CN102409051B

CN102409051B - 海洋鱼类线粒体基因组控制区扩增引物及设计和扩增方法

Info

Publication number: CN102409051B
Application number: CN 201110315821
Authority: CN
Inventors: 徐田军; 王日昕; 程远志; 石戈; 孙悦娜
Original assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Current assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Priority date: 2011-10-18
Filing date: 2011-10-18
Publication date: 2013-06-12
Anticipated expiration: 2031-10-18
Also published as: CN102409051A

Abstract

本发明属于海洋鱼类线粒体基因组控制区研究领域，涉及一种海洋鱼类线粒体基因组控制区的扩增引物，由两条单链寡核苷酸组成，其中轻链引物为如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；重链引物为如SEQIDNo.2所示的核苷酸序列。本发明还提供了所述的扩增引物的设计方法及利用该扩增引物对海洋鱼类线粒体基因组控制区进行扩增的方法。本发明的扩增引物可以高效特异性地扩增多数海洋鱼类线粒体基因组控制区，能适应鱼类种质资源大规模调查分析，从而为快速有效获取海洋鱼类线粒体控制区序列以进行种类鉴定、种质资源调查及控制区进化研究提供了一个有力工具。

Description

海洋鱼类线粒体基因组控制区扩增引物及设计和扩增方法

技术领域

本发明属于海洋鱼类线粒体基因组控制区研究领域，涉及一对PCR扩增引物（Marinefish-Dloop），尤其是涉及一种可高效特异地扩增多数海洋鱼类线粒体基因组控制区的扩增引物及设计方法和扩增方法。

背景技术

动物线粒体基因组DNA呈共价闭合环状，包括一条轻链，一条重链，是细胞核外具有自主复制、转录和翻译能力的遗传因子。与核DNA相比，动物线粒体基因组DNA具有拷贝数高，一级结构进化速度快，严格的母系遗传等特点，因而已成为水产养殖业、渔业遗传学研究和进化生物学研究的有力工具。线粒体基因组由37个编码基因及一段主要的非编码区即控制区组成，不同区域其进化速率不同。控制区是线粒体基因组中进化最快的的区域，它的变异速率约为线粒体DNA上其他区域的5~10倍，非常适于亲缘关系较近的群体间比较研究，是进行鱼类群体遗传结构评估、相似种类及不同群体鉴定和濒危物种遗传多样性调查等研究方面的重要遗传标记。此外，线粒体控制区还存在不同程度的功能基序缺失或串联重复等结构变异现象，为研究控制区的进化机制和线粒体DNA复制转录调控机制提供极好的研究材料。

目前利用控制区序列进行鱼类遗传学和进化生物学研究大多是针对每一种鱼类设一对相应的引物，不能适应鱼类种质资源大规模调查分析，并且绝大多数鱼类的线粒体基因组序列信息暂时为空白，缺乏相应的模板序列用于设计扩增引物，因而利用序列保守性设计通用扩增引物用以扩增控制区序列是一种十分高效便利的方法。国内外关于线粒体控制区通用引物的报道主要：Kawaguchi等设计的鱼类线粒体控制区通用引物、丁少雄等设计的石斑鱼类线粒体基因组高变异区扩增引物以及黄志坚等设计的淡水鱼类线粒体控制区扩增引物。然而设计模板序列的选取、设计方法的不同以及通用引物自身扩增能力的局限性，利用已报道的通用引物均不能有效地扩增以石首鱼类为主的多数海洋鱼类，因此设计新的控制区通用引物，同已报道的引物进行互补，对于有效获得绝大多数鱼类线粒体控制区序列是十分必要的。

发明内容

针对上述现有技术存在的缺点和不足，本发明旨在提供一对可高效特异扩增多数海洋鱼类线粒体基因组控制区的单链寡核苷酸引物，从而为快速有效获取海洋鱼类乃至低等脊椎动物线粒体控制区序列以进行种类鉴定、种质资源调查及控制区进化研究提供了一个有力工具。本发明的目的还在于提供所述海洋鱼类线粒体基因组控制区扩增引物的设计方法，以及利用所述的海洋鱼类线粒体基因组控制区扩增引物对海洋鱼类线粒体基因组控制区进行扩增的方法。

为实现本发明的发明目的，发明人提供如下技术方案：

海洋鱼类线粒体基因组控制区扩增引物，由两条单链寡核苷酸组成，其中轻链引物为如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；重链引物为如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

