CN102416008A

CN102416008A - 一种可缓慢释放抗肿瘤适体药物的微囊及其制备工艺

Info

Publication number: CN102416008A
Application number: CN2011103753019A
Authority: CN
Inventors: 刁勇; 林俊生; 王立强
Original assignee: Huaqiao University
Current assignee: Huaqiao University
Priority date: 2011-11-22
Filing date: 2011-11-22
Publication date: 2012-04-18

Abstract

本发明公开了一种可缓慢释放抗肿瘤适体药物的微囊及其制备工艺，采用人血白蛋白包裹适体药物形成微囊，该微囊的粒径为150-350nm，在体内外缓慢释放内含的适体药物。本发明解决了适体药物的缓释问题，可以明显提高药物的体内活性。

Description

一种可缓慢释放抗肿瘤适体药物的微囊及其制备工艺

技术领域

本发明涉及一种可缓慢释放抗肿瘤适体药物的微囊及其制备工艺。

背景技术

肿瘤的生长发展可分为血管前期和血管化期。在肿瘤形成的早期-瘤体内并无血管生长，此为血管前期。这时-肿瘤生长依靠氧营养物质的弥散来维持-一般仅能长到2-3毫米。此期肿瘤细胞的增生和凋亡处于平衡状态。此时肿瘤生长缓慢，可持续多年，相当于临床上的原位癌，几乎不发生转移。肿瘤的进一步生长有赖于随后的血管新生表型启动，促使肿瘤形成新生血管-进入血管化期。此期肿瘤组织主要以血流灌注的方式获取营养，肿瘤细胞呈指数生长，且凋亡减少，导致肿瘤生长加速。新生血管也为肿瘤细胞侵袭转移提供了有利条件。

血管内皮生成因子(VEGF)是血小板源生长因子超家族中的一员，目前主要包括VEGF-A、胎盘生长因子、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和VEGF-E，VEGF-A是其中最重要的成员。VEGF通过其受体VEGFR介导下游信号的传导，促进血管内皮细胞增殖，分化成熟，抑制血管内皮细胞凋亡，诱导血管平滑肌细胞迁移，并促进血管平滑肌细胞合成和分泌基质金属蛋白酶，加速基质降解以及趋化炎症细胞等，最终促使新毛细血管生成和功能成熟。在组织缺氧的情况下，HIF-1a(缺氧诱导因子-1α)和MMP(基质金属蛋白酶)等细胞因子会促进VEGF的表达和分泌。VEGF不仅能诱导癌血管生成，促进癌生长，还可能参与癌细胞耐药性的形成。因此VEGF是抗癌药物最重要的靶点。

适体是功能相当于抗体的DNA或RNA片段，能够对靶分子进行特异性识别和结合，并有效抑制靶分子的生物学活性。适体的应用前景更为广泛。目前针对血液疾病、心血管疾病、神经系统疾病、血液系统疾病、肿瘤等疾病的诊断与治疗方面的适体研究已经在进行中，一些适体制剂已经进入临床试验，专门用于治疗黄斑变性的靶向作用于VEGF的适体药物(Macugen)已经上市。

适体是核酸分子，在体内极易被核酸酶降解而表现出极大的不稳定性，并且会通过肾脏迅速排出体外而来不及发挥其功能，严重限制了它在治疗领域的实际应用。

目前尚无理想的方法解决适体的体内稳定性问题。但研究表明这个问题可以通过对它进行适当修饰得以改善，修饰后的适体稳定性和抗降解能力增强，从而在血浆中稳定存在的时间也明显延长。这种修饰技术可分为两大类：分子内修饰和分子外修饰。分子内修饰是通过一些化学方法，将影响体内稳定性的基团，用另一些相应的基团取代。修饰的对象有糖环、碱基和磷酸，其中以糖环的修饰最为普遍。将氟、氨基和2’-氧-甲基基团引入戊糖糖环上的2′位，可以显著增加适体的抗核酸酶降解特性。此外，由于体液中的核酸酶只识别D型糖环而对L型糖环无作用，所以可通过将D型糖环修饰成L型糖环达到抗核酸酶降解的目的。除糖环修饰外，还可进行碱基和磷酸的修饰。分子内修饰虽可以提高适体在体内的稳定性，但在临床治疗方面还不能保证足够的药代动力学特征，因为适体在静脉注射后几分钟内就可能通过肾脏排泄而被清除。要解决该问题可将它与某些具有生物相容性，但没有生物活性的大分子连接，延长其在体内的作用时间，即分子外修饰。聚乙二醇(PEG)与适体共价结合，能防止其快速被血浆清除。Pegaptanib(Ng EWM，等。Nature Reviews Drug Discovery 2006，5：123-132)即采用了该技术。但如此修饰的核苷酸可以循环进入宿主的DNA，从而引发安全隐患。聚乙二醇偶联后，Pegaptanib体内半衰期提高至10小时左右，但如用于肿瘤治疗，仍然需要每天注射给药。

