CN102414309A

CN102414309A - 用于监测细胞培养物的方法

Info

Publication number: CN102414309A
Application number: CN2010800190218A
Authority: CN
Inventors: C.高达; M.克拉帕
Original assignee: Bayer Healthcare LLC
Current assignee: Bayer Healthcare LLC
Priority date: 2009-03-10
Filing date: 2010-03-10
Publication date: 2012-04-11
Also published as: EP2406369A1; EP2406369A4; JP2016025860A; WO2010104963A1; US20120088679A1; CA2754708A1; JP2012520078A

Abstract

本发明涉及一种监测细胞培养物的生理学状态的方法。可以监测数项参数诸如细胞存活力、生长、代谢谱、和生产力来建立细胞培养物的代谢指纹或代谢组谱。

Description

用于监测细胞培养物的方法

本申请要求2009年3月10日提交的美国临时申请流水号61/158,954的权益，通过提及而将其内容完整收入本文。

发明领域

本发明涉及一种监测细胞培养物的生理学状态的方法。可以监测数项参数诸如细胞存活力、生长、代谢谱、和生产力来建立细胞培养物的代谢指纹或代谢谱。

发明背景

哺乳动物细胞培养物已经广泛用于生产治疗性蛋白质，其中复杂的翻译后修饰是必要的，以确保在患者中的功效。至今，大规模补料-分批培养仍然是治疗性蛋白质生产的主要模式(Chu等，Curr.Opin.Biotechnol.12：180-187，2001)。高密度灌注培养(Konstantinov等，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.101：75-98，2006；Konstantinov等，Biotechnol.Prog.12：100-109，1996；Trampler等，Biotechnology 12：281-284，1994)通常在不稳定性分子的情况中采用，对于所述不稳定性分子，期望在升高的生物反应器温度的最小停留时间(参见例如图1)。根据a)定量给料需求和定价压力、b)管理机构的严格蛋白质质量要求、和c)工业方法开发的进取时间线，用于治疗性蛋白质生产的最近的方法开发项目的主要目的是以高产物产率和一致的产物质量为特征的生物反应器方法的快速开发。另外，由于这些方法的制造成本较高，鉴定和使用用于细胞培养鲁棒性(robustness)的精确且灵敏的控制是期望的。这些控制可以在培养结束前提供蛋白质生产力和/或最终质量中的问题的早期警告。目前，生物反应器监测和方法改进两者都主要基于细胞生长、代谢活性、和蛋白质生存力数据。虽然有用，但是已经认识到此基于细胞比速率的办法的局限性，而且已经对细胞生理学状态的更鲁棒的表征提示了诸如准实时代谢流分析等方法(Goudar等，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.101：99-118，2006；Konstantinov，Biotechnol.Bioeng.52：271-289，1996)。

如此，明确需要开发和应用实现哺乳动物细胞培养物的生理学状态的全面表征的方法，改善用于监测过程一致性和鲁棒性的目前的常规测量组。此外，在连续过程的背景中利用容许具有多种细胞系和实验条件的实验的改进程序，这些方法可以产生较大的生理学数据集，其会增强对蛋白质生产和制造过程的总体了解。此类开发可以导致不仅是蛋白质生产力的，而且也是蛋白质质量的精确且灵敏的标志物的鉴定。随后，这些标志物可以在制造方法中使用以在培养结束前预测最终的蛋白质质量，同时它们还可以帮助改善蛋白质生产和制造方法以确保最终结果的批次间一致性。最后，这些生理学表征方法可以基于有成本效益的平台。

为了解决哺乳动物细胞培养物的生理学状态的表征，利用气相层析-质谱术(GC-MS)代谢组学来分析在高细胞密度灌注反应器中以实验室和制造规模两者培养的幼仓鼠肾(BHK)细胞。代谢组序型分析使细胞培养物的区别能够基于细胞龄、生物反应器规模和细胞来源实现，同时鉴定区别性代谢物提供的关于培养物的体内生理学状态的重要信息。因此，代谢组学是细胞培养工程中的一种有价值的分子分析工具。

附图简述

图1：细胞培养灌注系统的示意图。

图2：发酵方法的概述。连接小瓶和反应器的线标示实验室和制造规模生物反应器的接种源。

图3：反应器的活细胞密度随整个操作过程的时间谱。

图4：生物反应器的a)生物反应器存活力、b)细胞生长、c)比(specific)葡萄糖消耗率和d)比乳酸盐(lactate)生产率的时间谱。将反应器的培养过程分成10-天时间间隔，从达到稳态开始，并在时间间隔的中间时间点呈现每个时间间隔的平均值及相关的标准差。