本发明轻链引物Marinefish-Dloop-Thr-F（SEQ ID No.1）有20个碱基：AGCACCGGTCTTGTAAACCG，位于tRNA-Thr基因上；重链引物Marine-Dloop-Phe-R（SEQ ID No.2）有21个碱基：GGGCTCATCTTAACATCTTCA，位于tRNA-Phe基因上。

本发明所述的海洋鱼类线粒体控制区扩增引物对在东海海域采集的41种海洋鱼类，1种淡水鱼类，均能获得片段在750bp-1200bp之间的特异性扩增产物，经测序及与GenBank中同源序列的比较，确认为包含全部线粒体控制区的扩增产物，体现出本发明较广的扩增范围与较强的扩增能力，从而为快速有效获取海洋鱼类线粒体控制区序列以进行种类鉴定、种质资源调查及控制区进化研究提供了一个有力工具。

作为优选，根据本发明所述的海洋鱼类线粒体基因组控制区扩增引物，其中所述的海洋鱼类包括眼斑拟石首鱼、鳓鱼、髯毛鰕虎鱼、矛尾复虾虎鱼、大弹涂鱼、斑尾刺虾虎鱼、黄鳍刺鰕虎鱼、青弹涂鱼、矛尾刺鰕虎鱼、双带缟虾虎鱼、短尾大眼鲷、澳洲鲭、鲻鱼、鳄鲬、小黄鱼、大泷六线鱼、若鲹、厦门白姑鱼、尖头黄鳍牙?、带鱼、白姑鱼、刺鲳、鳜鱼、日本方头鱼、角木叶鲽、斑鰶、褐菖鮋、凤鲚、鮸鱼、棘头梅童鱼、黑鳃梅童鱼、红狼牙虾虎鱼、真鲷、横带髭鲷、斜带髭鲷、条石鲷、二长棘鲷、黄姑鱼、黄鳍棘鲷、金色小沙丁鱼、黑鲷。

作为优选，根据本发明所述的海洋鱼类线粒体基因组控制区扩增引物，其中所述的淡水鱼类包括鲫鱼。

本发明还提供了上述的海洋鱼类线粒体基因组控制区扩增引物的设计方法，即登录NCBI网站中的GenBank数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索已测定的海洋鱼类线粒体基因组的tRNA-Thr和tRNA-Phe基因序列，经同源性比较，找到保守序列，并利用Premier Primer5.0软件设计出海洋鱼类线粒体基因组控制区扩增引物。所用的Premier Primer5.0软件在生物软件网http://www.bio-soft.net/下载。

本发明还提供了一种对海洋鱼类线粒体基因组控制区进行扩增的方法，其是采用上述的海洋鱼类线粒体基因组控制区扩增引物对待测样品的DNA模板溶液进行PCR扩增。

作为优选，根据本发明所述的一种对海洋鱼类线粒体基因组控制区进行扩增的方法，其中PCR扩增的条件为：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，共30个循环，最后72℃延伸5min。。

作为优选，根据本发明所述的一种对海洋鱼类线粒体基因组控制区进行扩增的方法，其中PCR扩增的反应体系组成为：PCR反应体系为25μL，内含dNTP 2μL、Pfu DNA聚合酶 Buffer 2.5μL、10μmol的轻链引物和重链引物各1μL、Pfu 酶 1μL、含100ng的DNA模板溶液 1μL及ddH₂O 16.5μL。

作为优选，根据本发明所述的一种对海洋鱼类线粒体基因组控制区进行扩增的方法，其中所述的待测样品来自包括眼斑拟石首鱼、鳓鱼、髯毛鰕虎鱼、矛尾复虾虎鱼、大弹涂鱼、斑尾刺虾虎鱼、黄鳍刺鰕虎鱼、青弹涂鱼、矛尾刺鰕虎鱼、双带缟虾虎鱼、短尾大眼鲷、澳洲鲭、鲻鱼、鳄鲬、小黄鱼、大泷六线鱼、若鲹、厦门白姑鱼、尖头黄鳍牙?、带鱼、白姑鱼、刺鲳、鳜鱼、日本方头鱼、角木叶鲽、斑鰶、褐菖鮋、凤鲚、鮸鱼、棘头梅童鱼、黑鳃梅童鱼、红狼牙虾虎鱼、真鲷、横带髭鲷、斜带髭鲷、条石鲷、二长棘鲷、黄姑鱼、黄鳍棘鲷、金色小沙丁鱼、黑鲷等的海洋鱼类。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明提供的海洋鱼类线粒体基因组控制区扩增引物，可以高效特异性地扩增多数海洋鱼类线粒体基因组控制区，能适应鱼类种质资源大规模调查分析，从而为快速有效获取海洋鱼类线粒体控制区序列以进行种类鉴定、种质资源调查及控制区进化研究提供了一个有力工具。同时本发明所述通用引物及其设计方法也可作为通用引物PCR扩增原理及关键参数研究的具体实例，促进本发明所涉及领域的前进发展，因而具备重要发明价值和理论意义。

