CN102399891B - 一种鉴定或辅助鉴定小麦新疆拉面品质性状基因的pcr体系 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于鉴定或辅助鉴定小麦拉面品质性状基因的PCR体系及其应用。本发明PCR体系的引物对组为引物对组A、引物对组B和引物对组C这三个引物对组中，包括引物对C在内的至少一个引物对组；所述引物对组A中的六条引物由序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6所示DNA单链组成；所述引物对组B的六条引物由序列7、序列8、序列9、序列10、序列11和序列12所示DNA单链组成；所述引物对组C的四条引物由序列13、序列14、序列15和序列16所示DNA单链组成。本发明所提供的引物对组各引物间不存在抑制和错配，实现了相同温度一次PCR完成一组基因的鉴别，且结果可靠、特异性强，耗时短，为优质拉面小麦品种选育及加工品质改良提供依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于鉴定或辅助鉴定小麦拉面品质性状基因的PCR体系及其应用，特别涉及一种用于鉴定或辅助鉴定待测新疆冬小麦的拉面粘性及光滑性、面筋品质和色泽性状相关基因的多重PCR引物对组、试剂盒及其应用。
背景技术
面条是我国北方居民的传统食品，是人们日常主食之一。在2000多年的发展过程中，面条在不同地域形成了其特色形式。在新疆地区，拉面是当地日常主食之一，深受人们喜爱。作为鲜湿白盐面条，新疆拉面以其制作、食用方便，口感弹韧、光滑，拌菜丰富、美味等诸多优点，已逐渐走出新疆地区，被全国各地的人们所接受和喜爱。据统计，新疆地区小麦面粉年产量的80％用于制作拉面。但是，与新疆拉面在人们日常饮食中日益重要的地位相比，新疆拉面品质的评价仍以传统仪器分析和成品感官评价相结合的方法为主，直接限制了其发展。因此，创建微量、快速的优质拉面评选方法，对于拉面专用品种的栽培、选育和优质拉面的加工、评价具有重要意义。
近年来，随着生活水平的提高，人们对新疆拉面品质的要求越来越高，品质相关研究已得到重视。目前研究主要集中于与优质拉面相关的磨粉、蛋白质、淀粉、面团流变学特性等品质品指标的筛选，评价方法的改良和拉面专用品种的选育方面。因为拉面品质构成因素较复杂，与其相关的指标较多，所以通过新疆拉面品质评价方法的研究，将筛选出的指标有效应用于其品质评价，成为新疆拉面品质改良的关键环节。
新疆拉面评价指标主要包括面条色泽和感官评价两部分。面条色泽除受小麦出粉率、蛋白质含量及面粉颗粒指数等磨粉品质指标的影响外，黄色素(YP)含量和多酚氧化酶(PPO)活性对其也有显著影响(胡凤灵，何中虎，葛建贵，等.小麦品种黄色素含量和多酚氧化酶活性基因的分子标记检测.麦类作物学报[J].2011，31(1)：47-53.)。根据评价标准(穆培源，桑伟，王亮，等.新疆市售小麦面粉制作新疆拉面的加工品质特性及其专用粉品质评价指标的研究[J].麦类作物学报，2007，27(6)：1034-1041.)，优质新疆拉面最佳色泽为亮白色，而低的YP含量和PPO低的活性品种，具有较好的白度和颜色性状。籽粒或面粉YP含量主要受八氢番茄红素合酶(PSY)基因影响，与面粉和面团的白度高度负相关(Kruger J E，Matsuo R R，Presten K.A comparison of methods for theprediction of Cantonese noodle colour[J].Canadian Journal of Plant Science，1992，72：1021-1029.)，与其黄度高度正相关，低的YP含量基因型为Psy-A1b和Psy-B1b；PPO活性主要受Ppo基因影响，可以解释面条(团)颜色褐变变异的50％～70％，是引起面条(团)颜色变褐的主要原因(Kruger J E，Hatcher D W，De Pauw R.A whole seedassay for polyphenol oxidase in Canadian prairie spring wheats and its usefulness as ameasure of noodle darkening[J].Cereal Chemistry，1994，71：324-326.)，籽粒或面粉低的PPO活性基因型为Ppo-A1b和Ppo-D1a。因此，对低YP含量和PPO低活性目标基因型的鉴定，可作为新疆拉面色泽快速预测的方法。Psy-A1a为高黄色素含量基因型，Psy-A1b为低黄色素含量基因型，Psy-A1c基因型品种较罕见，其中Psy-A1b有利于提高对新疆拉面的白度，为拉面优质基因。PpoD1位点的Ppo-D1a为中等低PPO活性的基因型，可以减缓面条颜色褐变。
拉面感官评价主要包括拉面手感、面条质地、口感等项目。研究表明，蛋白质特性、淀粉特性和籽粒硬度等品质性状，可通过对面团流变学特性和淀粉糊化特性的影响在一定程度上决定拉面的感官评价结果(Yun S H，Quail K，Moss R.Physicochemicalproperties of Australian wheat flours for white salted noodles[J].Journal of Cereal Sciences，1996，23：181-189.)。
蛋白质的数量与质量对面条品质有重要影响，其质量主要是指面粉中醇溶蛋白与麦谷蛋白的构成及比例，不同的蛋白质构成赋予了小麦籽粒蛋白质不同的质量，其中，高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)和低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)的组成与面团的粘弹性及延伸性密切相关，在一定程度上决定了面条的品质。适合新疆拉面制作的面粉一般为中筋，且具有较好的延伸性。卢静等人研究发现(芦静，黄天荣，聂莉小麦高分子量谷蛋白亚基及1B/1R易位系对新疆拉面品质性状的影响[J].新疆农业科学，2010，47(10)：1909-1917.)，HMW-GS 7+8、5+10、2+10等对新疆拉面的品质有正向效应，但未对Glu-A1位点的优质HMW-GS和优质LMW-GS予以说明。对优质拉面品种的HMW-GS和LMW-GS的分子标记检测发现，除已发现的优质拉面亚基类型外，2*和Glu-B3a等亚基类型对新疆拉面的品质也有一定的正向效应。Glu-A1位点的Ax2*基因表达的2*亚基通过提高面筋强度(Payne P I，Lawrence G J.Catalogue of alleles forthe complex gene loci，Glu-A1，Glu-B1，and Glu-D1 which code for high molecular weightsubunits of glutenin in hexaploid wheat[J].Cereal Research Communications，1983，11：29-35.)，对拉面品质有一定的贡献。此外，1B/1R易位对小麦的蛋白特性也有显著影响。小麦的1B染色体短臂被黑麦的1R染色体短臂取代而形成小麦-黑麦1B/1R易位系。易位使普通小麦1B染色体短臂上LMW-GS(Glu-B3位点)和醇溶蛋白(Gli-B1位点)缺失，或被品质较差的黑麦碱(secalin基因编码)取代，导致面团粘性增大，强度降低，对面团流变学特性和面条品质都有极显著的负面影响(Wieser H，Kieffer R，Lelley T.The influence of 1B/1R chromosome translocation on gluten protein compositionand technological properties ofbread wheat[J].J Sci Food Agric，2000，80：1 640-1 647.)。芦静(芦静，黄天荣，聂莉.小麦高分子量谷蛋白亚基及1B/1R易位系对新疆拉面品质性状的影响[J].新疆农业科学，2010，47(10)：1909-1917.)等研究发现，与非1B/1R易位系(不含有ω-secalin基因)相比，1B/1R易位系(含有ω-secalin基因)的各项加工品质均显著降低，大多不能满足优质拉面制作的要求，在新疆拉面品质育种中应当淘汰。
