CN102395684B - 利用适体的靶物质检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用适体的靶物质检测方法及检测用试剂盒，具体地说，涉及以下靶物质检测方法及检测用试剂盒：向固定于固相载体的第1适体添加试料及第2适体使第1适体、靶物质及第2适体间形成夹层结合的靶物质检测方法及检测用试剂盒；FET传感器基础靶材检测方法及检测用试剂盒；AAO传感器基础靶材检测方法及检测用试剂盒。依据本发明的检测方法对于依据现有技术很难检测的低分子量物质也能够检测出来，从而就可以检测出与存在于溶液中的疾病相关的代谢物、环境污染物及食品毒素等，它利用能够按一贯性再生产并且能够以较低费用生产的适体，因此还可以提高其经济性。

Description

利用适体的靶物质检测方法
技术领域
本发明涉及一种利用适体的靶物质检测方法及检测用试剂盒，具体地说，是涉及三种靶物质检测方法及检测用试剂盒：向固定于固相载体的第1适体添加试料及第2适体使第1适体、靶物质及第2适体间形成夹层结合的靶物质检测方法及检测用试剂盒；FET传感器基础靶材检测方法及检测用试剂盒；还有AAO传感器基础靶材检测方法及检测用试剂盒。
背景技术
研发出一种能够灵敏而特异地检测溶液中较小分子的新型传感器平台对于监测与疾病相关的代谢物、环境污染物及食品毒素等是非常重要的，目前为止，对代谢物、环境污染物及毒素等具有低分子量的分析物的分析一般都是通过GC/MS或者HPLC等复杂的实验进行的，这即使是对于操作熟练的人员来说也需要很长的时间来进行检查，而且它还不适用于临场分析(on-site analysis)(Stales, C.A. et al,Environ. Toxicol. Chem., 20:2450,2001)。因此，为了能够成功实施现场的(on-site)实时检测，就需要较小刻度的装置及特异结合的试剂。
因此，作为检测小物质的便携式平台，虽然已有表面等离子共振技术 (surface plasmon resonance)等检测平台，但是，从原理上来说，它很难检测分子量低于400的极低分子量物质。而且，对使用17β-雌二醇 (β-estradiol, MW: 272) 结合特异适体的1μM (272ppb)浓度进行分析的结果如图1所示，是不可能对上述低分子量物质的浓度进行分析的(Kim et al., Biosens. Bioelecrtron., 22:2525, 2007)。所以，就迫切需要研发出一种能够灵敏而特异地检测出低分子量物质新型平台。
另外，为了对分析物实施灵敏而特异的检测，就需要抗体与分析物特异结合的试剂。但是，如果是低分子量的小物质，通常使动物产生抗体而言，由于其太小或者毒性太强都不能生成抗体。因此，就需要能够锁定小分子的新型特异结合的试剂。
另外，适体作为单一链条DNA或者RNA分子，具有很高的亲和性，即能够特异认知靶物质的小单链寡核苷酸。适体可以用作检测分析系统中能够识别分子的生物传感器的一个要素，因此，它一直被当作抗体的替代物质。特别是，适体与抗体不同，它可以用作以毒素为主的多种有机物及无机物的靶分子，一旦将与特定物质特异结合的适体分离，可以采用自动化的低聚物合成方法以较低的费用进行连续再生产，比较经济。自1996年首次开发出利用荧光标记的适体测定靶蛋白的适体基础生物传感器之后，以这种适体的优点和结构上的特性为基础开发出了多种适体生物传感器(金延锡&邱万福，NICE, 26(6): 690, 2008)。
但是，利用现有适体的分析方法一直都是采用分离附着在特定物质上的适体或者利用其它物质结合等竞争分析方法，因此，就需要研发出通过更加直接而简便的方法来利用适体检测出物质的方法。
