CN102399208A - 包结结晶法提取蛇床子中甲氧基欧芹素和欧前胡素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种包结结晶法提取蛇床子中甲氧基欧芹素和欧前胡素的方法。采用的技术方案是：利用主客体包结结晶法，采用主体分子Ⅰ2，3-双(羟基二苯甲基)-1，4-二氧螺[4.5]癸烷和主体分子Ⅱ1，1，6，6-四苯基-2，4-己二炔-1，6-二醇对中草药蛇床子化学成分甲氧基欧芹素和欧前胡素进行了分步选择性包结分离。利用Kugelrohr真空旋转蒸馏技术使包结物中的主客体得以分离。本发明操作简单，快速高效，不破坏目标化合物的结构，能实现从蛇床子中分离出单一化学组分。
Description
技术领域
本发明属于提取中草药中化学成分的方法领域，具体地涉及一种采用包结结晶法从蛇床子中提取甲氧基欧芹素和欧前胡素的方法。
背景技术
蛇床子系伞形科蛇床（Cnidium monnieri (L.)Cuss.）的干燥成熟果实。具有散寒、祛风、燥湿、杀虫、止痒和壮阳等功效。国内外学者对其主要成分及其药理活性进行了广泛而深入的研究，特别是其对多种实验肿瘤有明显的抑制活性，引起了人们的普遍关注。蛇床子化学成分复杂，目前主要采用层析、色谱等分离方法提取，方法复杂。
因此提供一种方法简单，快速高效，能够分离出单一化学组分的方法是本领域技术人员急需解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种包结结晶法提取蛇床子中甲氧基欧芹素和欧前胡素的方法。该方法操作简单，快速高效，不破坏目标化合物的结构，能实现从蛇床子中分离出单一化学组分。
本发明采用的技术方案是：包结结晶法提取蛇床子中甲氧基欧芹素和欧前胡素的方法，包括如下步骤：
1）提取蛇床子粗提物；
2）包结物Ⅰ的制备：称取主体分子Ⅰ和蛇床子粗提物，加入苯使其溶解，然后加入石油醚，摇匀，放置析晶，抽滤，得滤液和晶体，滤液备用；晶体再用苯和石油醚重结晶，用石油醚洗涤，真空干燥得包结物Ⅰ；所述的主体分子Ⅰ是2，3-双(羟基二苯甲基)-1，4-二氧螺[4.5]癸烷，其结构式如下：
3）提取甲氧基欧芹素：称取包结物Ⅰ置于圆底烧瓶中，串联上四个Kugelrohr瓶，送入管状炉，炉温控制240 oC，蒸馏，得到目标产物甲氧基欧芹素。
上述的包结结晶法提取蛇床子中甲氧基欧芹素和欧前胡素的方法，还包括如下步骤：
4）包结物Ⅱ的制备：取第2）步骤得到的滤液，将苯和石油醚挥干，加入主体分子Ⅱ和乙醚，溶解，再加入石油醚，放置过夜，抽滤，得到絮状物，用乙醚-石油醚重结晶，得到晶体，洗涤，真空干燥得包结物Ⅱ；所述的主体分子Ⅱ是1，1，6，6-四苯基-2，4-己二炔-1，6-二醇，其结构式如下；
5）提取欧前胡素：取包结物Ⅱ置于锥形瓶中，加入丙酮，放置过夜，有无色透明块状晶体析出，移出该晶体，将剩余溶液蒸去丙酮，得到主要成分为欧前胡素的淡黄色晶体。
为进一步提纯欧前胡素，上述的包结结晶法提取蛇床子中甲氧基欧芹素和欧前胡素的方法还包括如下步骤：
6）欧前胡素的提纯：将步骤5）得到的主要成分为欧前胡素的淡黄色晶体溶于丙酮，用毛细管点于GF254 硅胶板上，用C6H6-EtOAc展开，在紫外灯下收集欧前胡素的谱带，用无水 MeOH 浸溶，过滤，浓缩，得欧前胡素。
