CN102411013A - 一种红细胞冷冻保存时最佳降温速度的预测方法 - Google Patents

Abstract

本发明揭示了一种红细胞冷冻保存时最佳降温速度的预测方法，包括根据细胞悬液在降温过程中的放热量与细胞体积的线性关系，确定细胞在恒定降温速度下在特定保存液中的体积变化，再根据水分跨膜转运的数理模型拟合红细胞对应的渗透参数，最后通过模拟细胞在不同降温速度下的体积变化来预测其对应的最佳降温速度范围。通过细胞计数仪测定细胞回收率论证得到：DSC法能较为准确地预测细胞在特定保存液中的最佳降温速度范围，大幅降低工作强度，便于指导并建立更为合理的低温保存方案。

Description

一种红细胞冷冻保存时最佳降温速度的预测方法

技术领域

本发明涉及一种最佳降温速度的预测方法，尤其涉及一种红细胞冷冻保存时最佳降温速度的预测方法。

背景技术

目前血液中心或血库普遍采用4℃液态保存，但是在保存期内，细胞的ATP及2，3-DPG含量会逐步下降，直接影响治疗效果，而且保存期短(仅42天)。冷冻红细胞则以质量可靠，解冻洗涤后细胞形态及生化特性与4℃液态保存的红细胞相似，且保存期长达10年，成为稀有血型及自体输血的主要保存方式，此外还能应对战事、自然灾害等突发事件的血源需求。

为了减少生物材料遭受低温损伤，确定冷冻时最佳降温速度是亟待解决的问题，通常该速度应能足够慢以规避胞内冰形成，同时又足够快以避免细胞严重脱水。研究人员往往通过不同降温速度实验，借助若干生化指标筛选出效果最佳的实验方案，整个流程繁琐而冗长。因此，事先获知低温下细胞膜水分跨膜转运量及转运速度，这对准确估计最佳降温速度范围提供极大的便利，大幅降低原有工作量，为红细胞低温保存规程提供操作参考值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种红细胞冷冻保存时最佳降温速度的预测方法，可以形象刻画细胞在低温环境中的应激反应，掌握细胞遭受低温损伤的发展进程，又能根据细胞失水状况确定细胞在特定保存液中的最佳降温速度，提高红细胞低温保存效果。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种红细胞冷冻保存时最佳降温速度的预测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

一、制备试样

将新鲜血液以2500r/min离心5min，弃去血浆及白膜，再用0.9％NaCl溶液反复洗涤3次，弃去上清液，得到红细胞浓缩液备用；

将二甲基亚砜DMSO按四步等体积法添加到红细胞浓缩液中，制备成压积为0.4，DMSO终浓度为20％的细胞悬液，两次添加间隙需将试样在室温下静置5min，随后添加0.5～1mg丁香假单胞菌，混匀后滴加至标准铝皿中，称重密封；

二、DSC试验温度程序

(1)测定保存液的熔融温度T_ph

将试样移入DSC的样品炉腔中，盖好炉盖，将初始温度设定为4℃，随后将试样降温至-85℃，待热流稳定后从-85℃以10℃/min加热至20℃，用热分析软件Pyris Software 5.0采集这一升温过程的放热峰，该放热峰的外推起始温度即为该溶液的熔融温度T_ph；

(2)测定细胞悬液的放热量

在溶液形成胞外冰后，细胞悬液从保存液的熔融温度T_ph以5℃/min降温至-50℃，此时热流曲线记录细胞具有渗透活性时的热流变化，再将试样重新加热至保存液的熔融温度T_ph，以200℃/min的速率降温至-150℃，随后重新记录试样从保存液熔融温度T_ph以5℃/min降温至-50℃内的热流曲线；

(3)细胞体积的换算

将两条热流曲线进行局部积分，曲线交叠部分形成热量差，确定Δq(T)_dsc及Δq_dsc，再结合细胞初始体积V₀及非渗透性体积V_b，代入式(1)中计算细胞降温到任意温度下的体积；

$V\left(T\right)=V_0-\frac{\mathrm{\Δq}{\left(T\right)}_{\mathrm{dsc}}}{\mathrm{\Δ}{q}_{\mathrm{dsc}}}(V_0-V_b)---\left(1\right)$

三.确定红细胞的渗透参数：L_pg[cpa]及E_Lp[cpa]

