CN102409001A

CN102409001A - 用于对植物土传病害生物防治的一种真菌

Info

Publication number: CN102409001A
Application number: CN201110339274XA
Authority: CN
Inventors: 王艳丽; 刘诗胤; 孙国昌; 柴荣耀; 张震; 姜华; 王教瑜; 毛雪琴; 邱海萍; 杜新法
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2011-11-01
Filing date: 2011-11-01
Publication date: 2012-04-11
Anticipated expiration: 2031-11-01
Also published as: CN102409001B

Abstract

本发明提供一种用于对植物土传病害进行生物防治的真菌，其特征在于，该真菌包括保藏号为5290的真菌。该真菌对多种植物病原菌具有良好的抑制效果，可以作为生物农药进行开发利用。

Description

用于对植物土传病害生物防治的一种真菌

技术领域

本发明属于生物农药领域，特别的，属于对植物土传病害生物防治的一种真菌。

背景技术

现代农业对作物病害的防治主要集于化学农药的使用，然而化学农药对生态环境具有长期的破坏作用，降低作物的品质，病原物的抗药性以及对人畜有着直接或间接的危害等诸多问题。寻找更为安全、有效的病害防治方法具有重要的意义，利用生物的方法来防治植物病害可以克服上述问题。因而，植物病害的生物防治越来越受到广大研究者的关注。国内外对植物病害生物防治的研究很多^]。然而，生物防治目前主要还是集中在菌株的筛选，生防机制的研究等实验室阶段，仅有少量已经被开发成商品的生防制剂。由于生防菌对环境适应的局限性使得筛选出的生防菌在自然环境中很难正常的生长及繁殖。多数生防菌（如木霉）在使植物增强抗性和促进植物生长的同时也能产生一些对植物本身产生毒害的物质，从而对植物的生长产生抑制作用^]。其次，生防菌对农药比较敏感^]，在田间的农药残留或后期农药的使用都能使得生防菌的防效降低甚至消失^]。同时，生防菌的引入能够导致土壤微生物多样性降低等问题^]。因此，筛选出能够适应多种生态环境的生防菌，以及开发和生产更为安全的生防菌制剂仍是植物病害生物防治研究的重要内容。

发明内容

本发明的研究小组意外发现从浙江宁波地区杨梅树根围土样中分离获得的1株根围真菌（MF-91菌株）初步盆栽试验表明其对水稻立枯丝核菌、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、黄瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea）和甜瓜蔓枯病菌（Didymella bryoniae）等多种土传病害具有较好的防治效果。

本发明提供一种用于对土传病害具进行生物防治的真菌，其特征在于，该真菌包括保藏号为5290的真菌。

优选的，这些土传病害包括以下病害中的一种或几种：水稻立枯丝核菌、水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、大麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、草莓炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、黄瓜灰霉病菌、油菜菌核病菌、甜瓜蔓割病菌(Fusarium oxysporum)、甜瓜蔓枯病菌、茭白胡麻斑病菌(Bipolaris zizaniae)、番茄早疫病菌（Alternaria solani）及黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum)。

优选的，这些土传病害包括以下病害中的一种或几种：菌株对甜瓜蔓枯病菌、油菜菌核病菌、草莓灰霉病菌和番茄早疫病菌。

另一方面，本发明提供一种培养保藏号为的真菌的方法，该方法包括：在PDA培养基上培养菌丝或孢子，pH为3.0—12.0；温度为15—40℃。

优选的，pH为5.0—11.0。优选的，温度为30—35℃。

本发明的有益效果

经形态、分子生物学及相关报道，初步鉴定MF-91菌株为Chaetomium aureum。通过本研究表明，MF-91菌株对多种植物病原菌具有良好的抑制效果；在PDA培养基中生长情况最好，且菌丝呈现环状的黄色状；仅在PDA和燕麦片培养基中有孢子产生；对pH的适应范围较广，偏碱性条件下有利于菌丝生长，而中性环境下适合孢子产生；对温度的适应较强，但是过低温或过高温能够使该菌株停止生长和产孢。综上可知，MF-91菌株对环境的适应能力强，使它能够更好的在各种生态土壤中，尤其是偏碱性土壤中存活并繁殖，改善土壤酸碱性，这将大大提高其在田间的应用价值。