LMW-GS对小麦面粉加工品质起着重要的作用，主要影响面筋的强度和延展性(Cornish GB，Bekes F，Allen HM，et al.Flour proteins linked to quality traits in anAustralian doubled haploid wheat population[J].Aust J Agric Res，2001，52：1339-1348.)。He等(He ZH，Liu L，Xia XC，et al，Composition of HMW and LMW glutenin subunitsand their effects on dough properties，pan bread，and noodle quality of Chinese breadwheats[J].Cereal Chem，2005，82：345-350.)和Liu等(Liu L，He ZH，Yah J，et al.Allelicvariaion at the Glu-1 and Glu-3 loci presence of the 1B/1R translocation，and their effectson mixographic properties in Chinese bread wheat[J].Euphytica，2005，142：197-204.)对中国小麦品种的Glu-1和Glu-3位点的等位变异做了较详细的研究，表明Glu-A3和Glu-B3位点与面包和面条品质相关，其中Glu-B3位点的d和b等位基因对面团延展性的作用大于其他等位基因；在对和面时间的贡献上，表现为Glu-D1＞Glu-B3＞Glu-A1＝Glu-B1＝Glu-A3；对面团耐揉性而言，Glu-D1＞Glu-B3＝Glu-B1＞Glu-A3＞Glu-A1；对SDS沉淀值的影响大小依次为Glu-B3＞Glu-B1＞Glu-A1＞Glu-D1＞Glu-A3。在提高面团最大抗延阻力方面，不同的等位变异具有不同的效应，在Glu-A3位点，b＞d＞e＞c，在Glu-B3位点，i＞b＝a＞e＝f＝g＝h＞c，在Glu-D3位点，e＞b＞a＞c＞d(Gupta RB，Singh NK，Shepherd KW.The cumulaive effect of allelic variaion in LMWand HMW glutenin subunits on dough properties in the progeny of two bread wheats[J].Theor Appl Genet，1989，77：57-64.Gupta RB，Békés F，Wrigley CW.Prediction of physicaldough properties from glutenin subunit composition in bread wheats[J].Cereal Chem，1991，68：328-333.Metakovsky EV，Wrigley CW，Békés F，et al.Gluten polypeptides as usefulgenetic markers of dough quality in Australian wheats[J].Aust J Agric Res，1990，41：289-306.)。而且近来很多育种学以及数量遗传学等方面的研究认为，LMW-GS对提高面团的强度和延展性，进而改良面包的品质方面具有很高的正效应(Nelson JC，Andreescu C，Breseghello F，et al.Quantitative trait locus analysis of wheat quality traits[J].Euphytica，2006，149：145-159.Li Y，Song Y，Zhou R，et al.Detection of QTLs forbread-making quality in wheat using a recombinant inbred line population[J].PlantBreeding，2009，128：235-243.Mann G，Diffey S，Cullis B，et al.Genetic control of wheatquality：interactions between chromosomal regions determining protein content andcomposition，dough rheology，and sponge and dough baking properties[J].Theor ApplGenet，2009，118：1519-1537.Oury F-X，Chiron H，Faye A，et al.The prediction of breadwheat quality：joint use of the phenotypic information brought by technological tests and thegenetic information brought by HMW and LMW glutenin subunits[J].Euphytica，2010，171：87-109.Raman R，Allen H，Diffey S，et al.Localization of quantitative trait loci for qualityattributes in a doubled haploid population of wheat(Triticum aestivum L.)[J].Genome，2009，52：701-715.)。
淀粉的含量、直链淀粉与支链淀粉的比例对面条的柔软度、弹性和光滑度有很大影响(Toyokawa H，Rubenthaler G L，Powers J R，et al.Japanese noodle qualities I.Flourcomponents[J].Cereal Chem，1989，66(5)：387-391.)，对面条的感官评价有重要影响。在小麦籽粒淀粉合成中，糯蛋白(Waxy)是合成直链淀粉的关键酶(Miura H，Tanii S，Nakamura T，et al.Genetic control of amylase content in wheat endosperm starch anddifferential effects of three Wx genes[J].Theor App1 Genet，2000，100(1)：32-38.)，由Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1三个基因编码合成(罗光彬，黄修文，尤明山，等.小麦Wx基因研究进展[J].粮油食品科技，2010，18(6)：1-4.)，它主要是通过直链淀粉含量影响面条品质的。一般认为直链淀粉含量低的面粉做出的面条评分高(赵俊晔，于振文.小麦籽粒蛋白质和淀粉代谢及其与品质形成关系的研究进展[J].