将红细胞在保存液中的体积变化代入水分跨膜转运的数理模型(式(2)、(3))中，运用MatLab软件中的Lsqnonlin函数求解渗透参数L_pg[cpa]及E_Lp[cpa]；

$L_p=L_{\mathrm{pg}}\left[\mathrm{cpa}\right]\×\exp [-\frac{E_{\mathrm{Lp}}\left[\mathrm{cpa}\right]}{R}(\frac{1}{T}-\frac{1}{T_R})]---\left(3\right)$

式中V为细胞体积，T为绝对温度，Lp为细胞膜对水的渗透率，L_pg[cpa]为细胞膜在参考温度T_R时对水的渗透率，E_Lp[cpa]为水分渗透过程的表观活化能，R为理想气体常数，A_c为膜上水分输运的有效面积，B为冷冻速度，υ_w为水的偏摩尔体积，V_b为细胞非渗透性体积，n_cpa为细胞内的低温保护剂摩尔数，υ_cpa为低温保护剂的偏摩尔体积，

为盐的溶解常数，n_s为细胞内的溶质摩尔数，ΔH_f为水的融化潜热，ρ为纯水密度；

四.确定最佳降温速度理论值

将细胞的渗透系数L_pg[cpa]及E_Lp[cpa]代入式(2)、(3)中，用Runge-Kutta法模拟细胞在不同降温速度下的胞内水分流失状况；

随后按式(4)计算细胞在特定温度t时束缚水含量，按照细胞冷冻到t℃时的束缚水含量未超过5％，认定为细胞对应的最佳降温速度；

$W_t=\frac{V_t-V_b}{V_0-V_t}---\left(4\right)$

式中V_t为t℃时的细胞体积，W_t为t℃时的细胞束缚水含量。

一种红细胞冷冻保存时最佳降温速度的预测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

一、制备试样

将新鲜血液弃去血浆及白膜，而后反复洗涤，弃去上清液，得到红细胞浓缩液备用；

将二甲基亚砜DMSO按四步等体积法添加到红细胞浓缩液中，制备细胞悬液，随后添加丁香假单胞菌，混匀后滴加至容器中，称重密封；

二、DSC试验温度程序

(1)测定保存液的熔融温度T_ph

(2)测定细胞悬液的放热量

(3)细胞体积的换算

三.确定红细胞的渗透参数L_pg[cpa]及E_Lp[cpa]

将红细胞在保存液中的体积变化代入水分跨膜转运的数理模型(式(2)、(3))中，运用MatLab软件中的Lsqnonlin函数求解渗透参数L_pg[cpa]及E_Lp[cpa]；

$L_p=L_{\mathrm{pg}}\left[\mathrm{cpa}\right]\×\exp [-\frac{E_{\mathrm{Lp}}\left[\mathrm{cpa}\right]}{R}(\frac{1}{T}-\frac{1}{T_R})]---\left(3\right)$

式中V为细胞体积，T为绝对温度，Lp为细胞膜对水的渗透率，L_pg[cpa]为细胞膜在参考温度T_R时对水的渗透率，E_Lp[cpa]为水分渗透过程的表观活化能，R为理想气体常数，A_c为膜上水分输运的有效面积，B为冷冻速度，υ_w为水的偏摩尔体积，V_b为细胞非渗透性体积，n_cpa为细胞内的低温保护剂摩尔数，υ_cpa为低温保护剂的偏摩尔体积，

为盐的溶解常数，n_s为细胞内的溶质摩尔数，ΔH_f为水的融化潜热，ρ为纯水密度；

四.确定最佳降温速度理论值

将细胞的渗透系数L_pg[cpa]及E_Lp[cpa]代入式(2)、(3)中，用Runge-Kutta法模拟细胞在不同降温速度下的胞内水分流失状况；

随后按式(4)计算细胞在特定温度t时束缚水含量，按照细胞冷冻到t℃时的束缚水含量未超过5％，认定为细胞对应的最佳降温速度；

$W_t=\frac{V_t-V_b}{V_0-V_t}---\left(4\right)$

式中V_t为t℃时的细胞体积，W_t为t℃时的细胞束缚水含量。

本发明的有益效果在于：本发明提出的红细胞冷冻保存时最佳降温速度的预测方法，可以形象刻画细胞在低温环境中的应激反应，掌握细胞遭受低温损伤的发展进程，又能根据细胞失水状况确定细胞在特定保存液中的最佳降温速度，提高红细胞低温保存效果。