图5：对实验室规模生物反应器的GC-MS极性代谢谱的5A.等级聚类(hierarchial clustering)(HCL)及5B.主成分分析(PCA)。这两项分析都基于该谱中的每种代谢物的标准化相对峰面积，如等式(1)中所限定的。皮尔森相关性(Pearson correlation)是HCL的距离度量。在图5A中，还描绘了3个鉴定的亚簇之每个中包括的谱的形心图。PC1、PC2、和PC3指分别由主成分1、2、和3携带的初始实验空间中的数据集的％变化。

图6：对制造规模生物反应器的GC-MS极性代谢谱的6A.等级聚类(HCL)及6B.主成分分析(PCA)。这两项分析都基于该谱中的每种代谢物的标准化相对峰面积，如等式(1)中所限定的。欧几里得(Euclidean)是HCL的距离度量。在图6A中，还描绘了2个鉴定的亚簇之每个中包括的谱的形心图。PC1、PC2、和PC3指分别由主成分1、2、和3携带的初始实验空间中的数据集的％变化。

图7：对制造规模生物反应器M1和M2及实验室规模生物反应器L2和L3的GC-MS极性代谢谱的7A.具有曼哈顿(Manhattan)距离度量的等级聚类(HCL)、7B.具有Kendal-Tau距离度量的等级聚类、7C.具有皮尔森相关性距离度量的等级聚类、和7D.主成分分析(PCA)。所有分析都基于该谱中的每种代谢物的标准化相对峰面积，如文本中的等式(1)中所限定的。如图5和图6的图例中所解释的那样使用所有描绘的符号。

图8：其浓度鉴定为在代谢网络的背景中对于反应器M1样品与122天相比在129天样品中显著升高的代谢物(为黑体框)。使用δ＝1.64和0％FDR(中值)的微阵列显著分析(SAM)来鉴定显著的代谢物。以空白框显示了如下的代谢物，其包括在标准化和过滤后的分析中，但是通过SAM不被鉴定为显著的。

发明详述

应当理解，本发明不限于所描述的具体的方法、方案、细胞系、动物物种或属、构建体、和试剂，并且因此可以有所变化。还应当理解，本文中所使用的术语是仅为了描述具体的实施方案，而并不意图限制本发明的范围，其仅会由所附权利要求书所限制。

必须注意，如本文中和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”、和“所述”包括复数提及物，除非上下文另有明确规定。如此，例如，提及“代谢物”指提及一种或多种代谢物(例如，1、2、5、10、50、100、或更多种)，而且包括本领域技术人员已知的其等同物，等等。

除非另有定义，本文中所使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然已经在本发明的实施或测试中使用了与本文中所描述的那些方法、装置、和材料相似或等同的任何方法、装置、和材料，但是现在描述优选的方法、装置和材料。

为了描述和公开例如在可以结合目前所描述的发明使用的出版物中所描述的构建体和方法，在此通过提及而将本文中所提及的所有出版物和专利收入本文。上文和整个文本中所讨论的出版物仅提供其在本申请提交日前的公开内容。凭借在先发明，本文的任何内容不应解释为承认本发明没有资格早于所述公开。

至今，细胞培养工程已经使用转录物组、蛋白质组、和代谢流分析，尝试解决关于细胞培养性能的重大问题。然而，明确需要开发和应用实现哺乳动物细胞培养物的生理学状态的全面表征的方法，改善用于监测过程一致性和鲁棒性的目前的常规测量组。

代谢组学的高通量分子分析平台可以满足此需要。代谢组学(指游离的小代谢物集合的(相对)浓度的同时量化)实现生物学系统的代谢指纹的监测(Fiehn等，Nat.Biotechnol.18：1157-1168，2000；Roessner等，Plant J.23：131-142，2000)。考虑代谢在总体细胞功能的背景中的作用，容易理解的是，为何量化完整且精确的代谢谱图在细胞培养工程研究中可以具有极大的意义。虽然代谢物浓度和代谢流并不是线性相关的，但是代谢序型分析是高通量的，而且如此可以容易地用于监测短暂的代谢条件。另外，不需要关于所调查的代谢网络的结构和调节的知识，在代谢流分析(MFA)的情况中通常就是这样。另外，MFA通常仅被应用于稳态或假稳态条件，而代谢组学可以在短暂的生理学条件，如转录物组学和蛋白质组学(即其它两种主要的组平台)下使用。还有，与转录物组学和蛋白质组学不同，代谢组学不需要特殊的分析设备。代谢组方法基于经典的分析化学技术，主要包括核磁共振(NMR)分光术和质谱术(MS)(例如，气相层析-质谱术和液相层析-质谱术)，而且是组学方法中最不昂贵的(Kanani等，J.Chromatogr B.Analyt.Technol.Biomed.Life Sci.871：191-201，2008)。特别地，对于细胞培养系统，代谢组学相对于其它组学技术的特殊优点在于其监测胞内代谢状态和胞外培养基组成两者的适用性。这提供了对代谢网络活性的更好的了解。最后，因为代谢在生物学系统间是充分保守的，所以比较代谢组研究更容易，而且不需要样品间复杂的标准化。