麦类作物学报，2005，25(3)：106-111.)。在普通小麦的三个Wx蛋白亚基中，同样缺失单个亚基的情况下，缺失Wx-B1亚基使直链淀粉减少得最多，同时也使得膨胀势和峰值粘度增高幅度最大(Miura H，Araki E，Tarui S.Amylose synthesis capacity of the three Wx gene of wheat cv.Chinese Spring[J].Euphytica，1999，108(2)：91-95.Araki E，Miura H，Sawada S.Differential effects of the nullalleles at the three Wx loci on the starch-pasting properties of wheat[J].Theor App1 Genet，1991，97：199-205.Yamamori M，Quynh N T.Differential effects of Wx-A1，Wx-B1 andWx-D1 protein deficiencies on apparent amylase content and starch pasting properties incommon wheat[J].Theor App1 Genet，1994，89：276-280.)，面粉的面条加工品质较好(刘建军，何中虎，杨金，等.小麦品种淀粉特性变异及其与面条品质关系的研究[J].中国农业科学，2003，36(1)：7-12.)。
籽粒硬度的主效基因puroindoline位于5D染色体短臂，分为Pina和Pinb两种类型，其不同变异对小麦磨粉品质和食品加工品质有重要的影响。Chen等(陈锋，尚晓丽，董中东，等.中国小麦历史品种puroindoline基因等位变异检测[J].麦类作物学报，2011，31(3)：389-394)研究表明，Pinb-D1b比Pina-D1b类型出粉率高、灰份低、具有更好的磨粉品质，同时前者的馒头、面条和面包加工品质也均优于Pina-D1b和野生型。
新疆拉面的传统评价方法需要多种分析仪器、样品用量大、测定周期长，且很难实现大量材料、多个指标的同时检测，制约了新疆拉面的品质改良和评价。随着与小麦加工品质相关基因的克隆及其分子标记的开发，利用特异性引物对品质基因进行快速PCR检测的方法得到广泛应用。但新疆拉面的品质改良涉及多个基因，传统的PCR方法一般一次只能检测一个或少数几个基因，很难满足拉面专用品种的选育及其后续筛选、加工、评价的需求。
发明内容
本发明的目的是提供用于鉴定或辅助鉴定待测小麦拉面品质性状相关基因的多重PCR引物对组、试剂盒，以及利用所述多重PCR引物对组鉴定或辅助鉴定待测小麦拉面品质性状的方法。
本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定待测小麦拉面品质性状相关基因的多重PCR引物对组为如下a1)或a2)或a3)的引物对组：
a1)由引物对组A、引物对组B和引物组C组成的引物对组；
a2)由两个引物对组组成，其中一个引物对组为所述引物对组C，另外一个引物对组为所述引物对组A或所述引物对组B；
a3)引物对组C；
所述引物对组A中的引物对均特异于拉面色泽相关基因，具体由特异于Psy-A1基因的两个引物对，和特异于Ppo-D1基因的一个引物对组成；所述引物对组B中的引物对均特异于拉面面筋强度、面筋质量和磨粉品质相关基因，具体由特异于Ax2*基因的一个引物对，特异于Pinb-D1b基因的一个引物对，和特异于ω-secalin基因的一个引物对组成；所述引物对组C均特异于拉面面筋强度、粘性和光滑性相关基因，具体由特异于所述Glu-B3a基因的一个引物对，和特异于所述Wx-B1基因的一个引物对组成。
所述引物对组A中，所述特异于Psy-A1基因的两个引物对分别为序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的引物对1，以及序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的引物对2；所述特异于Ppo-D1基因的一个引物对为序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的引物对3；
所述引物对组B中，所述特异于Ax2*基因的一个引物对为序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成的引物对4；所述特异于PinbD1b基因的一个引物对为序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA组成的引物对5；所述特异于ω-secalin基因的一个引物对为序列表中序列11和序列12所示的两条单链DNA组成的引物对6。
所述引物对组C中，所述特异于Glu-B3a基因的一个引物对为序列表中序列13和序列14所示的两条单链DNA组成的引物对7；所述特异于Wx-B1基因的一个引物对为序列表中序列15和序列16所示的两条单链DNA组成的引物对8。
其中，序列1由20个核苷酸组成；序列2由22个核苷酸组成；序列3由20个核苷酸组成；序列4由20个核苷酸组成；序列5由20个核苷酸组成；序列6由20个核苷酸组成；序列7由21个核苷酸组成；序列8由20个核苷酸组成；序列9由21个核苷酸组成；序列10由18个核苷酸组成；序列11由20个核苷酸组成；序列12由20个核苷酸组成；序列13由20个核苷酸组成；序列14由19个核苷酸组成；序列15由25个核苷酸组成；序列16由22个核苷酸组成。
本发明中，所述Psy-A1基因有三个等位基因，分别是Psy-A1a、Psy-A1b和Psy-A1c；所述Ppo-D1基因有两个等位基因，分别是Ppo-D1a和Ppo-D1b；所述Wx-B1基因有两个等位基因，分别是Wx-B1a和Wx-B1b。
所述引物对组A中每个引物对的两条引物在PCR反应体系中等量使用，且所述引物对1，所述引物对2和所述引物对3在PCR反应体系中的摩尔比为1∶4∶1；所述特异引物对组B中每个引物对的两条引物在PCR反应体系中等量使用，且所述引物对4，所述引物对5和所述引物对6在PCR反应体系中的摩尔比为1∶1∶1；所述特异引物对组C中每个引物对的两条引物在PCR反应体系中等量使用，且所述引物对7和所述引物对8在PCR反应体系中的摩尔比为5∶2。
含有所述用于鉴定或辅助鉴定待测小麦拉面品质性状相关基因的多重PCR引物对组的试剂盒也属于本发明的保护范围。
所述用于鉴定或辅助鉴定待测小麦拉面品质性状相关基因的多重PCR引物对组的制备方法也属于本发明的保护范围。该制备方法具体可包括将所述用于鉴定或辅助鉴定待测小麦拉面品质性状相关基因的多重PCR引物对组中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装的步骤。
所述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。该制备方法具体可包括如下步骤：将所述用于鉴定或辅助鉴定待测小麦拉面品质性状相关基因的多重PCR引物对组中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装后，与下述物质中的至少一种包装在同一试剂盒内：PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和4种dNTP。
下述a1)-a4)中任一种的方法也属于本发明的保护范围：
