCC CTAAATTTTT  CCCCCTATAT  CACTTTTTTGGGTCACATCA

-669    TCAACATTCC ACCCCCTATT TTTTCATCTC CCGCAGCGGT TCCCTCTAAA TACTCCCCCT ATATCCCACTSp1TATC-box

-599    ACACTATAAA ATATCATTTT TTATACATAC TTTTCATCTA TTATAAATTT TTTATCTACTAACAATTGGA←HSECAAT-box

-529    AGCGGGCCCA CGTGAACAGT GTTTAGAGGG GGGAGAGAGA TAACGCCAGA ACGAGGGGGAGAGAGAACGTABRE元件

-459    TACCTTTTCG TAGAGCGCTG GCTAGCGTCC ACCGCTGCGG CGTTGGGAGG CGCCCTGTAGCCGCCATGCG

-389    AGCTACAGGG CAAGGGGAGG GGGCGTCGCG CCGCGTCCGT TGCGGCCAGT  CTGACAGCACTTCCTGTCTT←CCAAT-box

-319    CCTCCACTTC ACTGCAGCTG CAGTGCACAC CACTCTGTCT  GTTTGTGAAG CAGCGAGCTGCACCTGCACA←GARE-motif

-249    GCATAAATTC TCCAGCCGGC CAGACCCCAC GCGGCCCCAG CATCAGATAA AAAAAGCGTCCCAGCAGCTG

-179    AAACATATTT TAAGTACCTG GGCTCCCAAA GAATCTACTG GCACCAGCTG TTTCCTTTGC CGCGGCCAGCE2Fb

-109    CGCCCAACCG  CCGGCCCGGC  GCCTTGTTCC  GTTGTTCGTC ACCACGGCTT  CTCCGCGTGTGAACTCCAAC←CCAAT-box    +1          CGTCA-motif

-39    GTCGCAGGGC ATACCTATAA ATACACCTCC CACAAAACCA CACGCTCCAC ACAGCTACCACTCAGCTCAA←TATAA-box                    ARE

+32    GCTCGAGACA AGAAACCAGA ACCAGCTCAC TCCTCACTCC ACTTCCACTC CCAACAGCAAGCT CAAGCAG←←5UTR Py-rich stretch    ARE

+102    TCAGTCACCG GCAGGGGTCA GGGTCACAGT CACAGCAGCA GCCATGG

Claims (6)

1.一种获得的玉米逆境诱导型启动子序列，其特征在于所述启动子序列包含相对于SEQID NO：1的转录起始位点的-1bp至-1299bp区的DNA核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的获得的玉米逆境诱导型启动子序列，其特征在于所述启动子序列源自玉米DRE结合蛋白基因Zm DBF3。

3.根据权利要求2所述的获得的玉米逆境诱导型启动子序列，其特征在于一种克隆得到的玉米DRE结合蛋白基因Zm DBF3的5’非翻译区包含相对于SEQ ID NO：1的转录起始位点的+1bp至+148bp区的DNA核苷酸序列。

4.一种用于玉米转化的逆境诱导型的植物表达载体，其特征在于所述植物表达载体包含权利要求1所述的玉米逆境诱导型启动子序列和权利要求3所述的玉米DRE结合蛋白基因ZmDBF3的5’非翻译区。

5.一种用植物表达载体转化的转基因植物，其特征在于所述转基因植物包含权利要求1所述的玉米逆境诱导型启动子序列和权利要求3所述的玉米DRE结合蛋白基因Zm DBF3的5’非翻译区。

6.SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的PCR引物，其特征在于所述引物适于扩增包含SEQ IDNO：1的序列DNA片段。

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