经由分子指纹法来监测体内代谢生理学容许测定通过常规测量不可直接观察到的样品间的微小差异。细胞生理学状态的表征增强通过可以改善目前使用的过程控制方法的代谢指纹法是有可能的。此外，多变量统计分析实现如下的代谢物鉴定，其浓度变化表征细胞培养生理学的差异。此信息可以帮助鉴定用于不一致的性能的早期警告标志物，而且还可以进一步帮助了解细胞生理学，最后导致过程优化。

代谢组指纹法可以是分子培养工程中的一种非常有用的分子分析工具。可以单独地或与评估细胞功能的其它水平的其它高通量分子分析技术整合地提供针对发酵方法优化和目前可用的测量组的增强的引导，所述测量组用于监测发酵活动的状态和质量一致性。

本发明涉及使用细胞培养物的GC-MS代谢组学来监测高密度灌注培养物中的哺乳动物细胞生物学。可以使用GC-MS代谢组学来分析实验室和制造规模两者的不同培养阶段的细胞生理学状态。

实施例

为了本发明可以得到更好的理解，列出了以下实施例。这些实施例仅为了例示，而不应以任何方式解释为限制本发明的范围。通过提及而将本文中所提及的所有出版物完整收入本文。

实施例1：细胞灌注培养

将BHK细胞以灌注模式(图1)培养，其中葡萄糖和谷氨酰胺作为主要碳源。分别使用幼仓鼠肾(BHK)细胞的四个独立小瓶(图2中的A-D)来接种四个实验室规模15L灌注系统L1-L4。L1和L4生物反应器是典型的圆柱形容器，而L2和L3是小底反应器。分别使用L2和L3来接种两个制造规模生物反应器M1和M2。所有实验室和制造规模灌注系统都具有相同的操作条件和所有监测变量的设定点。生物反应器运行的持续时间范围为113-155天，导致组合的总共826个生物反应器日。在每个反应器的最后40天操作期间，在不同时间点时收集样品，如表1中所显示的。从小瓶融化的日期测量细胞龄，并以每个反应器的开始日期与样品收集日期间的时间差异评估相同反应器中的培养时间。使用GC-MS代谢组学和多变量统计分析来分析来自这些样品的细胞沉淀物。

表1

将生物反应器温度维持于35.5℃，并以47RPM(对于制造规模生物反应器为15RPM)搅动。通过膜通风来将溶解氧(DO)浓度维持于50％空气饱和，并通过6％Na₂CO₃的自动添加来将pH维持于6.8。以约1×10⁶个细胞/mL的初始细胞密度接种生物反应器，并让细胞积累至稳态浓度20×10⁶个细胞/mL。通过自生物反应器的自动细胞流出来维持此目标稳态细胞密度。

每天从生物反应器收集样品以使用CEDEX系统(Innovatis，Bielefeld，Germany)来进行细胞密度和存活力分析。随后，将这些样品离心(BeckmanCoulter，Fullerton，CA)，并对上清液分析营养物和代谢物浓度。使用YSI型2700分析仪(Yellow Sprints Instruments，Yellow Springs，OH)来测定葡萄糖、乳酸盐、谷氨酰胺、和谷氨酸浓度，同时通过Ektachem DT60分析仪(EastmanKodak，Rochester，NY)来测量氨水。使用可缩回的电极(Metler-Toledo Inc.，Columbus，OH)来在线测量pH和DO，并经由Rapidlab 248血液气体分析仪(Bayer HealthCare，Tarrytown，NY)中的离线分析来证实其测量精确性。使用相同的仪器以还测量溶解的CO2浓度。用可缩回的光密度探针(AquasantMesstechnik，Bubendorf，Switzerland)来进行细胞密度的在线测量，用来自CEDEX系统的细胞密度测量校准。