附图说明

图1为模拟红细胞在20％DMSO中以不同降温速度冷冻时体积变化示意图，其中曲线由左至右降温速度分别对应0.5、1、2、5、10、20及50℃/min。

具体实施方式

下面结合附图详细说明本发明的优选实施例。

实施例一

量热仪：DSC-Pyris Diamond(美国Perkin-Elmer公司)

红细胞回收率的计算

红细胞回收率为冷冻红细胞经解冻洗涤后的细胞数目与未冻前的细胞数目之比。

$\mathrm{RBC}\%=\frac{{\mathrm{RBC}}_1}{{\mathrm{RBC}}_2}\×100\%$

式中RBC％为红细胞回收率(％)，RBC₁为试样冷冻后的红细胞数目(个/mL)，RBC₂为试样未冻前的红细胞数目(个/mL)。

请参阅图1，本发明揭示了一种红细胞冷冻保存时最佳降温速度的预测方法，即差示扫描量热法(DSC)预测红细胞在特定保存液中的最佳降温速度；所述方法包括如下步骤：

一、制备试样

将新鲜血液以2500r/min离心5min，弃去血浆及白膜，再用0.9％NaCl溶液反复洗涤3次，弃去上清液，得到红细胞浓缩液备用。

将二甲基亚砜(DMSO)按四步等体积法添加到红细胞浓缩液中，制备成压积为0.4，DMSO终浓度为20％的细胞悬液，两次添加间隙需将试样在室温下静置5min，以防止因溶液渗透压陡增而使细胞失活。随后添加0.5～1mg丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)，混匀后滴加到标准铝皿中，称重密封。

二、DSC试验温度程序

(1)测定保存液的熔融温度(T_ph)

将试样移入DSC的样品炉腔中，盖好炉盖，将初始温度设定为4℃，随后将试样降温至-85℃，待热流稳定后从-85℃以10℃/min加热至20℃，用热分析软件Pyris Software 5.0采集这一升温过程的放热峰，该放热峰的外推起始温度即为该溶液的熔融温度。

(2)测定细胞悬液的放热量

在溶液形成胞外冰后，细胞悬液从保存液的熔融温度(Tph)以5℃/min降温至-50℃，此时热流曲线记录细胞具有渗透活性时的热流变化，再将试样重新加热至保存液的熔融温度Tph，以200℃/min的速率降温至-150℃，随后重新记录试样从保存液熔融温度Tph以5℃/min降温至-50℃内的热流曲线。

(3)细胞体积的换算

将两条热流曲线进行局部积分，曲线交叠部分形成热量差(确定Δq(T)_dsc及Δq_dsc)，再结合细胞初始体积及非渗透性体积(V₀及V_b)，代入式(1)中计算细胞降温到任意温度下的体积。

$V\left(T\right)=V_0-\frac{\mathrm{\Δq}{\left(T\right)}_{\mathrm{dsc}}}{\mathrm{\Δ}{q}_{\mathrm{dsc}}}(V_0-V_b)---\left(1\right)$

三.确定红细胞的渗透参数(Lpg[cpa]及ELp[cpa])

将红细胞在保存液中的体积变化代入水分跨膜转运的数理模型(式(2)、(3))中，运用MatLab软件中的Lsqnonlin函数(nonlinear least-squares problems)求解渗透参数(L_pg[cpa]及E_Lp[cpa])。确定红细胞在低温保护剂中的渗透参数，红细胞在20％DMSO中其对应的L_pg[cpa]为0.0173μm/min-atm，E_Lp[cpa]为16.49kcal/mol (R²＝0.913)。

$L_p=L_{\mathrm{pg}}\left[\mathrm{cpa}\right]\×\exp [-\frac{E_{\mathrm{Lp}}\left[\mathrm{cpa}\right]}{R}(\frac{1}{T}-\frac{1}{T_R})]---\left(3\right)$