另外，以碳纳米管(CNT)为基础的传感器作为检测小物质的便携式装置，是一个很有魅力的平台，它与石英晶体微量天平 (quarts-crystal microbalance)、电化学阻抗分析仪 (electrochemical impedance spectrometry)、表面等离子共振技术(surface plasmon resonance)及光寻址电位传感器(light-addressable potentiometric sensor: LAPS)等其它检测平台相比，单壁碳纳米管(swCNT)-场效应晶体管(FETs)作为小刻度装置，适合用作非常灵敏地检测化学物质的传感器(Kim, T.K. et al., Advanced Materials, 20:1, 2008； Kong, J. et al., Science, 287:622, 2000; Snow, E.S. & Perkins, F.K., Nano. Lett., 5:2414, 2005)。
但是，最近用于检测小分子的swCNT-FET存在含有大部分重要的生物学代谢物或毒素，呈非液体状，仅限于气体和蒸汽状的问题。另外，由于溶液中的无极性小分子的检测并不在FET基础传感器的检测范围内，因此，溶液中小分子的检测就非常困难(Heller, I. et al, Nano. Lett., 8:591, 2008)。
另外，对分析物实施特异而灵敏的检测还需要通过功能基获得使swCNT-FET化学传感器与抗体等特异结合的试剂，通常就小分子使动物产生抗体而言，由于其太小或者毒性太强都不能生成抗体。
因此，本发明为了提供一种能够检测出小分子，特别是溶液中的小分子也能够被检测出来的新型检测方法，经过如实施例所述的一系列努力最终完成了本发明，即向固定于固相载体的第1适体添加试料及第2适体，使第1适体，靶物质及第2 适体间形成夹层结合之后，对于双酚Ａ等无极性低分子量的物质也能够被检测出来。
另外，本发明将第1适体作为探测器固定于FET传感器上之后，再向其中添加试料及第2适体，然后，就可以测定电流变化，从而也可以检测出pM标准的无极性低分子物质。
另外，本发明将适体作为探测器固定于AAO传感器上之后，再向其中添加试料，然后，就可以测定静电容量的变化，从而也可以检测出无极性低分子物质。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种溶液中的低分子物质也能够被检测出来的新型靶物质检测方法。
本发明的另一个目的在于，提供一种溶液中的低分子物质也能够被检测出来的靶物质检测用试剂盒。
为了实现上述目的，本发明提供了一种利用适体的靶物质检测方法，其包括如下几个步骤：
(a)向固定于固相载体与靶物质特异结合的第1适体中添加含有靶物质的试料及与上述靶物质特异结合且附着有标志物的第2适体，并使其反应的步骤；
(b)分析上述标志物并检测靶物质的步骤。
另外，本发明还提供一种利用适体的靶物质检测方法，其包括如下几个步骤：
(a)向固定于固相载体与靶物质特异结合的第1适体中添加含有靶物质的试料及与上述靶物质特异结合的第2适体，并使其发生反应的步骤；
(b)使标志物与上述第2适体结合的步骤；
(c)分析上述标志物并检测靶物质的步骤。
另外，本发明提供一种靶物质检测用试剂盒，其包括：固定有与靶物质特异结合的第1适体的固相载体；以及含有与上述靶物质特异结合的第2适体检测试剂。
另外，本发明提供一种双酚Ａ检测用试剂盒，其特征在于，包含固定有与双酚Ａ特异结合的第1适体的固相载体及含有与附着标志物的双酚Ａ特异结合的第2 适体的检测试剂，上述第1适体或者第2适体从序列号2至28的核酸序列中所示的适体中选择。
另外，本发明提供一种适体标记用核酸片段，其特征在于，附着标志物并能够与适体末端互补结合。
另外，本发明提供一种利用适体的场效应晶体管(FET)传感器基础的靶物质的检测方法，其包括如下几个步骤：
(a)包含基板、在上述基板两侧相互分离形成的源极及漏极、以及与上述源极及漏极接触并在基板上形成的入口，向与靶物质特异结合的第1适体作为探测器固定于上述源极表面、入口表面及漏极表面中任意一个以上的FET传感器中添加含有靶物质的试料，并与上述靶物质特异结合的第2适体的步骤；
(b) 测定当上述靶物质和第2适体与固定在上述FET传感器上的第1适体结合时产生的上述FET传感器的源极及漏极之间流动的电流变化并检测靶物质的步骤。
另外，本发明提供一种靶物质检测用试剂盒，其包括如下几个步骤：