附图说明

图1为温度对MF-91营养生长和孢子产量的影响（注：图中不同的字母表示数据通过Duncan’s 比较后，在P_0.05水平上具显著性差异）。

图2为 MF-91对水稻立枯丝核菌的离体抑制效果。其中A为MF-91与水稻立枯丝核菌平板对峙效果，（a：试验组，b：空白对照）；B、C为不同浓度的MF-91菌株代谢产物对水稻立枯丝核菌的抑制效果（注：图B中不同的小写字母表示数据通过Duncan’s 比较后，在P_0.05水平上具显著性差异，井冈霉素浓度为300μg/m）。

图3为 MF-91生长性状，其中A、B：菌落生长初期（正、反面）； B：菌落生长后期； C：子囊孢子； D：子囊果； E：子囊.

图4为 MF-91菌株基于ITS 序列的聚类图。

对于保藏真菌的生物学特性说明：

该真菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号码为CGMCC NO.5290，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，拉丁学名：Chaetomium sp.。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明方法作进一步的详细描述，但应该理解本发明并不受这些内容所限制。

材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

菌株MF-91为本实验室从杨梅树根围土样中分离获得。本研究所涉及的11种病原真菌均为本实验室分离、鉴定和保存，分别为：水稻立枯丝核菌、水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、大麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、草莓炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、黄瓜灰霉病菌、油菜菌核病菌、甜瓜蔓割病菌(Fusarium oxysporum)、甜瓜蔓枯病菌、茭白胡麻斑病菌(Bipolaris zizaniae)、番茄早疫病菌（Alternaria solani）及黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum)。

培养基

本文研究所用培养基主要包含以下种类：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、马铃薯琼脂培养基（PA）、查氏培养基（CA）、淀粉琼脂培养基（SA）、酵母膏葡萄糖琼脂培养基（YDA）、燕麦片琼脂培养基（OA）、MYRO培养基、Peberdy培养基以及液体马铃薯葡萄糖培养基（PDB）。培养基配方参考《现代植物病理学研究方法》^[16]。

以上培养基均121℃高压灭菌20min。

生化试剂

限制性内切酶、Taq DNA聚合酶购自TaKaRa公司，胶回收和质粒回收试剂盒均购自Axygene公司，pGEM-T3 easy载体购自TransGen公司。

抑菌谱测定

在直径为9cm培养皿中加入20ml PDA培养基，采用平板十字交叉对峙生长法^[17]，即在PDA平板中央接种病原菌，周围4点接种MF-91菌株，于28℃黑暗培养，设单独接种病原菌为对照。观察菌落生长情况，及时记录病原菌菌落直径。每个处理设3个重复。试验重复2次。通过以下公式计算抑菌率：

抑菌率（%）=[（对照平板菌落半径-对峙平板菌落半径）/对照平板菌落半径]×100％。

不同环境对MF-91菌株营养生长和产孢量的影响

1.3.1 培养基对MF-91菌株营养生长和产孢量的影响

选取马铃薯葡萄糖琼脂培养基、马铃薯琼脂培养基、淀粉琼脂培养基、燕麦片琼脂培养基、查氏培养基、酵母膏葡萄糖琼脂培养基、MYRO培养基、Peberdy培养基和理查德培养基9种不同的培养基对MF-91菌株培养并对其营养生长、菌落形态和产孢情况进行观察分析。用直径为5mm灭菌的打孔器打取活化6d的MF-91菌株边缘菌苔，接入培养基中心位置，于28℃黑暗培养9d后十字交叉测量菌落直径，比较MF-91菌株在不同培养基中生长的差异。28d后用10ml无菌水洗下孢子，用血球计数板计数，统计MF-91菌株在不同培养基中的产孢情况。每个处理设3个重复。试验重复2次。

1.3.2初始pH值对MF-91菌株营养生长和产孢量的影响

用NaOH或HCl将PDA培养基调配初始pH值为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，12.0。将活化的MF-91菌株用直径5mm灭菌打孔器打取边缘菌苔接入含20ml PDA培养基平板中央位置。并于28℃恒温培养箱黑暗培养，9d后测量MF-91菌株的菌落直径；28d后用10ml无菌水洗下孢子，计算产孢量。每个处理设3个重复。试验重复2次。