本发明的有益效果是：本发明利用中草药中各化学成分的分子形状、大小（几何拓扑性质）、官能团的数量和位置（键力性质）的不同，采用“包结结晶法”，基于分子识别原理，通过选择主体分子对中草药中各化学成分（即客体分子）选择性识别，形成超分子包结物以结晶方式析出，从而实现单一化学组分的分离。这种方法操作简单，快速高效，不易破坏目标化合物的结构。本发明采用两种主体分子，即2，3-双(羟基二苯甲基)-1，4-二氧螺[4.5]癸烷(主体分子Ⅰ)和1，1，6，6-四苯基-2，4-己二炔-1，6-二醇（主体分子Ⅱ），成功的对蛇床子粗提物中的化学成分甲氧基欧芹素和欧前胡素进行了分步选择性包结分离，取得了良好的分离效果。结果表明主体分子Ⅰ对甲氧基欧芹素的选择分离纯度为99.3%，主体分子Ⅱ对欧前胡素的选择分离纯度为86.0%。采用本发明的方法，甲氧基欧芹素：按蛇床子粗提物加入量计算收率为 14.47 %，基于生药的收率为0.197 %；欧前胡素：按蛇床子粗提物加入量计算收率为5.56%，基于生药的收率为0.117%。
附图说明
图1是主体分子Ⅰ和包结物Ⅰ的X-射线粉末衍射比较图；
图中，a为主体分子Ⅰ；b为包结物Ⅰ。
图2是主体分子Ⅱ和包结物Ⅱ的X-射线粉末衍射比较图；
图中，a为主体分子Ⅱ；b为包结物Ⅱ。
图3是蛇床子粗提物的气相色谱图。
图4是包结物Ⅰ中分离出组分的气相色谱图。
图5是蛇床子粗提物的液相色谱图。
图6是包结物Ⅱ中分离出组分的液相色谱图。
图7是欧前胡素纯组分的液相色谱图。
具体实施方式
实施例1 包结结晶法提取蛇床子中甲氧基欧芹素和欧前胡素的方法
（一）提取蛇床子中甲氧基欧芹素。
1）提取蛇床子粗提物：
称取400 g干燥蛇床子（市购），将其粉碎后装入索氏提取器中，加入600 mL 乙醇，在电热套上加热回流12小时，待提取液冷却后，用旋转蒸发仪浓缩提取液，得21.35 g绿色浸膏。再用500 mL石油醚加热回流半小时，萃取两次，将萃取液过硅胶短柱，再用旋转蒸发仪浓缩得到绿色半固体粗提物8.44 g，粗提物的收率为 2.11% 。
2）包结物Ⅰ的制备：
主体分子Ⅰ【2，3-双(羟基二苯甲基)-1，4-二氧螺[4.5]癸烷】的制备：制备方法按文献1：F. Toda and K. Tanaka, Tetrahedron Lett., 1988, 29, 551.；或文献2：D. Seebach, A. K. Beck, R. Imwinkelreid, S. Roggo and A. Wonnacott, Helv. Chim. Acta, 1987, 70, 954.
称取1.0 g主体分子Ⅰ，4.0 g蛇床子粗提物置于50 mL锥形瓶中，加入6.0 mL苯微热将其溶解，再加入6.0 mL石油醚，摇匀，放置析晶，得到3.58 g浅绿色簇状晶体。滤液备用。浅绿色簇状晶体再加入苯和石油醚反复进行三次重结晶，得到白色针状晶体，晶体用少量石油醚洗涤数次，以除去表面残留的杂质，真空干燥得2.02 g包结物Ⅰ。m.p.130～132 oC，收率为40.4 %。
3）提取甲氧基欧芹素
包结物Ⅰ采用Kugelrohr真空蒸馏器来分离包结物Ⅰ中选择包结的化学组分。准确称取1.0 g包结物Ⅰ置于10 mL圆底烧瓶中，串联上四个Kugelrohr瓶，送入管状炉，炉温控制在240 oC，蒸馏得到 0.2865 g白色固体，即为目标产物甲氧基欧芹素，收率为28.65 %。按蛇床子粗提物加入量计算收率为 14.47 %，基于生药的收率为0.197 %。根据重量法分析，1.0 g 包结物Ⅰ中分离出的 0.2865 g甲氧基欧芹素为0.00117 mol，剩余0.6815 g主体分子Ⅰ相当于0.0013 mol，可初步确定包结物Ⅰ中的主客体摩尔比为1:1。
（二）提取蛇床子中欧前胡素。
4）包结物Ⅱ的制备
主体分子Ⅱ【1，1，6，6-四苯基-2，4-己二炔-1，6-二醇】的制备：制备方法按文献：F. Toda, K. Tanaka, A.Kai, N. Tanaka, Y. Tsugiyama, K. Hamada, T. Fujiware, Chem. Lett., 1988, 1375.