a1)鉴定或辅助鉴定待测小麦含有Psy-A1a、Psy-A1b和Psy-A1c这三种基因中哪一种、含有Ppo-D1a和Ppo-D1b这两种基因中哪一种，是否含有Ax2*基因、Pinb-D1b基因和ω-secalin基因这三种基因中的至少一种，是否含有Glu-B3a基因，以及含有Wx-B1a基因和Wx-B1b基因这两种基因中哪一种；
a2)鉴定或辅助鉴定待测小麦含有Psy-A1a、Psy-A1b和Psy-A1c这三种基因中哪一种、含有Ppo-D1a和Ppo-D1b这两种基因中哪一种，是否含有Glu-B3a基因，以及含有Wx-B1a基因和Wx-B1b基因这两种基因中哪一种；
a3)鉴定或辅助鉴定待测小麦是否含有Ax2*基因、Pinb-D1b基因和ω-secalin基因这三种基因中的至少一种，是否含有Glu-B3a基因，以及含有Wx-B1a基因和Wx-B1b基因这两种基因中哪一种；
a4)鉴定或辅助鉴定待测小麦是否含有Glu-B3a基因，以及含有Wx-B1a基因和Wx-B1b基因这两种基因中哪一种；
其特征在于：所述a1)的方法包括下述(1)和(2)的步骤：
所述(1)为如下b1)、b2)和b3)：
b1)以待测小麦的基因组DNA为模板，用权利要求1或3所述引物对组中的所述引物对组A进行PCR反应，所述PCR反应的退火温度为60℃；
b2)以待测小麦的基因组DNA为模板，用权利要求1或3所述引物对组中所述引物对组B进行PCR反应，所述PCR反应的退火温度为从62℃起，每进行1个PCR反应循环下降0.1℃；在本发明的实施例中，用所述引物对组B进行PCR反应共进行了35个循环；
b3)以待测小麦的基因组DNA为模板，用权利要求1或3所述引物对组中的所述引物对组C进行PCR反应，所述PCR反应的退火温度为55.5℃；
(2)检测步骤(1)得到的PCR产物的大小，按照如下方法根据PCR产物确定所述待测小麦含有Psy-A1a、Psy-A1b和Psy-A1c这三种基因中哪一种，含有Ppo-D1a和Ppo-D1b这两种基因中哪一种，是否含有Ax2*基因、Pinb-D1b基因和ω-secalin基因这三种基因中的至少一种，是否含有Glu-B3a基因，以及含有Wx-B1a基因和Wx-B1b基因这两种基因中哪一种：
以所述引物对组A进行PCR反应的产物中，如果同时含有大小为1686bp和194bp的两个DNA片段，所述待测小麦含有Psy-A1a基因或候选含有Psy-A1a基因；如果同时含有大小为1686bp和231bp的两个DNA片段，所述待测小麦含有Psy-A1b基因或候选含有Psy-A1b基因；如果同时含有大小为1001bp和194bp的两个DNA片段，所述待测小麦含有Psy-A1c基因或候选含有Psy-A1c基因；如果含有大小为713bp的DNA片段，所述待测小麦含有Ppo-D1a基因或候选含有Ppo-D1a基因；如果不含有大小为713bp的DNA片段，所述待测小麦含有Ppo-D1b基因或候选含有Ppo-D1b基因；
以所述引物对组B的进行PCR反应的产物中，如果含有大小为1319bp的DNA片段，所述待测小麦含有Ax2*基因或候选含有Ax2*基因；如果不含有大小为1319bp的DNA片段，所述待测小麦不含有Ax2*基因或候选不含有Ax2*基因；如果含有大小为250bp的DNA片段，所述待测小麦含有Pinb-D1b基因或候选含有Pinb-D1b基因；如果不含有大小为250bp的DNA片段，所述待测小麦不含有Pinb-D1b基因或候选不含有Pinb-D1b基因；如果含有大小为1067bp的DNA片段，所述待测小麦含有ω-secalin基因或候选含有ω-secalin基因；如果不含有大小为1067bp的DNA片段，所述待测小麦不含有ω-secalin基因或候选不含有ω-secalin基因；
以所述引物对组C的进行PCR反应的产物中，如果含有大小为1095bp的DNA片段，所述待测小麦含有Glu-B3a基因或候选含有Glu-B3a基因；如果不含有大小为1095bp的DNA片段，所述待测小麦不含有Glu-B3a基因或候选不含有Glu-B3a基因；如果含有大小为425bp的DNA片段，所述待测小麦含有Wx-B1a基因或候选含有Wx-B1a基因；如果不含有大小为425bp的DNA片段，所述待测小麦含有Wx-B1b基因或候选含有Wx-B1b基因；
所述a2)的方法包括下述(3)和(4)的步骤：
所述(3)为如下c1)和c2)：
c1)以待测小麦的基因组DNA为模板，用权利要求2中的1)或权利要求3所述引物对组中的所述引物对组C进行PCR反应，所述PCR反应的退火温度为55.5℃；
c2)以待测小麦的基因组DNA为模板，用权利要求2中的1)或3所述引物对组中的所述引物对组A进行PCR反应，所述PCR反应的退火温度为60℃；
(4)检测步骤(3)得到的PCR产物的大小，所述检测步骤(3)得到的PCR产物的大小的方法同步骤(2)；
所述a3)的方法包括下述(5)和(6)的步骤：
所述(5)为如下d1)和d2)：
d1)以待测小麦的基因组DNA为模板，用权利要求2中的1)或3所述引物对组中的所述引物对组C进行PCR反应，所述PCR反应的退火温度为55.5℃；
d2)以待测小麦的基因组DNA为模板，用权利要求2中的1)或3所述引物对组中所述引物对组B进行PCR反应，所述PCR反应的退火温度为从62℃起，每进行1个PCR反应循环下降0.1℃；在本发明的实施例中，用所述引物对组B进行PCR反应共进行了35个循环；
(6)检测步骤(5)得到的PCR产物的大小，所述检测步骤(5)得到的PCR产物的大小的方法同步骤(2)；
所述a4)的方法包括下述(7)和(8)的步骤：
(7)以待测小麦的基因组DNA为模板，用权利要求2中的2)或3所述引物对组中的所述引物对组C进行PCR反应，所述PCR反应的退火温度为55.5℃；
(8)检测步骤(7)得到的PCR产物的大小，所述检测步骤(7)得到的PCR产物的大小的方法同步骤(2)。
本发明的另一个目的是提供一种培育拉面小麦品种的方法。
该方法包括采用如下a)-g)中至少一种的小麦作为亲本进行育种的步骤：
a)含有或候选含有Psy-A1b基因；
b)含有或候选含有Ppo-D1a基因；
c)含有或候选含有Ax2*基因；
d)含有或候选含有Pinb-D1b基因；
e)不含或候选不含有ω-secalin基因；
f)含有或候选含有Glu-B3a基因；
g)含有或候选含有Wx-B1b基因。
从众多小麦品种中选择满足a)-g)中至少一项的小麦的方法，即为上述鉴定或辅助鉴定待测小麦含有Psy-A1a、Psy-A1b和Psy-A1c这三种基因中哪一种，含有Ppo-D1a和Ppo-D1b这两种基因中哪一种，是否含有Ax2*基因、Pinb-D1b基因和ω-secalin基因这三种基因中的至少一种，是否含有Glu-B3a基因，以及含有Wx-B1a基因和Wx-B1b基因这两种基因中哪一种的方法。所选择的小麦满足上述a)-g)七项中的项数越多，表示所选择的小麦越适合制作拉面。
在本发明的实施例中，所述待测小麦具体为新疆冬小麦，如小麦品种(系)新冬16号、新冬20号、冀麦26、小偃54、巴冬2号、新乌克兰83、新乌克兰84、北系11、燕大1885、新冬24号、新冬27号、新冬28号、奎冬4号、冀麦24、冀麦31、石冬8号、89-2012、新冬22号、新冬23号、藁优8901、HD04-23、79-18、新冬14号、新冬18号、85(1)、89(35)、80182、花91-26、89-44、新冬2号、新冬7号、华北497、91(28)、新冬19号、石冬9号和87YF5等。利用本发明对上述小麦品种(系)进行鉴定或辅助鉴定后，发现小麦品种冀麦31同时具有拉面色泽优质基因Psy-A1b和Ppo-D1a，小麦品种石冬8号具有拉面面筋强度、面筋质量和磨粉品质优质基因Ax2*和Pinb-D1b的同时，又不含有影响拉面品质的ω-secalin基因，小麦品种(系)华北497和冀麦31同时具有拉面粘性和光滑性优质基因Glu-B3a和Wx-B1b。