实施例2：代谢组序型分析(profiling)

在冰上抽出来自生物反应器的样品，并使用预先冷却的转子来离心。离心后，弃去上清液，并用冷的PBS缓冲液清洗细胞沉淀物。然后，将细胞沉淀物在70℃水浴中放置15分钟。随后，将沉淀物在真空中于70℃干燥24小时。使用来自样品的干燥的细胞沉淀物来进行代谢组分析。

使用甲醇/水提取(Kanani等，2008；Roessner等，2000)来获得干燥的细胞沉淀物的极性代谢物提取物，其中核糖醇(0.1mg/g干细胞重量)和[U-13C]-葡萄糖(0.2mg/g干细胞重量)作为内部标准品。经由与150μl在嘧啶中的甲氧胺盐酸盐溶液(20mg/mL)的反应达90分钟，接着是于室温与300μl N-甲基-三甲基甲硅烷基-三氟乙酰胺(MSTFA)的反应持续至少6小时来将干燥的极性提取物衍生化成其(MeOx)TMS-衍生物(Kanani等，2008；Kanani等，Metab.Eng.，9：39-51，2007)。使用Saturn 2200T气相层析仪-(离子阱)质谱仪(Varian Inc.，CA)来获得代谢组谱。实施峰鉴定和量化，如记载于(Kanani等，2007)的。原始代谢组数据集由91个峰组成，每个峰在至少一个获得的代谢组谱中检测到，并且对应于已知化学种类的化合物(参见例如Kanani等，2008；Kanani等，2007)。

通过相对于核糖醇(标志物离子：217)，即内部标准品的标准化来评估所有检测到的峰的相对面积(RPA)。应用数据确认、标准化、和校正方法以解决衍生化偏爱，其主要是由于从含有胺基的代谢物形成多种衍生物所致(Kanani等，2008；Kanani等，2007)。在基于[U-13C]-葡萄糖的两个峰的比率获得样品所获得的代谢组谱过程中验证GC-MS运行条件。其次，使用基于95天L4样品的氨基酸衍生物的谱评估的权系数(参见表1)，将对应于相同的含有胺基的代谢物的衍生物峰面积组合成一个累积的(有效的)峰面积。将异亮氨酸、β-丙氨酸、和谷氨酸滤出进一步的分析，因为其可用的测量不容许评估所有正权系数。在随后的分析步骤中包括如下的氨基酸，对于该氨基酸，仅在特定的衍生化范围中观察到一种衍生物，但是对于该氨基酸，超过一种衍生物是已知的；更经常，它们在后来的步骤中滤出，这是由于注射间的高变化系数。此外，将(a)已知的含有酮基的代谢物的两个MeOx峰中最小的峰、(b)对应于未知的含有胺基的代谢物的峰、(c)鉴定为衍生物假象或具有显著遗留(carry over)的峰、和(d)没有一致性检测出的代谢物峰滤出分析。在TM4MeV(V4.0)数据分析软件(Saeed等，Biotechniques 34：374-378，2003)中以80％截留使用这些最终的代谢物RPA谱，其包含38种代谢物。使用k-最近邻算法(Troyanskaya等，Bioinformatics 17：520-525，2001)来输入任何缺少的RPA，如在TM4 MeV中执行的。

对获得的代谢谱应用的分析基于代谢物相对峰面积的标准化数值(参见下文等式1)。由于相同代谢谱中的代谢物间的相对峰面积水平的数量级的大方差，获得这些分析中的标准化相对峰面积的使用。代谢组谱j中的代谢物M的标准化相对峰面积，即RPAMj等于：

使用等级聚类(HCL)来使样品基于其代谢组谱聚类。在HCL中，在分层树中使代谢谱聚类。在树的最低水平，认为每个代谢谱是不同簇，虽然所有样品在最高水平在一个簇中分组。从最低水平开始，基于每轮算法的特定距离度量来评估每对可获得的簇的相关系数。将具有最高相关系数的簇分组成一个簇，供随后一轮算法用(Quackenbush，Nat.Genet.2：418-427，2001；Eisen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：14863-14868，1998)。必须在所研究的生物学问题的背景中解释所获得的分层树。例如，在图5A中，HCL鉴定出对应于相隔一个月的细胞龄的代谢谱的两个簇。在较低细胞龄的簇内，反应器L4的代谢谱分开其它三个实验室规模反应器的代谢谱。