包含基板、在上述基板两侧相互分离形成的源极及漏极及，以及与上述源极及漏极接触并在基板上形成入口的FET传感器，与靶物质特异结合的第1适体作为探测器固定于上述源极表面、入口表面及漏极表面中任意一个以上为特征的FET传感器；含有与上述靶物质特异结合的第2适体的检测试剂。
另外，本发明提供一种双酚Ａ检测用试剂盒，其特征在于，其包括如下几个步骤：作为包含基板、在上述基板两侧相互分离形成的Au电极、含有与上述Au电极接触并在上述基板上形成通道的单壁碳纳米管通道区的FET传感器，与双酚Ａ特异结合的第1适体作为探测器固定于上述Au电极表面为特征的FET传感器；含有与双酚Ａ特异结合的第2适体的检测试剂。在这里，上述第1适体或者第2适体从序列号2至28的核酸序列中所示的适体中选择。
另外，本发明提供一种利用适体的阳极氧化铝 (AAO, Anodic aluminum oxide)传感器基础靶材检测方法，其包括如下几个步骤：
(a) 包含基板、在上述基板上形成具有纳米大小的孔的阳极氧化铝、对上述阳极氧化铝的表面进行涂覆的金属，向与靶物质特异结合的适体作为探测器固定于上述金属表面的AAO传感器中添加含有靶物质的试料的步骤；
(b) 领用AAO传感器测定当上述靶物质与适体结合时残生的静电通量的变化英检测靶物质的步骤。
另外，本发明提供一种靶物质检测用试剂盒，其包括如下几个步骤：含有基板、在上述基板上形成并具有纳米大小的孔的阳极氧化铝、对上述阳极氧化铝的表面进行涂覆的金属的阳极氧化铝(AAO)传感器；与靶物质特异结合的适体。
本发明的另一个特征以及实施例将通过下面的详细说明及所附权利要求书中作进一步介绍。
附图说明
图1是依据现有SPR的方法利用适体执行17β雌二醇检测的结果示意图；
图2是依据本发明的方法使双酚Ａ及标记的适体与固定的适体结合的过程的概略示意图；
图3是依据本发明的方法通过夹层结合执行双酚Ａ检测的结果示意图；
图4是swCNT-FET传感器以及利用它适用依据本发明的方法检测双酚Ａ(BPA)的过程概略示意图；
图5是将BPA溶液(图5a)、BPA与抗-BPA适体混合溶液(图5b)以及抗-BPA适体溶液(图5c)分别添加到swCNT-FET传感器中测定其电流变化的函数图和将BPA、BPB、6F及BP等各种溶液与抗-BPA适体溶液的混合溶液添加到swCNT-FET传感器中测定电流变化的函数图(图5d)；
图6是多通道AAO传感器的概略示意图；
图7是分别把频率从0到100赫兹变化的过程中适体与传感器结合时与双酚Ａ流入时的静电容量进行比较的结果示意图；
图8是利用AAO传感器检测双酚Ａ获得结果的函数图，(图8a)是不使适体结合的AAO传感器的实验结果示意图，(图8b)是使适体结合的AAO传感器的静电容量变化结果示意图；
图9是将双酚Ａ分别以1nm，10nM及100nM的浓度流入与适体结合的AAO传感器时静电容量变化的函数图。
具体实施方式
只要没有以其它形式定义，在本说明书中使用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属技术领域的工作人员通常所理解的涵义相同。一般情况下，本说明书中使用的命名法以及下面所述实验方法都是本技术领域公知的常用方法。
在对本发明进行详细说明中所用的主要术语的定义如下。
本发明中所谓的“适体”是指能够以较高的亲和性对靶物质进行特异认知的小单链寡核苷酸。
本发明中所谓的“试料”是指含有或者推定含有所关心的靶物质而对其进行分析的组成物，其特征在于，它是从液体、土壤、空气、食品、废弃物、动植物脏器内及动植物身体组织中任意一种中提取的试料中检测出来的，但并非仅限定于此。在这种情况下，液体包括水、血液、小便、眼泪、汗、唾液、淋巴及脑脊液等，上述水包括江水、海水、湖水及雨水等，废弃物包括污水、废水等，上述动植物包括人体。另外，上述动植物组织包括粘膜、皮肤、表皮、毛发、鳞、眼球、舌头、面颊、蹄子、嘴、喙、脚、手、口、乳头、耳朵、鼻子等组织。
本发明中所谓的“场效应晶体管(FET)传感器”是指在基板两侧形成带有与基板相反极性的源极及漏极，包括与源极及漏极接触并在基板上形成的入口，在入口表面或者上述金属电极的表面固定有探测器，当探测器与靶物质结合时，通过电气的方法测定结合时产生的电流变化，从而检测出探测器与靶物质间是否结合的传感器。