本发明所提供的引物对组A或引物对组B或引物对组C的各引物对之间不存在相互抑制作用和错配，检测品种(系)的结果可靠、重复性好，成本低。本发明所提供的引物对组A或引物对组B或引物对组C均选用同样的退火温度，实现了相同温度一次PCR完成一组基因的鉴别，且特异性强，检测过程耗时短。将本发明含有引物对组A或引物对组B或引物对组C的多重PCR体系用于小麦品质育种的亲本评价和杂交后代优质基因的聚合，将会提高优质拉面专用小麦品种评价和选育的效率，加快拉面专用小麦品种的加工品质改良。
附图说明
图1为Psy-A1a、Psy-A1b、Psy-A1c和Ppo-D1a基因标记的多重PCR琼脂糖凝胶电泳图。
图2为Ax2*、Pinb-D1b和ω-secalin基因标记的多重PCR琼脂糖凝胶电泳图。
图3为Glu-B3a、Wx-B1a和Wx-B1b基因标记的多重PCR琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、拉面色泽相关基因的多重PCR检测
本实施例的多重PCR引物对组由特异于Psy-A1基因的两个引物对，和特异于Ppo-D1基因的一个引物对组成；其中，所述特异于Psy-A1基因的两个引物对分别为序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的引物对1，以及序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的引物对2；所述特异于Ppo-D1基因的一个引物对为序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的引物对3。
本实施例的多重PCR引物对组可同时检测Psy-A1和Ppo-D1两个基因位点的5种基因型Psy-A1a、Psy-A1b、Psy-A1c、Ppo-D1a和Ppo-D1b。含有Psy-A1a基因的材料，PCR同时扩增出1686bp和194bp的两个条带；含有Psy-A1b基因的材料，PCR同时扩增出1686bp和231bp的两个条带；含有Psy-A1c基因的材料，PCR同时扩增出1001bp和194bp的两个条带；含有Ppo-D1a基因的材料，PCR扩增出713bp的一条带；含有Ppo-D1b基因的材料，PCR扩增无713bp的条带。
一、已知基因型小麦品种拉面色泽相关基因的多重PCR扩增
1、小麦基因组的制备
采用CTAB法对4份已知基因型的小麦品种(系)进行基因组DNA的提取，得到对应于4份已知基因型的小麦品种(系)的基因组DNA，作为拉面色泽相关基因多重PCR扩增的模板。其中，4份已知基因型的小麦品种(系)为新冬16、新冬20、冀麦26和小偃54。王亮等(王亮，穆培源，徐红军，等.新疆小麦品种黄色素含量基因(Psy-A1)等位变异的分子检测[J].麦类作物学报，2009，29(4)：782-786.王亮，穆培源，徐红军，等.新疆小麦品种中多酚氧化酶(PPO)活性基因等位变异的分布[J].麦类作物学报，2008，28(5)：766-771.)对这四个小麦品种(系)的Psy-A1和Ppo-D1基因的基因型进行了分子标记检测，详见表1。
表1已知基因型小麦品种(系)拉面色泽相关基因的基因型
2、多重PCR扩增小麦品种拉面色泽相关基因
以上述步骤1制备的4份已知基因型的小麦品种(系)的基因组DNA分别为模板，利用表2中的引物对组合物进行多重PCR扩增。
PCR反应总体系为20μL，其中，DNA模板100-200ng，MasterMix(含有DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、4种dNTP)(北京康为世纪生物科技有限公司)10μL(使得20μL的PCR反应体系中每种dNTP的浓度为200μM)，各引物在PCR反应总体系中的终浓度为：引物对1中的序列1和序列2所示的两条DNA单链在PCR反应总体系中的终浓度均为0.05μM；引物对2中的序列3和序列4所示的两条DNA单链在PCR反应总体系中的终浓度均为0.2μM；引物对3中的序列5和序列6所示的两条DNA单链在PCR反应总体系中的终浓度均为0.05μM。
PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性35s，60℃退火35s，72℃延伸1min30s，扩增反应进行37个循环；72℃延伸8min；4℃，保温结束。
PCR扩增在PTC-200型PCR仪上进行，用1×TAE在2％的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳时的电压为150V，电泳时间为40min，电泳结束经溴化乙锭染色后在凝胶成像系统下观察照相。
表2拉面色泽相关基因扩增引物序列及其预期扩增片段大小
注：“Psy-A1a或Psy-A1c/Psy-A1b”和“194/231”表示：如果PCR产物中含有大小为194bp的DNA片段，则Psy-A1基因的基因型为Psy-A1a或Psy-A1c；如果PCR产物中含有大小为231bp的DNA片段，则Psy-A1基因的基因型为Psy-A1b；“Psy-A1a或Psy-A1b/Psy-A1c”和“1686/1001”表示：如果PCR产物中含有大小为1686bp的DNA片段，则Psy-A1基因的基因型为Psy-A1a或Psy-A1b；如果PCR产物中含有大小为1001bp的DNA片段，则Psy-A1基因的基因型为Psy-A1c；“Ppo-D1a/Ppo-D1b”和“713/-”表示：如果PCR产物中含有大小为713bp的DNA片段，则Ppo-D1基因的基因型为Ppo-D1a；如果PCR产物中不含有大小为713bp的DNA片段，则Ppo-D1基因的基因型为Ppo-D1b。
3、已知基因型小麦品种拉面色泽相关基因的多重PCR扩增结果
电泳结果如图1的泳道1-泳道4所示：小麦品种(系)新冬20号经上述多重PCR扩增后，得到大小约为1686bp、194bp和713bp的三条带，这说明小麦品种(系)新冬20含有Psy-A1a和Ppo-D1a基因；小麦品种(系)新冬16号经上述多重PCR扩增后，得到大小约为1686bp和194bp的两条带，这说明小麦品种(系)新冬16含有Psy-A1a和Ppo-D1b基因；小麦品种(系)冀麦26经上述多重PCR扩增后，得到大小约为1686bp、231bp和713bp的三条带，这说明小麦品种(系)冀麦26含有Psy-A1b和Ppo-D1a基因；小麦品种(系)小偃54经上述多重PCR扩增后，得到大小约为1686bp和231bp的两条带，这说明小麦品种(系)小偃54含有Psy-A1b和Ppo-D1b基因。上述结果与表1完全一致，这说明本实施例的多重PCR引物对组能够同时、快速、准确的检测小麦品种拉面色泽相关基因Psy-A1和Ppo-D1两个位点的5种基因型Psy-A1a、Psy-A1b、Psy-A1c、Ppo-D1a和Ppo-D1b。这将有利于遴选同时含有Psy-A1b和Ppo-D1a基因型的小麦品种或面粉，进行拉面色泽遗传改良或评价。
二、待测基因型小麦品种拉面色泽相关基因的多重PCR扩增
1、小麦基因组的制备
采用CTAB法对13份待测基因型的小麦品种(系)进行基因组DNA的提取，得到对应于13份待测基因型的小麦品种(系)的基因组DNA，作为拉面色泽相关基因多重PCR扩增的模板。其中，13份待测基因型的小麦品种(系)为巴冬2号、新乌克兰83、新乌克兰84、北系11、燕大1885、新冬24号、新冬27号、新冬28号、奎冬4号、冀麦24、冀麦31、石冬8号和89-2012。
2、多重PCR扩增小麦品种拉面色泽相关基因