使用主成分分析(PCA)来显现多个细胞培养物样品是否可以基于其代谢组谱来区分。PCA涉及数据矩阵的单数值分解，其指捕捉数据集中的最大值方差的在新坐标系统上的初始数据集的正交线性变换(Strang，Introduction toLinear Algebra，Wellesley-Cambridge Press，Wellesley，Massachusetts，1993)。此变换可以涉及初始实验空间的旋转和/或伸展。主成分1对应于初始数据集中最高的方差的方向，主成分2对应于第二高，等等。在高通量生物学数据分析中，已经出于坐标减缩目的而使用PCA，使得初始数据集中的大多数方差在3-D空间内显现(Raychaudhuri等，Pac.Symp.Biocomput.2000：455，466，2000)。少量的主成分经常足以解决数据中的大多数结构(Scholkopf等，Learning with Kernels-Support Vector Machines，Regularization，Optimizationand Beyond，The MIT Press，Cambridge，Massachusettes，2002)。在阅读PCA图时，重要的是，考虑初始数据集中的方差百分比，其在指定的空间内完全及通过每个所显示的主成分个别地捕捉。每个主成分的单元(权数)等于初始数据集中以其表示的方差百分比。如此，例如，在主成分1上具有距离x的两个数据点代表比在主成分2上具有相同距离的两个数据点更大的其生理学状态的差异。

与另一组相比其浓度在一组细胞培养物样品中显著更高或更低的代谢物分别称为特定比较的正或负显著性代谢物。使用不成对微阵列显著性分析(SAM)方法来鉴定一个比较中的显著代谢物(Tusher等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：5116-5121，2001)。

SAM(Tusher等，2001；Larsson等，BMC Bioinformatics 6：129，2005；Wu，Bioinformatics 21：1565-1571，2005)是基于排列的(非参数的)假设检验方法，其用于鉴定代表不同生理学状态的两个测量组间显著不同的分子数量。已经改编了SAM以分析基于DNA微阵列的转录序型分析数据，而且已经类似地用于分析其它组数据集(参见例如Dutta等，Biotechnol.Bioeng.102：264-279，2009)。在代谢组分析的情况中，SAM鉴定出如下的代谢物，其在两个样品间的浓度差异大于由于单独的随机变化会预期的差异：

|d_i-de_i|＞δ

其中d_i是观察到的差异，de_i是预期的差异，且δ是显著性阈值。与参数假设检验方法不同，基于排列的(非参数的)方法不要求数据遵循特定的分布。它们还提供错误发现率(FDR)的评估，所述错误发现率是鉴定为浓度差异变化的给定代谢物为假阳性的概率。另外，SAM容许δ调节，使得可以确定FDR和显著性代谢物的数目对阈值变化的灵敏性。

如TM4 MeV v4.0(Saeed等，2003)中所执行的那样使用算法。通过在适当地颜色编码的代谢网络中定位鉴定为显著性的代谢物来获得两个细胞培养物样品间的代谢谱差异的整体观点。代谢网络重建是基于来自KEGG(KEGG数据库，2008)和EXPASY(EXPASY数据库，2008)数据库的信息。

需要在灌注系统中注意控制以确保过程一致性的关键变量之一是活细胞密度。在灌注系统已经达到稳态条件后，它在整个培养过程中以靶标的设定点维持。稳态细胞密度与20×10⁶个细胞/mL的靶标设定点保持接近(表2，图3)。图3描绘了反应器的活细胞密度随其操作过程的时间谱，而在表2中显示了稳态平均值。显示了细胞生长、代谢活性、和生产力相关变量的稳态平均值。在圆括号中显示了变化系数。FVCD、sGCR、和sLPR分别是生物反应器活细胞密度、比葡萄糖消耗率、和比乳酸盐生成率。相对于L1反应器的平均值显示了所有反应器的平均比生产力。

已经显示了，细胞密度测量与约8.5％误差有关，这提示了观察到的均值数值左右的变化(即，变化系数(CoV)范围为4.4％-6.3％)是良好的细胞密度控制的非常小的反映。