取第2）步骤得到的滤液，将滤液中的苯和石油醚挥干，加入 0.2 g主体分子Ⅱ和 5 ml乙醚，溶解，再加入1 ml石油醚，立刻有白色絮状物生成。放置过夜有大量包结物产生，抽滤，得到絮状包结物。用乙醚-石油醚重结晶两次，即可得到白色针状晶体，将其用少量石油醚洗涤数次，以去除表面残留的杂质，真空干燥得 0.08 g包结物Ⅱ。m.p. 158~159 ℃，收率为11.45%。
5）提取欧前胡素
将0.08 g包结物Ⅱ转移至25 mL 锥形瓶中，加入5 ml丙酮，放置过夜，有无色透明块状晶体析出，该块状晶体为主体分子Ⅱ与丙酮所形成的包结物，移出该晶体，向溶液中补加适量丙酮，如此反复，直至溶液中无上述块状晶体析出为止。将剩余溶液蒸去丙酮，得到淡黄色晶体31.7 mg。HPLC结果表明该淡黄色结晶的主要成分是欧前胡素。
6）欧前胡素的提纯
将步骤5）得到的淡黄色晶体31.7 mg溶于丙酮，用毛细管点于20×16 cm 的GF254 硅胶板上，用C6H6-EtOAc（5:1v/v）展开，在紫外灯下收集欧前胡素的谱带，用无水 MeOH 浸溶，过滤，浓缩，得欧前胡素27.8 mg (m.p. 99~100 ℃)。按蛇床子粗提物加入量计算收率为5.56%，基于生药的收率为0.117%。
（三）验证结果。
1）包结物Ⅰ的确认。
IR分析结果：主体分子Ⅰ、纯甲氧基欧芹素以及包结物I的红外特征吸收峰数据列于表１。
表1主体分子Ⅰ、纯甲氧基欧芹素以及包结物I的红外特征吸收峰
由表1可知，包结物I的红外谱图中比主体分子Ⅰ的红外谱图多出了1280 cm-1，1255 cm-1的酯基C-O伸缩振动吸收峰，1608 cm-1 的C=C伸缩振动吸收峰，1715 cm-1的C=O伸缩振动吸收峰，3002 cm-1的=C-H伸缩振动吸收峰，多出的吸收峰正是甲氧基欧芹素的吸收峰。另外，主体分子Ⅰ的羟基吸收峰由原来的3530 cm-1，3342 cm-1红移到了3429 cm-1，3291 cm-1，这说明主体分子Ⅰ的羟基与分离出的化学组分的羰基发生了显著的氢键作用，证明了包结物I的形成。
NMR分析结果：包结物I的1H-NMRδ(CDCl3， 300MHz): 1.13-1.45(10H，m，主体CH2)，1.67(3H，s，客体CH3)，1.84(3H，s，客体CH3)，3.52-3.55(2H，d，客体CH2)，3.91(3H，s，客体OCH3)，4.55(2H，s，主体CH)，5.22-5.23(1H，t，客体CH)，6.21- 6.24(1H，d，CH)，6.81- 6.84(1H，d，CH)，7.22 - 7.62(22H，m，主体Ar，20H；客体Ar，2H)。计算积分面积的结果表明，主体分子Ⅰ与客体分子甲氧基欧芹素的摩尔比为1:1，与重量分析法的结果一致。
PXRD分析结果：对主体分子Ⅰ及形成的包结物Ⅰ进行了粉末XRD分析，如图1所示。分析两组衍射数据可以看出，衍射峰的位置和强度几乎完全不同，说明主体分子Ⅰ与客体分子甲氧基欧芹素组分形成的包结物Ⅰ的相互作用形成了新的晶格。
因此，综合IR，NMR 和PXRD分析结果，表明主体分子Ⅰ与蛇床子的甲氧基欧芹素组分形成了包结物Ⅰ。
2）目标产物甲氧基欧芹素的确认。
m.p. 77~78 ℃。
IR(ν/cm-1，KBr)：3092，3038，1566(芳环)，2966，2933，2842（C-H），1724（C=O），1610（C=C）；
1H-NMR（CDCl3，300MHz）δ：1.67（3H，s，CH3），1.84（3H，s，CH3），3.52~3.55（2H，d，J=9Hz，CH2），3.92（3H，s，-OCH3），5.22~5.23（1H，t，J=3Hz，-CH=），6.22~6.25（1H，d，J=9Hz，3-H），6.82~6.85（1H，d，J=9Hz，6-H），7.27~7.30（1H，d，J=9Hz，5-H），7.60~7.63（1H，d，J=9Hz，4-H）；