采用缓释制剂技术也应当是长期维持适体药物在体内有效浓度的方法之一，但对于适体药物，何种制剂最适合仍无明确方法和技术。本发明即为适体药物的缓慢释药提供了可行方法。微囊内包裹的活性成分，即可以靶向作用于VEGF的适体药物。该适体药物可以阻碍VEGF与受体的结合，从而抑制肿瘤的新生血管生成。经微囊包裹后，适体药物可以缓慢释放，在体内维持稳定的血药浓度，克服了常规制剂使用剂量大，作用时间短，需反复用药的缺点。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种可缓慢释放抗肿瘤适体药物的微囊及其制备工艺。本发明解决了适体药物的缓释问题，可以明显提高药物的体内活性。

为了达成上述目的，本发明的解决方案是：

一种可缓慢释放抗肿瘤适体药物的微囊，采用人血白蛋白包裹适体药物形成微囊，该微囊的粒径为150-350nm，在体内外缓慢释放内含的适体药物。

所述的适体药物为抗血管内皮生成因子165(VEGF165)的适体药物，具有抑制肿瘤新生血管生成的活性。

一种可缓慢释放抗肿瘤适体药物的微囊的制备工艺，包括如下步骤：将适体药物溶解于人血白蛋白水溶液中，以无水乙醇为凝聚剂使适体药物包裹于白蛋白内形成微囊，微囊表面经戊二醛交联使微囊固化，得到可缓慢释放抗肿瘤适体药物的微囊。

所述的制备步骤优选为：将所述的人血白蛋白溶于生理盐水，调节pH至7.8-8.2，加入适体药物使完全溶解；滴加无水乙醇至上述溶液，使微囊析出；微囊经戊二醛溶液固化，以生理盐水反复洗涤，超声震荡混匀，经0.45微米滤膜过滤，得到可缓慢释放抗肿瘤适体药物的微囊。

所述的人血白蛋白与适体药物的加入的重量比为1000-100000∶1，生理盐水与人血白蛋白之间加入的重量比为5-20∶1，无水乙醇与人血白蛋白之间加入的重量比为10-100∶1，戊二醛溶液的浓度为6％，戊二醛溶液与人血白蛋白之间加入的重量比为0.5-10∶1，pH为7.5-8.5。

所述的人血白蛋白与适体药物的加入的重量比优选为为10000∶1，生理盐水与人血白蛋白之间加入的重量比为20∶1，无水乙醇与人血白蛋白之间加入的重量比为20∶1，戊二醛溶液的浓度为6％，戊二醛溶液与人血白蛋白之间加入的重量比为1∶2，pH为7.8-8.2。

所述的可缓慢释放抗肿瘤适体药物的微囊用注射用水将其溶解成适体含量为10mg/ml的溶液，溶液中加入甘露醇至100mg/ml，无菌过滤，冷冻干燥即得可缓慢释放抗肿瘤适体药物的微囊的冻干粉针。

本发明的有益效果为：本发明筛选并优化了适体药物微囊的制剂工艺。该工艺解决了适体药物的缓释问题，可以缓慢释放适体药物，明显提高药物的体内活性，克服了常规制剂需要反复给药，病人依从性低的缺陷，体内药效也显著提高。

附图说明

图1是本发明的抗VEGF165适体药物结构及活性位点图；

图2是本发明的微囊的电镜照片；

图3是本发明实施例中微囊化适体药物体外释药曲线；

图4是本发明实施例中肺癌模型小鼠肿瘤生长曲线；给药组1为未微囊化适体药物组(每日给药)，给药组2为微囊化适体药物组(每3日给药1次)，给药组3为微囊化适体药物组(每日给药1次)。

具体实施方式

实施例1

适体微囊的制备

本实施例所使用的适体是具有抗VEGF165活性的适体，适体序列与Pegaptanib一致，由宝生物(大连)公司制备。

微囊的制备方法为：取100克人白蛋白(购于上海莱士血液制品股份有限公司)溶于2升生理盐水中，室温搅拌均匀。以NaOH调节pH至8.0后，加入10mg适体药物，使完全溶解。滴加无水乙醇至上述溶液中，总加入无水乙醇体积为2升。边滴加便搅拌，搅拌速度为1000rpm。无水乙醇添加完毕后继续搅拌1小时。静止，析出微囊。经离心收集微囊，加入50ml 6％的戊二醛溶液固化微囊0.5小时。离心收集微囊，以生理盐水洗涤，反复此过程3次。最后，以100ml生理盐水悬浮微囊，超声震荡半小时。经0.45微米滤膜过滤后备用。本实施例筛选并优化了适体药物微囊的制剂工艺。该工艺解决了适体药物的缓释问题，可以缓慢释放适体药物，明显提高药物的体内活性，克服了常规制剂需要反复给药，病人依从性低的缺陷，体内药效也显著提高。