式中V为细胞体积(μm3)，T为绝对温度(K)，Lp为细胞膜对水的渗透率(μm3/N-s)，Lpg[cpa]为细胞膜在参考温度TR(273.15K)时对水的渗透率(μm/min-atm)，ELp[cpa]为水分渗透过程的表观活化能(kcal/mol)，R为理想气体常数(8.314J/mol-K)，Ac为膜上水分输运的有效面积(μm2)，B为冷冻速度(K/min)，υw为水的偏摩尔体积(μm3/mol)，Vb为细胞非渗透性体积(μm3)，ncpa为细胞内的低温保护剂摩尔数(mol)，υcpa为低温保护剂的偏摩尔体积(μm3/mol)，

为盐的溶解常数(＝2)，ns为细胞内的溶质摩尔数(mol)，ΔHf为水的融化潜热(J/g)，ρ为纯水密度(kg/m3)。

四.确定最佳降温速度理论值

将细胞的渗透系数(L_pg[cpa]及E_Lp[cpa])代入式(2)、(3)中，用Runge-Kutta法模拟细胞在不同降温速度下的胞内水分流失状况。

随后按式(4)参照细胞在-30℃时束缚水含量未超过5％，认定为细胞对应的最佳降温速度为5.2℃/min。

$W_{-30}=\frac{V_{-30}-V_b}{V_0-V_b}---\left(4\right)$

验证：按照以上方法，确定在20％DMSO中，其最佳降温速度为5.2℃/min，当将相同试样以5.2℃/min降温，利用细胞计数仪测得细胞回收率，高达71.75％，可发现DSC能较为准确地预测细胞在特定保存液中的最佳降温速度范围，大幅降低工作强度。

综上所述，本发明提出的红细胞冷冻保存时最佳降温速度的预测方法，可以形象刻画细胞在低温环境中的应激反应，掌握细胞遭受低温损伤的发展进程，又能根据细胞失水状况确定细胞在特定保存液中的最佳降温速度，提高红细胞低温保存效果。

这里本发明的描述和应用是说明性的，并非想将本发明的范围限制在上述实施例中。这里所披露的实施例的变形和改变是可能的，对于那些本领域的普通技术人员来说实施例的替换和等效的各种部件是公知的。本领域技术人员应该清楚的是，在不脱离本发明的精神或本质特征的情况下，本发明可以以其它形式、结构、布置、比例，以及用其它组件、材料和部件来实现。在不脱离本发明范围和精神的情况下，可以对这里所披露的实施例进行其它变形和改变。

Claims (2)

1.一种红细胞冷冻保存时最佳降温速度的预测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

一、制备试样

将新鲜血液以2500r/min离心5min，弃去血浆及白膜，再用0.9％NaCl溶液反复洗涤3次，弃去上清液，得到红细胞浓缩液备用；

将二甲基亚砜DMSO按四步等体积法添加到红细胞浓缩液中，制备成压积为0.4，DMSO终浓度为20％的细胞悬液，两次添加间隙需将试样在室温下静置5min，随后添加0.5～1mg丁香假单胞菌，混匀后滴加至标准铝皿中，称重密封；

二、DSC试验温度程序

(1)测定保存液的熔融温度T_ph

将试样移入DSC的样品炉腔中，盖好炉盖，将初始温度设定为4℃，随后将试样降温至-85℃，待热流稳定后从-85℃以10℃/min加热至20℃，用热分析软件Pyris Software 5.0采集这一升温过程的放热峰，该放热峰的外推起始温度即为该溶液的熔融温度T_ph；

(2)测定细胞悬液的放热量

在溶液形成胞外冰后，细胞悬液从保存液的熔融温度T_ph以5℃/min降温至-50℃，此时热流曲线记录细胞具有渗透活性时的热流变化，再将试样重新加热至保存液的熔融温度T_ph，以200℃/min的速率降温至-150℃，随后重新记录试样从保存液熔融温度T_ph以5℃/min降温至-50℃内的热流曲线；

(3)细胞体积的换算

将两条热流曲线进行局部积分，曲线交叠部分形成热量差，确定从起始温度冷冻至任意终结温度T时的放热量Δq(T)_dsc及全过程中的放热量Δq_dsc，再结合细胞初始体积V₀及非渗透性体积V_b，代入式(1)中计算细胞降温到任意温度下的体积；

$V\left(T\right)=V_0-\frac{\mathrm{\Δq}{\left(T\right)}_{\mathrm{dsc}}}{\mathrm{\Δ}{q}_{\mathrm{dsc}}}(V_0-V_b)---\left(1\right)$