温度对MF-91菌株营养生长和产孢量的影响

经活化的MF-91菌株用直径5mm灭菌打孔器打取边缘菌苔接入含20ml不同初始pH值的PDA和燕麦培养基平板中央位置，分别置于15、20、25、30、35和40℃的黑暗培养箱中恒温培养，9d后测量PDA培养基平板中MF-91菌株的菌落直径，比较生长速度差异；28d后用10ml无菌水洗下燕麦培养基中的孢子，比较产孢差异。每个处理设3个重复。试验重复2次。

菌株代谢产物对水稻立枯丝核菌的抑制作用

经活化的MF-91菌株用直径5mm灭菌打孔器打取边缘菌苔3个接入马铃薯葡萄糖液体培养基中，于28℃ 160rpm振荡黑暗培养6d后收集代谢产物，冷冻离心机4℃，12000rpm离心30min，取上清用0.45μm超滤膜过滤得无菌发酵液。将活化的水稻立枯丝核菌5mm菌饼接入至20ml含不同浓度代谢产物的PDA平板中央位置，其中MF-91菌株代谢产物含量分别为2%、4%、6%、8%和10%，以无菌水作为空白对照，300μg/ml井冈霉素为阳性对照。每个处理设3个重复，统计试验数据，计算相对抑制率。试验重复2次。

相对抑制率（%）=[（空白对照组菌落直径-处理组菌落直径）/空白对照组菌落直径]×100%

1.5 菌种鉴定

1.5.1 形态观察

将MF-91菌株接种至PDA培养基中央位置,于28℃培养箱黑暗培养。及时观察记录菌落生长形态和生长情况，并于28d后观察孢子形态。

菌株ITS序列测序与分析

提取MF-91菌株基因组DNA，方法参照Chi。采用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）进行rDNA-ITS-PCR 扩增。PCR反应参数为：95℃ 2min；94℃ 15s，58℃ 15s，72℃ 45s，35个循环；72℃ 10min；16℃ 8min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后切取目标片段的凝胶，用试剂盒进行回收，具体步骤参照试剂盒说明。将回收的目标片段与pGEM-T3 easy载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性单克隆提取质粒^[19]，酶切验证后测序（由上海生工生物工程有限公司完成）。所得序列在GenBank中进行Blast比对和分析。

菌株β-tubulin序列测定与分析

采用真菌通用引物T1（5′-AACATGCGTGAGATTGTAAGT-3′）和T224（5′-GAGGGAACGACGGAGAAGGTGG-3′）对MF-91 基因组进行PCR 扩增。基因组DNA 提取、PCR 及TA 克隆等方法同1.5.2。

数据处理

研究中的所有数据均采用SPSS 17.0软件进行处理，多重比较采用LSD和Duncan方法。

结果与分析

2.1 抑菌谱测定

MF-91菌株抑菌谱测定结果表明，MF-91菌株对11种病原真菌均具有一定的抑效果，从表1可以看出MF-91菌株对甜瓜蔓枯病菌、油菜菌核病菌、草莓灰霉病菌和番茄早疫病菌等土传病原菌具有较好的抑制效果。

表1 MF-91对主要病原真菌营养生长的抑制效果

2.2 不同培养条件下对MF-91菌株营养生长及产孢情况分析

2.2.1 培养基对MF-91菌株营养生长及产孢的影响

不同培养基上营养生长及产孢试验结果表明(表2)，MF-91在PDA培养基上菌落生长最快，在SA和CA培养基中生长速度最为缓慢，其他培养基生长速度较PDA慢。

MF-91仅仅在OA和PDA培养基中能够产生孢子，产孢量能够达到10⁶；与PDA相比OA培养基中产孢量最多，产孢量为4×10⁶/ml左右；其他培养基中没有孢子产生。

同时，通过对MF-91在不同培养基中的生长情况观察，发现该菌株在不同培养基中菌丝的密度，形状以及所产生代谢产物的颜色也各不相同。其中以PDA培养基中的血红色和OA、Peberdy培养基中的紫色最为明显，YDA、SA和MYRO则产生淡黄色代谢产物，而在PA、SA和CA培养基中不产生有明显颜色的代谢产物。