本发明中所谓的“碳纳米管”是指一个碳元素与其它的碳原子构成六角形蜂窝纹结合的管状物质，管的直径是以纳米为标准，是极其小的物质，根据石墨片的结合数可以分为单壁碳纳米管(single-walled nanotube)、多壁碳纳米管(multi-walled nanotube)以及碳纳米管束(rope nanotube)。
本发明中所谓的“阳极氧化铝 (AAO, Anodic aluminum oxide)”是指利用将铝通过电化学方式氧化的阳极氧化(anodization)方法生成表面带有均匀规则性的纳米大小的多孔性铝。
本发明从一种观点出发，利用适体的靶物质检测方法，它包含如下几个步骤：
(a) 固定于固相载体与靶物质特异结合的第1适体中添加含有靶物质的试料及与上述靶物质特异结合并且附着标志物的第2适体，并使其反应的步骤；
(b) 分析上述标志物并检测靶物质的步骤。
在本发明中，“固相载体”作为固定适体的固相载体支撑体，不限定于固定适体的形态或者物质。为了便于实施分析方法，一般都采用多孔型微孔板。也可以采用由传感器芯片、塑料、聚丙烯及凝胶或琼脂糖等小珠填充形成的柱状等其它的形状。
第1适体可以通过一般的方法与上述固相载体固定。虽然在本发明的一个实施例中是采用溶胶-凝胶分株法固定，但是，并不意味着仅限定于此。这对于具有本发明所属技术领域相关知识的工作人员来说是显而易见的。
对于本发明来说，上述(a)步骤作为向上述固定的第1适体中添加试料和第2 适体，并使其反应的步骤，在这里，所谓的“反应”是指向第1适体中添加试料及第2 适体，并进行培养后，使其与固定有存在于试料中靶物质的第1适体结合，然后再通过反应使第2适体与靶物质结合。在这种情况下，首先将试料与第2适体混合，然后，再向上述第1适体中添加。即，将试料和第2适体混合后，使试料中靶物质与第2适体间形成特异结合。然后，再向固定有结合的靶物质-第2适体的第1 适体中添加，就可以使其与第1适体结合。
另外，上述(a)步骤的特征在于，首先添加试料后，再添加第2适体。即，首先使试料中的靶物质与固定在固相载体的第1适体结合，然后，再依次添加第2 适体使其结合，从而就可以依次完成结合反应。
上述第2适体中附着的标志物可以通过间接或者直接的方式附着，标志物可以使用荧光物质、放射性同位素等，但并不意味着仅限定于此。在这种情况下，荧光物质的种类没有特别的限定，例如：可以使用与Cy3或Cy5等相类似的荧光色素或者荧光素酶(luciferase)、GFP等荧光蛋白质类公认的荧光物质。
在本发明中，上述(b)步骤作为分析上述标志物并检测靶物质的步骤，分析靶物质和第2适体与固定于固相载体的第1适体结合时产生的标志物的变化并检测靶物质。在这种情况下，标志物的分析可以通过公知的标志物分析法完成。例如：如果将荧光物质用作标志物，当靶物质存在时就会发光或者颜色发生变化，通过对其进行测定，就可以检测靶物质。作为一个示例，通过能够探测荧光染料的图像扫描仪等扫描引起反应的小孔就可以确认是否检测到靶物质。同时，利用软件对图像进行深度测定就可以测定检测量。
另外，除了在上述第2适体附着标志物使用之外，在上述(a)步骤中，使试料和第2适体与第1适体结合之后，再使标志物与第2适体结合，从而就可以检测出靶物质。因此，本发明从另一种观点出发，利用适体的靶物质检测方法，它包含如下几个步骤：
(a)固定于固相载体与靶物质特异结合的第1适体中添加含有靶物质的试料及与上述靶物质特异结合的第2适体，并使其反应的步骤；
(b)使标志物与上述第2适体结合的步骤；
(c)分析上述标志物并检测靶物质的步骤。
对于本发明来说，与上述(b)步骤中标志物的结合，其特征在于，通过与上述第2适体互补结合的核酸片段和上述第2适体进行互补结合而完成。
在这种情况下，所谓的“互补结合”是指合成核酸片段的序列相对于上述第2 适体来说大约在80～90%以上，更加优选地，大约在90～95%以上，进一步优选地，大约在95～99%以上的序列可以彼此互补或者完全互补杂交。优选地，上述核酸片断的特征在于，它可以与第2适体的末端互补结合。在这种情况下，第2适体为了实现上述结合，其末端可以包含附加的序列。