实施例2

适体微囊的制备

取1克人白蛋白(购于上海莱士血液制品股份有限公司)溶于10毫升生理盐水中，室温搅拌均匀。以NaOH调节pH至8.0后，加入1mg适体药物，使完全溶解。滴加无水乙醇至上述溶液中，总加入无水乙醇体积为100毫升。边滴加便搅拌，搅拌速度为1000rpm。无水乙醇添加完毕后继续搅拌1小时。静止，析出微囊。经离心收集微囊，加入10ml 6％的戊二醛溶液固化微囊0.5小时。离心收集微囊，以生理盐水洗涤，反复此过程3次。最后，以10ml生理盐水悬浮微囊，超声震荡半小时。经0.45微米滤膜过滤后备用。本实施例工艺解决了适体药物的缓释问题，可以缓慢释放适体药物，明显提高药物的体内活性，克服了常规制剂需要反复给药，病人依从性低的缺陷，体内药效也显著提高。

实施例3

取1克人白蛋白(购于上海莱士血液制品股份有限公司)溶于5毫升生理盐水中，室温搅拌均匀。以NaOH调节pH至8.0后，加入0.01mg适体药物，使完全溶解。滴加无水乙醇至上述溶液中，总加入无水乙醇体积为10毫升。边滴加便搅拌，搅拌速度为1000rpm。无水乙醇添加完毕后继续搅拌1小时。静止，析出微囊。经离心收集微囊，加入5ml 6％的戊二醛溶液固化微囊0.5小时。离心收集微囊，以生理盐水洗涤，反复此过程3次。最后，以10ml生理盐水悬浮微囊，超声震荡半小时。经0.45微米滤膜过滤后备用。本实施例工艺解决了适体药物的缓释问题，可以缓慢释放适体药物，明显提高药物的体内活性，克服了常规制剂需要反复给药，病人依从性低的缺陷，体内药效也显著提高。

实施例4

适体微囊的检测

①取实施例1-3得到的微囊，电镜下检测，可见实施例1颗粒大小均匀(图2)。实施例2-3得到的微囊颗粒与实施例1类似。

②对实施例1得到的微囊的适体包裹率进行测定。按照公式：(适体初始量-上清内适体残余量)/适体初始量，计算包裹率。结果3批制剂的包裹率在51-59％之间。

实施例2得到的微囊适体包裹率为31％，实施例3得到的微囊适体包裹率为63％。

③对实施例1-3得到的微囊的粒径进行测定，结果粒径分布为150-350nm。

实施例5

取实施例1中制备的微囊，测定其体外释药曲线。释药介质采用生理盐水，测定时间为48小时，释药曲线见图3。

可见在2小时内累积释药率为30％，然后每6小时释药10％左右。最大释药率为90％左右。前2小时的30％表现为药物的突释现象，之后表现为零级释放，可维持2天左右。

实施例6

取实施例1得到的微囊，以注射用水溶解成适体含量为10mg/ml的溶液，溶液中加入甘露醇至100mg/ml，无菌过滤。按照常规冻干工艺冷冻干燥，得到冻干粉针。

实施例5

取6-7周龄裸鼠，体重(20±2)g，雌性。取对数生长期的A549细胞制备单细胞悬液，磷酸盐缓冲液调整细胞浓度为2.5×10⁷/mL。经台盼蓝染色测定细胞活性后，取200微升细胞悬液接种于裸鼠右背侧近腋部皮下。接种7天后，将小鼠随机分为4组。第一组为模型组，每日皮下注射生理盐水0.5ml/只。第2组为给药组1，每日皮下注射未微囊化适体药物，剂量为100微克/kg。第3组为给药组2，每3日皮下注射微囊化适体药物，剂量为100微克/kg。第4组为给药组3，每3日皮下注射微囊化适体药物，剂量为300微克/kg。

从抑瘤曲线(图4)可知，适体药物经微囊化后药效明显提高。微囊化适体药物每3日给药一次，总剂量降低为原1/3，其药效即相当于原型药物(未微囊化)。微囊化适体药物每3日给药，总剂量相同，其抑瘤效果则显著提高。