以上述步骤1制备的13份待测基因型的小麦品种(系)的基因组DNA分别为模板，利用表2中的引物对组合物进行多重PCR扩增。
PCR反应体系及反应程序同步骤一中2。
3、待测基因型小麦品种拉面色泽相关基因的多重PCR扩增结果
电泳结果如图1的泳道5-泳道17所示：小麦品种(系)巴冬2号经上述多重PCR扩增后，得到大小约为1001bp和194bp的两条带，这说明小麦品种(系)巴冬2号含有Psy-A1c和Ppo-D1b基因；小麦品种(系)新乌克兰83、新乌克兰84、北系11、燕大1885、新冬24号、新冬27号、新冬28号、冀麦24和89-2012经上述多重PCR扩增后，均得到大小约为1686bp、194bp和713bp的三条带，这说明小麦品种(系)新乌克兰83、新乌克兰84、北系11、燕大1885、新冬24号、新冬27号、新冬28号、冀麦24和89-2012均含有Psy-A1a和Ppo-D1a基因；小麦品种(系)奎冬4号和石冬8号经上述多重PCR扩增后，均得到大小约为1686bp和194bp的两条带，这说明小麦品种(系)奎冬4号和石冬8号均含有Psy-A1a和Ppo-D1b基因；小麦品种(系)冀麦31经上述多重PCR扩增后，得到大小约为1686bp、231bp和713bp的三条带，这说明小麦品种(系)冀麦31含有Psy-A1b和Ppo-D1a基因。上述结果与传统的单重PCR结果相一致。并且，多重PCR扩增产物经回收、测序，与目标基因进行序列比对，是同源序列。通过基因测序，进一步证实了上述多重PCR结果的准确性。
实施例2、拉面面筋强度、面筋质量和磨粉品质相关基因的多重PCR检测
本实施例的多重PCR引物对组由特异于Ax2*基因的一个引物对，特异于Pinb-D1b基因的一个引物对，和特异于ω-secalin基因的一个引物对组成；其中，所述特异于Ax2*基因的一个引物对为序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成的引物对4；所述特异于PinbD1b基因的一个引物对为序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA组成的引物对5；所述特异于ω-secalin基因的一个引物对为序列表中序列11和序列12所示的两条单链DNA组成的引物对6。
本实施例的多重PCR引物对组可用于同时检测Ax2*、Pinb-D1b和ω-secalin基因。在Glu-A1位点含有Ax2*基因的材料中，PCR扩增出大小为1319bp的一条带；在含有Pinb-D1b基因的材料中，PCR扩增出大小为250bp的一条带；在含有ω-secalin基因的材料，PCR扩增出大小为1067bp的一条带。
一、已知基因型小麦品种拉面面筋强度、面筋质量和磨粉品质相关基因的多重PCR扩增
1、小麦基因组的制备
采用CTAB法对5份已知基因型的小麦品种(系)进行基因组DNA的提取，得到对应于5份已知基因型的小麦品种(系)的基因组DNA，作为拉面面筋强度、面筋质量和磨粉品质相关基因多重PCR扩增的模板。其中，5已知基因型的小麦品种(系)依次为新冬22号、新冬23号、藁优8901、HD04-23和79-18。王亮等(王亮，穆培源，徐红军，等.新疆小麦品种高分子量麦谷蛋白亚基组成分析[J].麦类作物学报，2008，28(3)：430-435.王亮，穆培源，桑伟，等.新疆小麦品种籽粒硬度及puroindoline基因等位变异的分子检测[J].麦类作物学报，2010，30(1)：17-22.王亮，穆培源，徐红军，等.新疆小麦1BL/1RS易位和Dx5基因的多重PCR检测及其面筋品质分析[J].麦类作物学报，2011，31(3)：469-474.)对这五个小麦品种(系)的Glu-A1和Pinb-D1基因的基因型，以及是否含有ω-secalin基因进行了分子标记检测，详见表3。
表3已知基因型小麦品种(系)拉面面筋强度、面筋质量和磨粉品质相关基因的基因型
注：“+”表示含有ω-secalin基因；“-”表示不含有Ax2基因或不含有ω-secalin基因。
2、多重PCR扩增小麦品种拉面面筋强度、面筋质量和磨粉品质相关基因
以上述步骤1制备的5份已知基因型的小麦品种(系)的基因组DNA分别为模板，利用表4中的引物对组合物进行多重PCR扩增。
PCR反应总体系为20μL，其中，DNA模板100-200ng，MasterMix(含有DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、4种dNTP)(北京康为世纪生物科技有限公司)10μL(使得20μL的PCR反应体系中每种dNTP的浓度为200μM)，作为引物的每条单链DNA在PCR反应总体系中的终浓度均为0.1μM。
PCR反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性45s，退火温度从62℃起，随着PCR反应的进行，每增加1个循环所述退火温度下降0.1℃，每个循环的退火时间均为60s，72℃延伸1min，扩增反应进行35个循环；72℃延伸8min；4℃，保温结束。
PCR扩增在PTC-200型PCR仪上进行，用1×TAE在2％的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳时的电压为160V，电泳时间为30min，电泳结束经溴化乙锭染色后在凝胶成像系统下观察照相。
表4拉面面筋强度、面筋质量和磨粉品质相关基因扩增引物序列及预期扩增片段大小
3、已知基因型小麦品种拉面面筋强度、面筋质量和磨粉品质相关基因的多重PCR扩增结果
电泳结果如图2的泳道1-泳道5所示：小麦品种(系)新冬22号和HD04-23经上述多重PCR扩增后，均得到大小约为1319bp和250bp的两条带，这说明小麦品种(系)新冬22号和HD04-23均含有Ax2*基因和Pinb-D1b基因；小麦品种(系)藁优8901经上述多重PCR扩增后，无扩增条带出现，这说明小麦品种(系)藁优8901不含有Ax2*、Pinb-D1b和ω-secalin基因；小麦品种(系)新冬23号经上述多重PCR扩增后，得到大小约为250bp的一条带，这说明小麦品种(系)新冬23号含有PinbD1b基因；小麦品种(系)79-18经上述多重PCR扩增后，得到大小约为250bp和1067bp的两条带，这说明小麦品种(系)79-18含有PinbD1b基因和ω-secalin基因。上述结果与表3完全一致，这说明本实施例的多重PCR引物对组能够同时、快速、准确的检测小麦品种拉面面筋强度、面筋质量和磨粉品质相关基因Ax2*、Pinb-D1b和ω-secalin，评价样品是否具有制作优质拉面所需要面筋强度，面筋质量和磨粉品质。
二、待测基因型小麦品种拉面面筋强度、面筋质量和磨粉品质相关基因的多重PCR扩增
1、小麦基因组的制备
采用CTAB法对12份待测基因型的小麦品种(系)进行基因组DNA的提取，得到对应于12份待测基因型的小麦品种(系)的基因组DNA，作为拉面色泽相关基因多重PCR扩增的模板。其中，12份待测基因型的小麦品种(系)为新冬14号、新冬24号、新冬28号、新冬18号、冀麦26、奎冬4号、石冬8号、85(1)、89(35)、80182、花91-26和89-44。
2、多重PCR扩增小麦品种拉面面筋强度、面筋质量和磨粉品质相关基因
以上述步骤1制备的12份待测基因型的小麦品种(系)的基因组DNA分别为模板，利用表4中的引物对组合物进行多重PCR扩增。
PCR反应体系及反应程序同步骤一中2。
3、待测基因型小麦品种拉面面筋强度、面筋质量和磨粉品质相关基因的多重PCR扩增结果