附图说明

图1为本发明海洋鱼类线粒体基因组控制区扩增引物用以扩增不同鱼类线粒体控制区的电泳图谱，

其中M：DNA分子量标准（DL2000），1-45：依次为：眼斑拟石首鱼、鳓鱼、鲫鱼、髯毛鰕虎鱼、矛尾复虾虎鱼、大弹涂鱼、斑尾刺虾虎鱼-1、黄鳍刺鰕虎鱼、青弹涂鱼、矛尾刺鰕虎鱼、双带缟虾虎鱼、短尾大眼鲷、澳洲鲭-1、鲻鱼、鳄鲬、小黄鱼、大泷六线鱼、若鲹、厦门白姑鱼、尖头黄鳍牙?、带鱼、白姑鱼、刺鲳、鳜鱼、澳洲鲭-2、日本方头鱼、角木叶鲽、斑鰶-1、褐菖鮋、凤鲚、鮸鱼、棘头梅童鱼、黑鳃梅童鱼、红狼牙虾虎鱼、真鲷、横带髭鲷、斜带髭鲷、条石鲷、二长棘鲷、斑尾刺虾虎鱼-2、黄姑鱼、黄鳍棘鲷、金色小沙丁鱼、斑鰶-2、黑鲷。

具体实施方式

下面结合实施例和说明书附图，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。若无特别指明，实施例采用的方法为本领域通用技术。

主要材料、试剂和仪器设备：

软件及序列资源：Premier Primer5.0 引物设计软件（下载自生物软件网http://www.bio-soft.net/），海水鱼类线粒体基因组序列资源（下载自NCBI中Genbank数据库http://www.ncbi.nlm.nih.gov/），序列分析软件MEGA4.1（下载自生物软件网http://www.bio-soft.net/）。

PCR扩增检测相关试剂仪器：海洋动物基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN，北京），琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（TIANGEN，北京），常规台式离心机（Thermo），Bio-Rad C1000^TMThermal Cycler扩增仪器（Bio-Rad，美国），微量移液器（Enppdorf，德国），96孔PCR板（Axygen），dNTP（TIANGEN，北京），10×PCR Buffuer（TIANGEN，北京），pfu DNA聚合酶（TIANGEN，北京），灭菌双蒸水，DL2000 DNA marker（TIANGEN，北京），琼脂糖（Biowest，香港），电泳仪（DYY-6C型，北京六一），凝胶成像仪（Bio-Rad GD2000，美国）。

克隆测序相关试剂仪器：高压蒸气灭菌锅（SANYO，日本），加氨苄（Amp）抗生素的灭菌LB培养基，LB固体培养平皿（上海生工），超净工作台（SW-CJ-1G型，名牌之星，中国），恒温水浴锅（上海精宏），DH5α感受态细胞（TIANGEN），Amp抗生素（上海生工），5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（上海生工），异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（上海生工），pGEM-T载体（Promega，美国），恒温培养箱（PH070A型，上海一恒科学仪器有限公司），恒温振荡摇床（培英，太仓市实验设备厂）自动DNA测序仪（ABI 3730型，美国）。

实施例中未注明具体条件的实验方法，是按照常规条件，例如Sambrook等作者的分子克隆实验室手册（New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）中所述的条件，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1

1、海洋鱼类线粒体基因组控制区扩增引物的设计和合成：

登录NCBI网站中的GenBank数据库搜索已测定的海洋鱼类的线粒体基因组的tRNA-Thr和tRNA-Phe基因序列，将序列载入到分析软件MEGA4.1中，利用ClustalW算法进行多序列对位比对分析，找到保守序列，将所找到的保守序列载入到Premier Primer5.0软件在手动设计模式下（即在manual选项下选择Low，具体参数为默认设置）设计出海洋鱼类线粒体基因组控制区扩增引物: 其中轻链引物Marinefish-Dloop-Thr-F（SEQ ID No.1）有20个碱基：AGCACCGGTCTTGTAAACCG，位于tRNA-Thr基因上，重链引物Marine-Dloop-Phe-R（SEQ ID No.2）有21个碱基：GGGCTCATCTTAACATCTTCA，位于tRNA-Phe。