实施例7

微囊制备工艺参数的优化。

1)pH对粒径的影响

取1克人白蛋白溶于20毫升生理盐水中，室温搅拌均匀。以HCl或NaOH分别调节pH至6.0，7.0，8.0，9.0，加入0.1mg适体药物，使完全溶解。滴加无水乙醇至上述溶液中，总加入体积为40毫升。边滴加便搅拌，搅拌速度为1000rpm。无水乙醇添加完毕后继续搅拌1小时。静止，析出微囊。经离心收集微囊，加入0.5ml 5％的戊二醛溶液固化微囊0.5小时。离心收集微囊，以生理盐水洗涤，反复此过程3次。最后，以1ml生理盐水悬浮微囊，超声震荡半小时。经0.45微米滤膜过滤后，测定粒径，如表1所示，表1为不同pH条件下微囊粒径范围表。由表1可见，在碱性范围微囊粒径在纳米级。在pH值7.5和8.5范围内进行进一步优化，发现在7.8-8.2范围内，可以将粒径有效控制在400nm之内。

2)戊二醛用量

在对微囊进行固化处理时，分别选用戊二醛浓度为3％，6％，9％和12％。发现高浓度条件下固化迅速，但粒径偏大。低浓度固化不彻底，释药速度偏快。以6％的浓度进行固化，得到的微囊在粒径和释药速率方面均较理想。

3)适体用量

微囊制备方法除适体用量外，均与1)中方法相同。适体用量范围为0.01mg-1mg。结果发现，在0.1mg之下药物包裹率均在50％之上，但超过0.1mg后，包裹率则迅速降低。所以选用0.1mg。

表1

pH	6	7	8	9
					粒径范围(nm)	800-1000	2000-4000	150-350	200-450

Claims

1.一种可缓慢释放抗肿瘤适体药物的微囊，其特征在于：采用人血白蛋白包裹适体药物形成微囊，该微囊的粒径为150-350nm，在体内外缓慢释放内含的适体药物。

2.如权利要求1所示的一种可缓慢释放抗肿瘤适体药物的微囊，其特征在于：所述的适体药物为抗血管内皮生成因子165(VEGF165)的适体药物，具有抑制肿瘤新生血管生成的活性。

3.一种如权利要求1或2所述的可缓慢释放抗肿瘤适体药物的微囊的制备工艺，其特征在于包括如下步骤：将适体药物溶解于人血白蛋白水溶液中，以无水乙醇为凝聚剂使适体药物包裹于白蛋白内形成微囊，微囊表面经戊二醛交联使微囊固化，得到可缓慢释放抗肿瘤适体药物的微囊。

4.如权利要求3所述的一种可缓慢释放抗肿瘤适体药物的微囊的制备工艺，其特征在于所述的制备步骤为：将所述的人血白蛋白溶于生理盐水，调节pH至7.8-8.2，加入适体药物使完全溶解；滴加无水乙醇至上述溶液，使微囊析出；微囊经戊二醛溶液固化，以生理盐水反复洗涤，超声震荡混匀，经0.45微米滤膜过滤，得到可缓慢释放抗肿瘤适体药物的微囊。

5.如权利要求3或4所述的一种可缓慢释放抗肿瘤适体药物的微囊的制备工艺，其特征在于：所述的人血白蛋白与适体药物的加入的重量比为1000-100000∶1，生理盐水与人血白蛋白之间加入的重量比为5-20∶1，无水乙醇与人血白蛋白之间加入的重量比为10-100∶1，戊二醛溶液的浓度为6％，戊二醛溶液与人血白蛋白之间加入的重量比为0.5-10∶1，pH为7.5-8.5。

6.如权利要求5所述的一种可缓慢释放抗肿瘤适体药物的微囊的制备工艺，其特征在于：所述的人血白蛋白与适体药物的加入的重量比为10000∶1，生理盐水与人血白蛋白之间加入的重量比为20∶1，无水乙醇与人血白蛋白之间加入的重量比为20∶1，戊二醛溶液的浓度为6％，戊二醛溶液与人血白蛋白之间加入的重量比为1∶2，pH为7.8-8.2。

7.如权利要求3或4所述的一种可缓慢释放抗肿瘤适体药物的微囊的制备工艺，其特征在于：所述的可缓慢释放抗肿瘤适体药物的微囊用注射用水将其溶解成适体含量为10mg/ml的溶液，溶液中加入甘露醇至100mg/ml，无菌过滤，冷冻干燥即得可缓慢释放抗肿瘤适体药物的微囊的冻干粉针。