电泳结果如图2的泳道6-泳道17所示：小麦品种(系)新冬14号经上述多重PCR扩增后，得到大小约为1319bp的一条带，这说明小麦品种(系)新冬14含有Ax2*基因；小麦品种(系)新冬24号经上述多重PCR扩增后，得到大小约为1067bp的一条带，这说明小麦品种(系)新冬24号含有ω-secalin基因；小麦品种(系)新冬28号和89(35)经上述多重PCR扩增后，均得到大小约为250bp的一条带，这说明小麦品种(系)新冬28号和89(35)均含有Pinb-D1b基因；小麦品种(系)新冬18号、冀麦26、80182和89-44经上述多重PCR扩增后，均未扩增出任何条带，这说明小麦品种(系)新冬18号、冀麦26、80182和89-44均不含有Ax2*、Pinb-D1b和ω-secalin基因；小麦品种(系)奎冬4号和花91-26经上述多重PCR扩增后，均得到大小约为1319bp、250bp和1067bp的三条带，这说明小麦品种(系)奎冬4号和花91-26均含有Ax2*、Pinb-D1b和ω-secalin基因；小麦品种(系)石冬8号经上述多重PCR扩增后，得到大小约为1319bp和250bp的两条带，这说明小麦品种(系)石冬8号含有Ax2*基因和Pinb-D1b基因；小麦品种(系)85(1)经上述多重PCR扩增后，得到大小约为250bp和1067bp的两条带，这说明小麦品种(系)85(1)含有Pinb-D1b和ω-secalin基因。上述结果与传统的单重PCR结果相一致。并且，多重PCR扩增产物经回收、测序，与目标基因进行序列比对，是同源序列。通过基因测序，进一步证实了上述多重PCR结果的准确性。
实施例3、拉面面筋强度、粘性和光滑性相关基因的多重PCR检测
本实施例的多重PCR引物对组由特异于Glu-B3a基因(使拉面中等面筋强度相关基因)的一个引物对，和特异于Wx-B1基因(拉面粘性和光滑性相关基因)的一个引物对组成；其中，所述特异于Glu-B3a基因的一个引物对为序列表中序列13和序列14所示的两条单链DNA组成的引物对7；所述特异于Wx-B1基因的一个引物对为序列表中序列15和序列16所示的两条单链DNA组成的引物对8。
本实施例的多重PCR引物对组可同时检测Glu-B3a、Wx-B1a和Wx-B1b基因。含有Glu-B3a基因的材料，PCR扩增出1095bp的一条带；含有Wx-B1a基因的材料，PCR扩增出425bp的一条带，含有Wx-B1b基因的材料，PCR扩增无425bp的一条带。
一、已知基因型小麦品种拉面面筋强度、粘性和光滑性相关基因的多重PCR扩增
1、小麦基因组的制备
采用CTAB法对5份已知基因型的小麦品种(系)进行基因组DNA的提取，得到对应于5份已知基因型的小麦品种(系)的基因组DNA，作为拉面面筋强度、粘性和光滑性相关基因多重PCR扩增的模板。其中，5份已知基因型的小麦品种(系)为新冬2号、新冬7号、新冬18号、新冬22号和新冬28号。聂迎彬等(聂迎彬，穆培源，桑伟，等.新疆小麦品种Glu-A3和Glu-B3位点等位变异的分布[J].麦类作物学报，2011，31(5)：853-858.)和王亮等(王亮，穆培源，徐红军，等.新疆小麦品种Wx基因组成及其淀粉糊化特性研究[J].麦类作物学报，2010，30(6)：1017-1022.)分别对这五个小麦品种(系)的Glu-B3和Wx-B1基因的基因型进行了分子标记检测，详见表5。
表5已知基因型小麦品种(系)拉面面筋强度、粘性和光滑性相关基因的基因型
2、多重PCR扩增小麦品种拉面面筋强度、粘性和光滑性相关基因
以上述步骤1制备的5份已知基因型的小麦品种(系)的基因组DNA分别为模板，利用表6中的引物对组合物进行多重PCR扩增。
PCR反应总体系为20μL，其中，DNA模板100-200ng，MasterMix(含有DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、4种dNTP)(北京康为世纪生物科技有限公司)10μL(使得20μL的PCR反应体系中每种dNTP的浓度为200μM)，各引物在PCR反应总体系中的终浓度为：引物对4中的序列7和序列8所示的两条DNA单链在PCR反应总体系中的终浓度均为0.25μM；引物对5中的序列9和序列10所示的两条DNA单链在PCR反应总体系中的终浓度均为0.1μM。
PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性35s，55.5℃退火35s，72℃延伸1min30s，扩增反应进行37个循环；72℃延伸8min；4℃，保温结束。
PCR扩增在PTC-200型PCR仪上进行，用1×TAE在2％的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳时的电压为150V，电泳时间为60min，电泳结束经溴化乙锭染色后在凝胶成像系统下观察照相。
表6拉面色泽相关基因扩增引物序列及其预期扩增片段大小
注：“Wx-B1a/Wx-B1b”和“425/-”表示：如果PCR产物中含有大小为425bp的DNA片段，则Wx-B1基因的基因型为Wx-B1a；如果PCR产物中不含有大小为425bp的DNA片段，则Wx-B1基因的基因型为Wx-B1b。
3、已知基因型小麦品种拉面面筋强度、粘性和光滑性相关基因的多重PCR扩增结果
电泳结果如图3的泳道1-泳道5所示：小麦品种(系)新冬2号和新冬7号经上述多重PCR扩增后，均得到大小约为1095bp和425bp的两条带，这说明小麦品种(系)新冬2号和新冬7号含有Glu-B3a基因和Wx-B1a基因；小麦品种(系)新冬28号经上述多重PCR扩增后，无目标条带，这说明小麦品种(系)新冬28号含有Wx-B1b基因；小麦品种(系)新冬18号经上述多重PCR扩增后，得到大小约为1095bp的一条带，这说明小麦品种(系)新冬18号含有Glu-B3a基因和Wx-B1b基因；小麦品种(系)新冬22号经上述多重PCR扩增后，得到大小约为425bp的一条带，这说明小麦品种(系)新冬22号含有Wx-B1a基因。上述结果与表5完全一致，这说明本实施例的多重PCR引物对组能够同时、快速、准确的检测小麦品种拉面面筋强度、粘性和光滑性相关基因Glu-B3a、Wx-B1a和Wx-B1b。这将有利于遴选同时含有Glu-B3a和Wx-B1b基因型的小麦品种或面粉，进行拉面面筋强度、粘性和光滑性遗传改良或评价。
二、待测基因型小麦品种拉面面筋强度、粘性和光滑性相关基因的多重PCR扩增
1、小麦基因组的制备
采用CTAB法对12份待测基因型的小麦品种(系)进行基因组DNA的提取，得到对应于12份待测基因型的小麦品种(系)的基因组DNA，作为拉面面筋强度、粘性和光滑性相关基因多重PCR扩增的模板。其中，12份待测基因型的小麦品种(系)为华北497、91(28)、89(35)、89-2012、新冬14号、新冬19号、新冬24号、冀麦31、石冬8号、石冬9号、87YF5和85(1)。
2、多重PCR扩增小麦品种拉面面筋强度、粘性和光滑性相关基因
以上述步骤1制备的12份待测基因型的小麦品种(系)的基因组DNA分别为模板，利用表6中的引物对组合物进行多重PCR扩增。
PCR反应体系及反应程序同步骤一中2。
3、待测基因型小麦品种拉面面筋强度、粘性和光滑性相关基因的多重PCR扩增结果
电泳结果如图3的泳道6-泳道17所示：小麦品种(系)华北497、新冬14号和冀麦31经上述多重PCR扩增后，均得到大小约为1095bp和425bp的两条带，这说明小麦品种(系)华北497、新冬14号和冀麦31均含有Glu-B3a基因和Wx-B1a基因；小麦品种(系)91(28)、89(35)、89-2012、新冬19号、新冬24号、石冬8号、石冬9号、87YF5和85(1)经上述多重PCR扩增后，均得到大小约为425bp的一条带，这说明小麦品种(系)91(28)、89(35)、89-2012、新冬19号、新冬24号、石冬8号、石冬9号、87YF5和85(1)均含有Wx-B1a基因。上述结果与传统的单重PCR结果相一致。并且，多重PCR扩增产物经回收、测序，与目标基因进行序列比对，是同源序列。通过基因测序，进一步证实了上述多重PCR结果的准确性。