13C-NMR（CDCl3，300MHz）δ：160.024（C-2），112.642（C-3），143.655（C-4），126.126（C-5），112.760（C-6），161.176（C-7），107.197（C-8），152.587（C-9），117.606（C-10），17.743（C-1’），121.006（C-2’），132.349（C-3’），21.731（C-4’），25.604（C-5’）。
3）主体分子Ⅰ对甲氧基欧芹素的分离效果分析。
蛇床子粗提物及其包结物Ⅰ中分离出组分的气相色谱分析结果如图3，4所示。
GC色谱测定：石英毛细管HP-Ultra-1(30 m×0.32 mm×1.0 μm)，柱温100 ℃开始，保持2分钟，然后以10 ℃/min升至280 ℃，保持15分钟，载气流速为40 mL/min，进样口温度280 ℃，检测器温度300 ℃，少量试样加丙酮进样0.4 μL。
气相色谱分析结果表明，蛇床子粗提物的主要化学成分的色谱保留时间分别为1.446 min（3.4643%），1.917 min（5.8602%），2.317 min（2.7805%），4.060 min（6.0282%），5.030 min（49.8162%），5.374 min（11.2578%），5.469 min（9.9906%），5.669 min（4.0526%），6.524 min（6.7496%）。其中，甲氧基欧芹素的保留时间为5.030 min，含量为49.8%。而由包结物I分离出来的化学组分的保留时间为5.090 min，与甲氧基欧芹素的保留时间相吻合且含量提高到100 %。这说明主体分子Ⅰ对甲氧基欧芹素具有优良的识别能力，达到了较好的选择分离效果。
4）包结物Ⅱ确认。
IR分析结果：主体分子Ⅱ、纯欧前胡素以及包结物Ⅱ的红外特征吸收峰数据列于表2。
表2 主体分子Ⅱ、纯欧前胡素以及包结物Ⅱ的红外特征吸收峰
由表2可知，包结物Ⅱ的红外谱图中比主体分子Ⅱ的红外谱图多出了1291 cm-1，1255 cm-1的酯基C-O伸缩振动吸收峰，1623 cm-1 的C=C伸缩振动吸收峰，1722 cm-1和1707 cm-1的C=O伸缩振动吸收峰，多出的吸收峰正是欧前胡素的吸收峰。另外，主体分子Ⅱ的羟基吸收峰由原来的3533 cm-1，红移到了3360 cm-1，这说明主体分子Ⅱ的羟基与分离出的化学组分的羰基发生了的氢键作用，进一步证明了包结物Ⅱ的形成。
NMR分析结果：包结物Ⅱ的1H-NMRδ(CDCl3，300MHz):1.72~1.74(6H，s，2×CH3)，2.86(1H，s，主体-OH)，4.99~5.02(2H，d，-OCH2)，5.58~5.63(1H，t，-CH=)，6.35~6.38(1H，d，3-H)，6.81(1H，d，3’-H)，7.26~7.57(11H，m，主体Ar，10H；客体Ar，1H)，7.69~7.70(1H，d，2’-H)，7.75~7.79(1H，d，4-H)。计算积分面积的结果表明，主体分子Ⅱ与客体分子欧前胡素的摩尔比为1:2。
PXRD分析结果：对主体分子Ⅱ及形成的包结物Ⅱ进行了粉末XRD分析，如图2所示。分析两组衍射数据可以看出，衍射峰的位置和强度几乎完全不同，说明主体分子Ⅱ与客体分子欧前胡素组分形成的包结物Ⅱ的相互作用形成了新的晶格。
因此，综合IR，NMR 和PXRD分析结果，表明主体分子Ⅱ与蛇床子的欧前胡素组分形成了包结物Ⅱ。
5）目标产物欧前胡素的确认。
m.p. 99~100 ℃。
IR(ν/cm-1，KBr)：3134，1625，1586(芳环)，876（呋喃环），2972，2935，1466，1401（C-H），1722（C=O）；