由南京金斯瑞生物科技有限公司根据发明人的要求合成符合SEQ ID No.1和SEQ ID No.1所示核苷酸序列的引物。

2、对海洋鱼类线粒体基因组控制区进行扩增

本发明中的45个待测样，44个待测样本来自41种海洋鱼类，采集于我国的东海海域，1种淡水鱼类采集于舟山水产市场。其中扩增的海洋鱼类包括以下种类：眼斑拟石首鱼、鳓鱼、髯毛鰕虎鱼、矛尾复虾虎鱼、大弹涂鱼、斑尾刺虾虎鱼-1、黄鳍刺鰕虎鱼、青弹涂鱼、矛尾刺鰕虎鱼、双带缟虾虎鱼、短尾大眼鲷、澳洲鲭-1、鲻鱼、鳄鲬、小黄鱼、大泷六线鱼、若鲹、厦门白姑鱼、尖头黄鳍牙?、带鱼、白姑鱼、刺鲳、鳜鱼、澳洲鲭-2、日本方头鱼、角木叶鲽、斑鰶-1、褐菖鮋、凤鲚、鮸鱼、棘头梅童鱼、黑鳃梅童鱼、红狼牙虾虎鱼、真鲷、横带髭鲷、斜带髭鲷、条石鲷、二长棘鲷、斑尾刺虾虎鱼-2、黄姑鱼、黄鳍棘鲷、金色小沙丁鱼、斑鰶-2、黑鲷；扩增的淡水鱼类包括鲫鱼一种。

利用海洋动物基因组DNA提取试剂盒提取待测样本的基因组DNA，方法按照试剂盒说明书进行，琼脂糖电泳检测提取的基因组DNA。

可扩增多数海洋鱼类线粒体控制区片段的PCR反应体系和反应条件如下：PCR反应体系为25μL，内含dNTP（TIANGEN），Pfu DNA聚合酶 Buffer（TIANGEN），10μmol的轻链引物Marinefis-Dloop-Thr-F和重链引物Marinefish-Dloop-Phe-R，Pfu 酶（TIANGEN），含100ng的上述提取的基因组DNA模板溶液，ddH₂O，其中：

Pfu 10×Buffer 2.5μL

dNTP 2μL

Marinefish-Thr-F 1μL

Marinefish-Phe-R 1μL

Template DNA 1μL

ddH₂O 16.5μL

Pfu酶 1μL。

扩增反应在Bio-Rad C1000^TMThermal Cycler仪器上进行，扩增条件为：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，共30个循环，最好72℃延伸5min。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测其大小和纯度。不同鱼类线粒体控制区的电泳图谱见图1。

运用设计的引物扩增多数海洋鱼类线粒体基因组控制区，均获得了单一的目的片段，产物大小约为750bp-1200bp，并对所有PCR扩增产物直接进行测序，其步骤为：PCR扩增产物初步定量后，浓度达到约100ng/μL的样品，寄送南京金斯瑞生物科技有限公司，委托其进行双向测序，测序引物为Marinefish-Thr-F（10μmol）和Marinefish-Phe-R（10μmol）。经测序及与GenBank中的同源序列进行比对，确认为包含线粒体基因组控制区全序列的扩增产物。

运用设计的引物扩增重要经济海洋鱼类小黄鱼，鮸鱼和引进物种眼斑拟石首鱼线粒体基因组控制区，均获得了单一的目的片段，产物大小约为800bp，并使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（TIANGEN，上海）对PCR扩增产物进行胶回收纯化，纯化产物同pGEM-T载体（Promega公司，美国）连接，转化，鉴定阳性克隆并测序。其步骤为：经胶回收纯化的PCR扩增产物在T4 DNA连接酶的作用下与pGEM-T载体进行连接反应。连接反应体系为载体1μL，T4 DNA连接酶1μL，连接Buffer 5uL，PCR纯化产物3μL。连接反应于冰上操作，反应液置于4℃冰箱连接过夜（至少12小时）。取DH5α感受态细胞（TIANGEN，北京），热激法进行转化，用含有氨苄抗生素（Amp）LB平板（使用前预先均匀涂布40μL 20mg/mL的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）和30μL 0.2mol/L的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG））进行蓝白筛选，并通过菌液PCR扩增确认挑取的阳性克隆子。阳性克隆子经扩大培养后的菌液寄送南京金斯瑞生物科技有限公司进行双向直接测序。测序引物为SP6/T7。序列分析仪为ABI 3730 全自动DNA测序仪。经测序及与GenBank中的同源序列进行比对，确认为包含线粒体基因组控制区全序列的扩增产物。