表2

图4为此研究中的反应器提供了a)生物反应器存活力、b)细胞生长、c)比葡萄糖消化率、和d)比乳酸盐生成率的时间谱。将每个反应器的培养过程分成10-天时间间隔，从达到稳态的时间点开始。沿着的每个时间间隔的平均值及相关的标准差在时间间隔的中间时间点时呈现。已经将来自细胞龄20-30天的数据求平均值，并且显示为对应于细胞龄25天。对于存活力和生长速率，没有看到显著的时间相关变化。对于比葡萄糖消耗和乳酸盐生成率的时间谱，看到略微增加的趋势。基于在细胞培养工程中用于监测过程的测量组，由于每个反应器中的细胞龄而没有明显的生理学差异。还在平均比蛋白质生产力数据(表2)中观察到反应器间的一致性，其中反应器L1的生产力任意设置于1.0，并用于比较。比生产力范围0.92-1.04明确指明生物反应器间的一致性。另外，将来自生物反应器的早期、中间、晚期阶段的材料纯化，并测试典型的蛋白质质量属性。产物质量数据在规格内，这提示了生物反应器间及随培养过程的一致性。

图5A和图5B中显示了来自对实验室规模的生物反应器的分析的数据。在主成分2上看到清楚的基于细胞龄的区别(图5B)，其中120-123天样品的代谢谱在图的上部部分上出现，而那些148-150天样品的代谢品位于下部部分上。主要在主成分1上清楚区别自不同实验室规模反应器获得的相同细胞龄的代谢谱。因为主成分1携带初始数据集中最大比例的方差，所以此区别指明代谢谱可以辨别相同细胞库中的小瓶间变化性和/或不同生物反应器中的细胞培养物生长。这支持生物分子指纹法鉴定基于目前的监测工具箱观察不到的生理学的微小差异的能力。图5B的进一步检查指明分开L3和L4样品(在图的右侧)与两种所调查的细胞龄的L1和L2样品(在图的左侧)。

图5A中所显示的等级聚类(HCL)分析结果确认PCA图中的代谢谱间显现的差异。使用使代谢谱基于其形状聚类的皮尔森相关性距离度量，所获得的等级聚类树含有两个主要的分枝，其对应于两个不同细胞龄的代谢谱。两个代谢谱间的皮尔森相关系数r等于两个谱的协方差除以其标准差的乘积(Box等，1978)。它可采用-1和1之间的数值。协方差是两个谱间的线性关系的测量。如此，预期皮尔森相关性揭示了两个谱的形状间的相似性(Quackenbush，2001)。

在较低的细胞龄分枝(在树的左侧)内，鉴定出两个不同的亚簇；一个含有来自123天L4样品的3次注射的代谢谱，其中其它三个反应器样品的代谢谱在其它亚分枝中聚类。L4代谢谱数据点与实验空间中的剩余点离得更远，如从PCA图(图5B)所显示的。图5A(此形心谱自TM4 MeV软件产生；Saeed等，2003)中所显示的L4注射的均值代谢谱与相似细胞龄的反应器的剩余注射的均值代谢谱不同。

使用欧几里得(Euclidean)距离的HCL分析表明区别这两个细胞龄的L3和L4谱与L1和L2谱。欧几里得距离度量是欧几里得空间中两点间的典型(最直接的)距离，所述欧几里得空间以毕氏定理(Pythagorean theorem)限定。在M-维空间中，点x＝(x1，x2，...，xM)与y＝(y1，y2，..，yM)间的欧几里得距离定义为：

\sqrt{Σ_{i = 1}^{M} {(x_{i} - y_{i})}^{2}}

如此，在2-维空间中，由与原点相同的欧几里得距离的点围绕的区域是具有等于特定距离的半径的圆。

PCA和HCL分析两者都指明小瓶间的变化性和细胞龄比反应器几何学(标准的圆柱形的对小底结构)具有更高的对细胞培养物样品测量的极性代谢谱的影响。凭借在可用的实验室规模培养物样品中变化的所有这三项参数，反应器几何学对代谢生理学的影响在样品的聚类中并不是直接显而易见的。

图6A和图6B分别显示了对制造规模反应器样品的代谢谱的HCL和PCA分析的结果。在主成分1上看到基于细胞龄的样品分离(图6B)。此分离根据HCL分析也是显而易见的(图6A)，其中等级聚类树的两个主要分枝对应于两个细胞龄。图6A中所显示的两个细胞龄的均值代谢谱也支持此区别。

在122-129天和149-150天样品组内，HCL和PCA两者都指明清楚区别M1和M2样品。149-150天样品的M1和M2代谢谱间的差异比122-129天龄组中的对应差异大。在第一种情况中，在主成分1上分离样品(48％方差)，而在主成分2上分离第二组样品(16.5％方差)。