1H-NMR（CDCl3，300MHz）δ：1.72~1.74(6H，s，2×CH3)，4.99~5.02（2H，d，J=9Hz， -OCH2），5.58~5.63（1H，t，J=15Hz，-CH=），6.35~6.38（1H，d，J=9Hz，3-H），6.81~6.82（1H，d，J=3 Hz，3’-H），7.36（1H，s，5-H），7.69~7.70（1H，d，J=3Hz， 2’-H），7.75~7.79（1H，d，J=12Hz，4-H）；
13C-NMR（CDCl3，300MHz）δ：160.414（C-2），114.542（C-3），144.327（C-4），113.134（C-5），125.794（C-6），148.497（C-7），131.537（C-8），144.327（C-9），116.389（C-10），146.543（C-2’），106.659（C-3’），70.059（C-1’’），119.693（C-2’’），139.645（C-3’’），25.733（C-4’’），18.033（C-5’’）。
6）主体分子Ⅱ对欧前胡素的分离效果分析。
蛇床子粗提物及包结物Ⅱ中分离出组分的液相色谱HPLC流出图如图5，6所示。
HPLC测定：选用ODS柱，249 nm检出，流动相MeOH-H2O(2:1)，流速0.8 mL/min。
图5中，tR为15 min左右的峰为甲氧基欧芹素，10 min左右的峰为欧前胡素，含量约为34.2%。
将包结物Ⅱ经丙酮处理后，得到淡黄色粉末，经HPLC分析表明，它含有欧前胡素和花椒毒素，色谱流出图如图6所示。tR为10.318 min的欧前胡素含量约为86.0%，由图可见，用包结结晶法可以从蛇床子众多组分选择性地将欧前胡素分离出来，大大简化了分离流程。上述混合物经TLC分离（苯-EtOAc（5:1）），收集数块薄板R f 值相同的部分，得到欧前胡素组分（R f 值约为0.7），经HPLC分析，为单一组分。如图7所示。
综上所述，主体分子Ⅰ能够选择分离蛇床子粗提物中的化学组分甲氧基欧芹素，且纯度提高到了100%；另外，主体分子Ⅱ对于其包结剩余母液中的欧前胡素等化学组分也表现出了较好的选择识别能力. 这种利用不同主体分子对中草药不同组分的分步选择性包结分离，为包结结晶法分离中草药化学成分提供了新的思路。
Claims (3)
1.包结结晶法提取蛇床子中甲氧基欧芹素和欧前胡素的方法，其特征在于包括如下步骤：
1）提取蛇床子粗提物；
2）包结物Ⅰ的制备：称取主体分子Ⅰ和蛇床子粗提物，加入苯使其溶解，然后加入石油醚，摇匀，放置析晶，抽滤，得滤液和晶体，滤液备用，晶体再用苯和石油醚重结晶，用石油醚洗涤，真空干燥得包结物Ⅰ；所述的主体分子Ⅰ是2，3-双(羟基二苯甲基)-1，4-二氧螺[4.5]癸烷；
3）提取甲氧基欧芹素：称取包结物Ⅰ置于圆底烧瓶中，串联上四个Kugelrohr瓶，送入管状炉，炉温控制240 oC，蒸馏，得到目标产物甲氧基欧芹素。
2. 如权利要求1所述的包结结晶法提取蛇床子中甲氧基欧芹素和欧前胡素的方法，其特征在于还包括如下步骤：
4）包结物Ⅱ的制备：取第2）步骤得到的滤液，将苯和石油醚挥干，加入主体分子Ⅱ和乙醚，溶解，再加入石油醚，放置过夜，抽滤，得到絮状物，用乙醚-石油醚重结晶，得到晶体，洗涤，真空干燥得包结物Ⅱ；所述的主体分子Ⅱ是1，1，6，6-四苯基-2，4-己二炔-1，6-二醇；
5）提取欧前胡素：取包结物Ⅱ置于锥形瓶中，加入丙酮，放置过夜，有无色透明块状晶体析出，移出该晶体，将剩余溶液蒸去丙酮，得到主要成分为欧前胡素的淡黄色晶体。
3. 如权利要求2所述的包结结晶法提取蛇床子中甲氧基欧芹素和欧前胡素的方法，其特征在于还包括如下步骤：
6）欧前胡素的提纯：将步骤5）得到的主要成分为欧前胡素的淡黄色晶体溶于丙酮，用毛细管点于GF254 硅胶板上，用C6H6-EtOAc展开，在紫外灯下收集欧前胡素的谱带，用无水 MeOH 浸溶，过滤，浓缩，得欧前胡素。
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