Claims (5)
1.用于鉴定或辅助鉴定待测新疆冬小麦拉面品质性状相关基因的多重PCR引物对组，所述拉面品质性状相关基因为Psy-A1基因、Ppo-D1基因、Ax2*基因、Pinb-D1b基因、ω-secalin基因、Glu-B3a基因和Wx-B1基因，其特征在于：所述多重PCR引物对组由引物对组A、引物对组B和引物对组C组成；所述引物对组A由特异于所述Psy-A1基因的两个引物对，和特异于所述Ppo-D1基因的一个引物对组成；所述引物对组B由特异于所述Ax2*基因的一个引物对，特异于所述Pinb-D1b基因的一个引物对，和特异于所述ω-secalin基因的一个引物对组成；所述引物对组C由特异于所述Glu-B3a基因的一个引物对，和特异于所述Wx-B1基因的一个引物对组成；
所述引物对组A中，所述特异于Psy-A1基因的两个引物对分别为序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的引物对1，以及序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的引物对2；所述特异于Ppo-D1基因的一个引物对为序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的引物对3；
所述引物对组B中，所述特异于Ax2*基因的一个引物对为序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成的引物对4；所述特异于Pinb-D1b基因的一个引物对为序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA组成的引物对5；所述特异于ω-secalin基因的一个引物对为序列表中序列11和序列12所示的两条单链DNA组成的引物对6；
所述引物对组C中，所述特异于Glu-B3a基因的一个引物对为序列表中序列13和序列14所示的两条单链DNA组成的引物对7；所述特异于Wx-B1基因的一个引物对为序列表中序列15和序列16所示的两条单链DNA组成的引物对8；
所述引物对组A中每个引物对的两条引物在PCR反应体系中等量使用，且所述引物对1，所述引物对2和所述引物对3在PCR反应体系中的摩尔比为1:4:1；所述特异引物对组B中每个引物对的两条引物在PCR反应体系中等量使用，且所述引物对4，所述引物对5和所述引物对6在PCR反应体系中的摩尔比为1:1:1；所述特异引物对组C中每个引物对的两条引物在PCR反应体系中等量使用，且所述引物对7和所述引物对8在PCR反应体系中的摩尔比为5:2。
2.用于鉴定或辅助鉴定待测新疆冬小麦拉面品质性状相关基因的试剂盒，其引物为权利要求1所述的多重PCR引物对组。
3.权利要求2所述试剂盒的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述的多重PCR引物对组中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装后，与下述物质中的至少一种包装在同一试剂盒内：PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和4种dNTP。
4.鉴定或辅助鉴定待测新疆冬小麦含有Psy-A1a、Psy-A1b和Psy-A1c这三种基 因中哪一种、含有Ppo-D1a和Ppo-D1b这两种基因中哪一种，是否含有Ax2*基因、Pinb-D1b基因和ω-secalin基因这三种基因中的至少一种，是否含有Glu-B3a基因，以及含有Wx-B1a基因和Wx-B1b基因这两种基因中哪一种的方法，其特征在于：所述方法包括下述（1）和（2）的步骤：
所述（1）为如下b1）、b2）和b3）：
b1）以待测小麦的基因组DNA为模板，用权利要求1所述引物对组中的所述引物对组A进行PCR反应，所述PCR反应的退火温度为60℃；
b2）以待测小麦的基因组DNA为模板，用权利要求1所述引物对组中所述引物对组B进行PCR反应，所述PCR反应的退火温度为从62℃起，每进行1个PCR反应循环下降0.1℃；
b3）以待测小麦的基因组DNA为模板，用权利要求1所述引物对组中的所述引物对组C进行PCR反应，所述PCR反应的退火温度为55.5℃；
（2）检测步骤（1）得到的PCR产物的大小，按照如下方法根据PCR产物确定所述待测小麦含有Psy-A1a、Psy-A1b和Psy-A1c这三种基因中哪一种，含有Ppo-D1a和Ppo-D1b这两种基因中哪一种，是否含有Ax2*基因、Pinb-D1b基因和ω-secalin基因这三种基因中的至少一种，是否含有Glu-B3a基因，以及含有Wx-B1a基因和Wx-B1b基因这两种基因中哪一种：
以所述引物对组A进行PCR反应的产物中，如果同时含有大小为1686bp和194bp的两个DNA片段，所述待测小麦含有Psy-A1a基因或候选含有Psy-A1a基因；如果同时含有大小为1686bp和231bp的两个DNA片段，所述待测小麦含有Psy-A1b基因或候选含有Psy-A1b基因；如果同时含有大小为1001bp和194bp的两个DNA片段，所述待测小麦含有Psy-A1c基因或候选含有Psy-A1c基因；如果含有大小为713bp的DNA片段，所述待测小麦含有Ppo-D1a基因或候选含有Ppo-D1a基因；如果不含有大小为713bp的DNA片段，所述待测小麦含有Ppo-D1b基因或候选含有Ppo-D1b基因；
以所述引物对组B的进行PCR反应的产物中，如果含有大小为1319bp的DNA片段，所述待测小麦含有Ax2*基因或候选含有Ax2*基因；如果不含有大小为1319bp的DNA片段，所述待测小麦不含有Ax2*基因或候选不含有Ax2*基因；如果含有大小为250bp的DNA片段，所述待测小麦含有Pinb-D1b基因或候选含有Pinb-D1b基因；如果不含有大小为250bp的DNA片段，所述待测小麦不含有Pinb-D1b基因或候选不含有Pinb-D1b基因；如果含有大小为1067bp的DNA片段，所述待测小麦含有ω-secalin基因或候选含有ω-secalin基因；如果不含有大小为1067bp的DNA片段，所述待测小麦不含有ω-secalin基因或候选不含有ω-secalin基因；
以所述引物对组C的进行PCR反应的产物中，如果含有大小为1095bp的DNA 片段，所述待测小麦含有Glu-B3a基因或候选含有Glu-B3a基因；如果不含有大小为1095bp的DNA片段，所述待测小麦不含有Glu-B3a基因或候选不含有Glu-B3a基因；如果含有大小为425bp的DNA片段，所述待测小麦含有Wx-B1a基因或候选含有Wx-B1a基因；如果不含有大小为425bp的DNA片段，所述待测小麦含有Wx-B1b基因或候选含有Wx-B1b基因。
5.一种培育拉面小麦品种的方法，包括采用通过权利要求4的方法鉴定得到的如下a）-g）中至少一种的新疆冬小麦作为亲本进行育种的步骤：
a）含有或候选含有Psy-A1b基因；
b）含有或候选含有Ppo-D1a基因；
c）含有或候选含有Ax2*基因；
d）含有或候选含有Pinb-D1b基因；
e）不含或候选不含有ω-secalin基因；
f）含有或候选含有Glu-B3a基因；
g）含有或候选含有Wx-B1b基因。
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