随后，将制造规模生物反应器的38个极性代谢物谱与它们接种来源的实验室规模生物反应器的谱组合分析。图7A-D显示了对此组样品的HCL和PCA分析的结果。基于任何距离度量的PCA和HCL分析将制造规模生物反应器M1和M2的122-129天龄样品的代谢谱鉴定为来自所有其它样品的不同簇。在任何HCL分析(图7A-C)中，这些样品形成树的两个主要分枝之一，而它们在PCA图的右侧也显示为分离的(图7D)。

可以基于细胞龄、反应器类型、和细胞来源来将图7中剩余的5个样品分类。两个样品(L2和L3)具有121-122天范围中的细胞龄，而L2、M1、和M2是149-150天样品。3个样品来自实验室规模生物反应器，而2个来自制造规模系统。样品对L2-M1和L3-M2来自相同细胞来源(分别为小瓶B和C)。在图7D中，这些样品基于反应器大小和细胞来源得到清楚的区别。基于反应器大小的区别在主成分2上，其中实验室规模反应器在正侧，而制造规模反应器在负侧。基于细胞来源的区别在主成分1上，其中L2和M1样品朝L3和M2样品的左侧聚类。

在使用欧几里得或曼哈顿距离度量时，基于细胞来源的聚类在HCL分析中也是明显的。在M-维空间中，点x＝(x1，x2，...，xM)与y＝(y1，y2，..，yM)间的曼哈顿距离定义为(x，y)线段投影到坐标轴上的长度的和：

Σ_{i = 1}^{M} | x_{i} - y_{i} |

在2-维空间中，由与原点相同的曼哈顿距离的点围绕的区域是具有与坐标轴以45°角定向的边的正方形。曼哈顿距离没有欧几里得距离对离群值灵敏(Filzmoser等，Comput.Stat.Data Anal.52：1694-1711，2008)。曼哈顿和欧几里得距离两者都测量可用数据向量(在此情况中为代谢谱)间的绝对差异。若在聚类分析中使用，预期这两种度量都揭示代谢谱的峰面积水平间的相似性。

在图7A中，将分层树的右侧分枝分成三个分枝，一个聚类M2和L3样品，另一个聚类150天L2和M1样品，而第三个聚类122天L2样品，这与PCA图(图7D)相似。使用Kendall氏Tau距离度量看到在HCL分析中就反应器大小而言的代谢谱聚类。此度量指代谢谱的分级向量。在代谢谱的分级向量中，每个相对峰面积用指明其在代谢谱中的所有相对峰面积间的分级的整数替换。在此情况中，基于两个整数在两个向量中为相反顺序的次数的数目来测量两个分级向量间的距离。若此数目等于0，则两个分级向量是相同的。

在图7B中，将分层树的右侧分枝分成对应于实验室规模和制造规模样品的两个亚分枝。最后，使用斯皮尔曼相关距离度量的HCL分析例示了基于细胞龄的样品聚类。此相关性指对代谢谱的分级向量应用斯皮尔曼相关距离度量。在图7C中，将分层树的右侧分枝分成两个亚分枝，一个含有121-122天L2和L3样品，而另一个含有149-150天L2、M1和M2样品。

使用微阵列显著性分析(SAM)来鉴定如下的代谢物，其浓度在129天M1样品中与122天样品相比显著升高(正显著的)或降低(负显著的)。尽管这些样品仅相隔一周，它们可以与HCL和PCA分析区别。SAM(对于1.64的delta值和0％错误发现率(FDR))鉴定出5个正显著代谢物而无负显著代谢物，其按降低显著性的次序是延胡索酸盐(fumarate)、甘油-3-磷酸、尿素、尿嘧啶、和丙酮酸盐(pyruvate)。在图8中在代谢网络的背景中显示了4种代谢物。高浓度的延胡索酸盐和尿素可以指明与122天样品相比，尿素循环及如此氮同化在129天中的更高活性。另外，增加浓度的甘油-3-磷酸可以指明甘油脂的生成增加。尿嘧啶(其是尿苷的前体和磷酸尿苷(UMP、UDP和UTP)的主要组分)在碳水化合物代谢、蛋白质糖基化和糖脂形成中发挥重要的作用。显而易见的是，此类信息在优化生物反应器操作中可以是有用的。