表2 培养基对MF-91营养生长和孢子产量的影响

注：表中不同的字母表示数据通过Duncan’s 比较后，在P_0.05水平上具显著性差异。

2.2.2 pH值对MF-91菌株营养生长及产孢的影响

从表3可以看出，MF-91的菌落生长和孢子产生的适合pH范围较大，在3.0—12.0菌能生长和产孢，而且最适生长范围也很大，从5.0—11.0的范围内，MF-91的生长都很好，而且菌落生长速度随pH值升高而升高，当pH值达到12.0以后菌落的生长速度显著的减慢。

从表中还可以看出，在pH值在8.0以前，随着pH的增大孢子的产量更多，8.0以后随着pH值的增加孢子产量显著的降低，pH达到12.0以后便不再产生孢子。

表3 pH值对MF-91营养生长和孢子产量的影响

温度对MF-91菌株营养生长及产孢的影响

试验表明，MF-91菌株的适合生长温度在15—40℃，最适温度30—35℃，且随着温度的升高菌落生长速度越快。当温度达到40℃时菌落生长显著变小，超过40或低于15℃，MF-91菌株生长缓慢甚至不能正常生长。

从图1中可以看出MF-91菌株的产孢温度比较窄，基本上集中在25—35℃之间，最适产孢温度在25—30℃，其他温度产孢量非常少，20℃之前或者40℃以后便没有孢子产生。

代谢产物对水稻立枯丝核菌的抑制效果

由MF-91菌株与水稻立枯丝核菌的对峙试验（图2-A）可知MF-91对水稻立枯丝核菌具有很好的抑制效果。MF-91菌株在PDB培养基中28℃黑暗振荡条件下培养能够产生大量红色代谢产物，且代谢产物呈一定的酸性。通过对水稻立枯丝核菌平板试验结果显示（图2-B、C），代谢产物的浓度在6%时，其对水稻立枯丝核菌的抑制效果显著高于300μg/ml的井冈霉素对水稻立枯丝核菌的抑制作用；当代谢产物浓度到达10%后水稻立枯丝核菌便不能够生长，抑制率达到100%。

菌株ITS测序鉴定

利用引物ITS1和ITS4，在MF-91菌株基因组DNA中扩增出一条500-600bp大小的片段。经测序，并将测序结果通过GenBank中Blast比对，利用MEGA4的邻接算法（Neighbor-joining NJ）进行系统分析并构建系统进化树。结果表明，MF-91菌株的ITS序列和C.aureum的相应序列同源性达到100%。

菌株β-tubulin测序鉴定

以T1 和T224 为引物，在MF-91 基因组DNA 中扩增出一条900－1,000bp 的片段。经回收测序，在GenBank 中进行Blast 比对，结果显示，MF-91 的β-tubulin 序列在GenBank 中的同源性较低，与同源性最高的Hypoxylon lividipigmentum的相应序列同源性仅为47%。因此，β-tubulin序列比对结果不能作为菌株MF-91的鉴定依据。综合形态学和分子生物学表明，将MF-91菌株鉴定为Chaetomium aureum。

Claims

1.用于对植物土传病害进行生物防治的一种真菌，其特征在于，该真菌包括保藏号为5290的真菌。

2.根据权利要求1所述的真菌，其特征在于，所述的土传病害包括以下病害中的一种或几种：水稻立枯丝核菌、水稻稻瘟病菌、大麦赤霉病菌、草莓炭疽病菌、黄瓜灰霉病菌、油菜菌核病菌、甜瓜蔓割病菌、甜瓜蔓枯病菌、茭白胡麻斑病菌、番茄早疫病菌及黄瓜枯萎病菌。

3.根据权利要求2所述的真菌，其特征在于，所述的土传病害包括以下病害中的一种或几种：菌株对甜瓜蔓枯病菌、油菜菌核病菌、草莓灰霉病菌和番茄早疫病菌。

4.一种培养保藏号为5290 的真菌的方法，其特征在于，该方法包括：在PDA培养基上培养菌丝或孢子，pH为3.0—12.0；温度为15—40℃。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，pH为5.0—11.0。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，温度为30—35℃。