三.确定红细胞的渗透参数：L_pg[cpa]及E_Lp[cpa]

将红细胞在保存液中的体积变化代入水分跨膜转运的数理模型(式(2)、(3))中，运用MatLab软件中的Lsqnonlin函数求解渗透参数L_pg[cpa]及E_Lp[cpa]；

$L_p=L_{\mathrm{pg}}\left[\mathrm{cpa}\right]\×\exp [-\frac{E_{\mathrm{Lp}}\left[\mathrm{cpa}\right]}{R}(\frac{1}{T}-\frac{1}{T_R})]---\left(3\right)$

式中V为细胞体积，T为绝对温度，Lp为细胞膜对水的渗透率，L_pg[cpa]为细胞膜在参考温度T_R时对水的渗透率，E_Lp[cpa]为水分渗透过程的表观活化能，R为理想气体常数，A_c为膜上水分输运的有效面积，B为冷冻速度，υ_w为水的偏摩尔体积，V_b为细胞非渗透性体积，n_cpa为细胞内的低温保护剂摩尔数，υ_cpa为低温保护剂的偏摩尔体积，

为盐的溶解常数，n_s为细胞内的溶质摩尔数，ΔH_f为水的融化潜热，ρ为纯水密度；

四.确定最佳降温速度理论值

将细胞的渗透系数L_pg[cpa]及E_Lp[cpa]代入式(2)、(3)中，用Runge-Kutta法模拟细胞在不同降温速度下的胞内水分流失状况；

随后按式(4)计算细胞在特定温度t时束缚水含量，按照细胞冷冻到t℃时的束缚水含量未超过5％，认定为细胞对应的最佳降温速度；

$W_t=\frac{V_t-V_b}{V_0-V_t}---\left(4\right)$

式中V_t为t℃时的细胞体积，W_t为t℃时的细胞束缚水含量。

2.一种红细胞冷冻保存时最佳降温速度的预测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

一、制备试样

将新鲜血液弃去血浆及白膜，而后反复洗涤，弃去上清液，得到红细胞浓缩液备用；

将二甲基亚砜DMSO按四步等体积法添加到红细胞浓缩液中，制备细胞悬液，随后添加丁香假单胞菌，混匀后滴加至容器中，称重密封；

二、DSC试验温度程序

(1)测定保存液的熔融温度T_ph；

(2)测定细胞悬液的放热量；

(3)细胞体积的换算；

三.确定红细胞的渗透参数L_pg[cpa]及E_Lp[cpa]

将红细胞在保存液中的体积变化代入水分跨膜转运的数理模型(式(2)、(3))中，运用MatLab软件中的Lsqnonlin函数求解渗透参数L_pg[cpa]及E_Lp[cpa]；

$L_p=L_{\mathrm{pg}}\left[\mathrm{cpa}\right]\×\exp [-\frac{E_{\mathrm{Lp}}\left[\mathrm{cpa}\right]}{R}(\frac{1}{T}-\frac{1}{T_R})]---\left(3\right)$

式中V为细胞体积，T为绝对温度，Lp为细胞膜对水的渗透率，L_pg[cpa]为细胞膜在参考温度T_R时对水的渗透率，E_Lp[cpa]为水分渗透过程的表观活化能，R为理想气体常数，A_c为膜上水分输运的有效面积，B为冷冻速度，υ_w为水的偏摩尔体积，V_b为细胞非渗透性体积，n_cpa为细胞内的低温保护剂摩尔数，υ_cpa为低温保护剂的偏摩尔体积，为盐的溶解常数，n_s为细胞内的溶质摩尔数，ΔH_f为水的融化潜热，ρ为纯水密度；

四.确定最佳降温速度理论值

将细胞的渗透系数L_pg[cpa]及E_Lp[cpa]代入式(2)、(3)中，用Runge-Kutta法模拟细胞在不同降温速度下的胞内水分流失状况；

随后按式(4)计算细胞在特定温度t时束缚水含量，按照细胞冷冻到t℃时的束缚水含量未超过5％，认定为细胞对应的最佳降温速度；

$W_t=\frac{V_t-V_b}{V_0-V_t}---\left(4\right)$

式中V_t为t℃时的细胞体积，W_t为t℃时的细胞束缚水含量。

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