经由代谢物序型分析，细胞生理学状态的较高解析表征是有可能的。可以使用代谢组谱来鉴定一种或多种在感兴趣的参数诸如细胞龄方面区别性的代谢物。例如，可以使用代谢组谱来鉴定1、2、5、10、50、100、或更多种在感兴趣的参数方面区别性的代谢物。可以与常规测量的细胞培养物生理学变量组合使用这些区别性的代谢物以优选生物反应器培养及存档警告或过程搅乱。可以利用代谢组学作为细胞培养工程中的灵敏性高通量分析分析。

通过考虑本文中所公开的本发明的此说明书和实施，本发明的其它实施方案对于本领域技术人员会是显而易见的。意图认为说明书和实施例仅是例示性的，本发明的真实的范围和精神由所附权利要求书所指明。

Claims

1.一种用于监测细胞培养物的生理学状态的方法，包括下列步骤：

(a)在从第一生物反应器采集的第一培养物样品中测定一种或多种代谢物的水平；

(b)至少在从第二生物反应器采集的第二培养物样品中测定一种或多种代谢物的水平；并

(c)比较第一培养物样品中的一种或多种代谢物的水平与所述第二培养物样品中的代谢物的水平；

其中与所述第二培养物样品中的一种或多种代谢物的水平相比，所述第一培养物样品中的一种或多种代谢物的水平的变化是细胞培养物的生理学状态的指标。

2.权利要求1的方法，其中所述生理学状态选自细胞生长、代谢谱、和细胞龄。

3.权利要求1的方法，其中所述细胞培养物是哺乳动物细胞培养物。

4.权利要求3的方法，其中所述哺乳动物细胞培养物是幼仓鼠肾细胞培养物。

5.权利要求1的方法，其中所述生物反应器选自实验室规模生物反应器、制造规模生物反应器、灌注生物反应器、和补料-分批生物反应器。

6.权利要求1的方法，其中通过质谱术和NMR来测定代谢物的水平。

7.权利要求1的方法，其中通过气相层析-质谱术和液相层析-质谱术来测定代谢物的水平。

8.权利要求1的方法，其中使用多变量统计分析来确定代谢物水平的比较。

9.权利要求1的方法，其中使用选自下组的方法来确定代谢物水平的比较：等级聚类和主成分分析。

10.权利要求1的方法，其中所述代谢物选自含有胺基的代谢物和含有酮基的代谢物。

11.权利要求1的方法，其中所述代谢物选自葡萄糖、乳酸盐、谷氨酰胺、谷氨酸、氨水、延胡索酸盐、甘油-3-磷酸、尿素、尿嘧啶、和丙酮酸盐。

12.权利要求1的方法，其中所述方法是高通量方法。

13.权利要求1的方法，其中所述代谢物是胞内或胞外的。

14.一种用于监测细胞培养物的生理学状态的方法，包括下列步骤：

(a)在自生物反应器采集的培养物样品中测定一种或多种代谢物的水平；并

(b)比较所述培养物样品中的一种或多种代谢物的水平与标准的培养物样品中的代谢物的水平；

其中与所述标准的培养物样品中的一种或多种代谢物的水平相比，所述培养物样品中的一种或多种代谢物的水平的变化是细胞培养物的生理学状态的指标。

15.权利要求14的方法，其中所述生理学状态选自细胞生长、代谢谱、和细胞龄。

16.权利要求14的方法，其中所述细胞培养物是哺乳动物细胞培养物。

17.权利要求16的方法，其中所述哺乳动物细胞培养物是幼仓鼠肾细胞培养物。

18.权利要求14的方法，其中所述生物反应器选自实验室规模生物反应器、制造规模生物反应器、灌注生物反应器、和补料-分批生物反应器。

19.权利要求14的方法，其中通过质谱术和NMR来测定代谢物的水平。

20.权利要求14的方法，其中通过气相层析-质谱术和液相层析-质谱术来测定代谢物的水平。

21.权利要求14的方法，其中使用多变量统计分析来确定代谢物水平的比较。

22.权利要求14的方法，其中使用选自下组的方法来确定代谢物水平的比较：等级聚类和主成分分析。

23.权利要求14的方法，其中所述代谢物选自含有胺基的代谢物和含有酮基的代谢物。

24.权利要求14的方法，其中所述代谢物选自葡萄糖、乳酸盐、谷氨酰胺、谷氨酸、氨水、延胡索酸盐、甘油-3-磷酸、尿素、尿嘧啶、和丙酮酸盐。

25.权利要求14的方法，其中所述方法是高通量方法。

26.权利要求14的方法，其中所述代谢物是胞内或胞外的。

27.从权利要求1至权利要求14的方法产生的代谢组谱。