实用性

本发明所述的海洋鱼类线粒体基因组控制区扩增引物对在东海海域采集的41种海洋鱼类，舟山水产市场采集的1种淡水鱼类，均能获得片段在750bp-1200bp之间的特异性扩增产物，经测序及与GenBank中同源序列的比较，确认为包含线粒体控制区的扩增产物，体现出本发明较广的扩增范围与较强的扩增能力，因此，本发明所述的海洋鱼类线粒体基因组控制区扩增引物在海洋鱼类的种类鉴定、种群遗传多样性背景调查、线粒体控制区结构进化及其保守基序功能研究等方面可予以应用。

尽管发明人已经对本发明的技术方案做了较为详细的阐述和列举，应当理解，对于本领域一个熟练的技术人员来说，对上述实施例作出修改和/或变通或者采用等同的替代方案是显然的，都不能脱离本发明精神的实质，本发明中出现的术语用于对本发明技术方案的阐述和理解，并不能构成对本发明的限制。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江海洋学院

<120> 海洋鱼类线粒体基因组控制区扩增引物及设计和扩增方法

<130> Z111353

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agcaccggtc ttgtaaaccg 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gggctcatct taacatcttc a 21

Claims

1.海洋鱼类线粒体基因组控制区扩增引物对，其特征是由两条单链寡核苷酸组成，其中轻链引物为如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；重链引物为如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，

所述的海洋鱼类为眼斑拟石首鱼、鳓鱼、髯毛鰕虎鱼、矛尾复虾虎鱼、大弹涂鱼、斑尾刺虾虎鱼、黄鳍刺鰕虎鱼、青弹涂鱼、矛尾刺鰕虎鱼、双带缟虾虎鱼、短尾大眼鲷、澳洲鲭、鲻鱼、鳄鲬、小黄鱼、大泷六线鱼、若鲹、厦门白姑鱼、尖头黄鳍牙?、带鱼、白姑鱼、刺鲳、鳜鱼、日本方头鱼、角木叶鲽、斑鰶、褐菖鮋、凤鲚、鮸鱼、棘头梅童鱼、黑鳃梅童鱼、红狼牙虾虎鱼、真鲷、横带髭鲷、斜带髭鲷、条石鲷、二长棘鲷、黄姑鱼、黄鳍棘鲷、金色小沙丁鱼、黑鲷。

2.一种如权利要求1所述的海洋鱼类线粒体基因组控制区扩增引物对的设计方法，其特征是登录NCBI网站中的GenBank数据库搜索已测定的海洋鱼类线粒体基因组的tRNA-Thr和tRNA-Phe基因序列，经同源性比较，找到保守序列，并利用Premier Primer5.0软件设计出海洋鱼类线粒体基因组控制区扩增引物对。

3.一种对海洋鱼类线粒体基因组控制区进行扩增的方法，其特征是采用如权利要求1所述的海洋鱼类线粒体基因组控制区扩增引物对对待测样品的DNA模板进行PCR扩增，

PCR扩增的条件为：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，共30个循环，最后72℃延伸5min；

PCR扩增的反应体系组成为：PCR反应体系为25μL，内含dNTP 2μL、Pfu DNA聚合酶 Buffer 2.5μL、10μmol的轻链引物和重链引物各1μL、Pfu 酶 1μL、含100ng的DNA模板溶液 1μL及ddH₂O 16.5μL；

所述的待测样品为眼斑拟石首鱼、鳓鱼、髯毛鰕虎鱼、矛尾复虾虎鱼、大弹涂鱼、斑尾刺虾虎鱼、黄鳍刺鰕虎鱼、青弹涂鱼、矛尾刺鰕虎鱼、双带缟虾虎鱼、短尾大眼鲷、澳洲鲭、鲻鱼、鳄鲬、小黄鱼、大泷六线鱼、若鲹、厦门白姑鱼、尖头黄鳍牙?、带鱼、白姑鱼、刺鲳、鳜鱼、日本方头鱼、角木叶鲽、斑鰶、褐菖鮋、凤鲚、鮸鱼、棘头梅童鱼、黑鳃梅童鱼、红狼牙虾虎鱼、真鲷、横带髭鲷、斜带髭鲷、条石鲷、二长棘鲷、黄姑鱼、黄鳍棘鲷、金色小沙丁鱼、黑鲷。