在本发明的一个实施例中，为了确认依据本发明的检测方法是否能够检测出溶液中低分子量的物质，利用环境荷尔蒙做实验，看是否能够检测出大家熟知但检测极其困难的双酚Ａ，其结果表明，低分子量的双酚Ａ也能够通过特异的方法检测出来。这意味着，与依据现有技术检测溶液中代谢物、毒素等非常困难的情况不同，利用本发明的方法能够将溶液中的代谢物、毒素等检测出来。
优选地，为检测上述实施例中的双酚Ａ而使用的适体可以从序列号2至28的核酸序列中所示的适体中选择。在这种情况下，核酸适体可以用单链DNA或RNA，当上述核酸为RNA时，上述核酸序列中T用U表示，这种序列包含在本发明的范围内，这一点对于具有本发明所属技术领域相关知识的工作人员来说是显而易见的。
本发明从另一种观点出发，利用适体的场效应晶体管(FET)传感器基础靶物质的检测方法，它包含如下几个步骤：
(a) 包含基板、在上述基板两侧相互分离形成的源极及漏极、与上述源极及漏极接触并在基板上形成的入口，与靶物质特异结合的第1适体作为探测器固定在上述源极表面、入口表面及漏极表面中任意一个以上的FET传感器中添加含有靶物质的试料及与上述靶物质特异结合的第2适体的步骤；
(b)通过测定上述靶物质和第2适体与固定在上述FET传感器上的第1适体结合时产生的上述FET传感器的源极及漏极之间流动的电流变化而检测靶物质的步骤。
依据本发明的方法基于场效应晶体管(FET)原理，其特征在于，将适合作为探测器固定于源极表面、入口表面及漏极表面中任意一个以上进行使用。作为实施本发明而采用的FET传感器也可以使用现有任何形态的FET传感器。另外，包含在基板两侧与基板相反的极性添加的源极及漏极、与上述源极及漏极接触并在基板上形成的入口，通过电气方法测定靶物质与入口表面或者固定于源极及漏极上的探测器结合时产生的电流变化，利用这种原理的传感器可以用于执行实施本发明的方法，这一点对于具有本发明所属技术领域相关知识的工作人员来说是显而易见的。另外，对于本发明来说，其特征在于，上述金属电极可以由金、铂、铬、铜、铝、镍、钯以及钛构成的组中选择任意一种或以上形成。
优选地，在这种情况下，为了提高检测活性，上述FET传感器的特征在于，它是碳纳米管沉积于基板上并与上述源极及漏极接触构成通道区的FET传感器。碳纳米管的沉积可以通过化学气相沉积法、激光消融法、弧光放电法、等离子体增强化学气相沉积法、热化学气相沉积法、气相合成法、电解法、火焰燃烧合成法等通常的方法完成。优选地，对于这种碳纳米管FET传感器来说，其特征在于，上述第1适体固定于上述金属电极表面。
同时，对于本发明来说，上述(a)步骤作为向FET传感器中添加试料和第2适体的步骤，在这种情况下，其特征在于，首先使试料和第2适体混合后，再向上述FET传感器中添加。即，试料与第2适体混合后使试料中靶物质与第2适体间特异结合，然后，再把结合的靶物质-第2适体向FET传感器中添加并使其与作为探测器的第1适体结合。
另外，上述(a)步骤的特征在于：首先添加试料后，再添加第2适体。即，使试料中靶物质首先与FET传感器的第1适体结合，然后，再依次添加第2适体并使其结合，从而就可以使其依次结合反应。
在本发明中，上述试料的特征在于，推定含有或者正在溶入所关心的靶物质后，作为对其进行分析的组成物，可以通过对从土壤、液体、空气、食品、废弃物、动植物脏器内及动植物组织中任意一种或以上中提取的试料进行检测，但并不意味着仅限定于此。在这种情况下，液体可以是水、血液、小便、眼泪、汗、唾液、淋巴及脑脊液等，上述水包含江水、海水、湖水及雨水等，废弃物包含污水、废水等，上述动植物包含人体。另外，上述动植物组织包括粘膜、皮肤、表皮、毛发、鳞、眼球、舌头、面颊、蹄子、嘴、喙、脚、手、口、乳头、耳朵、鼻子等组织。
在本发明的一个实施例中，为了确认依据本发明的检测方法是否也能够检测出溶液中低分子量的无极性物质，利用环境荷尔蒙做实验，看是否能够检测出大家熟知但检测却极其困难的双酚Ａ，其结果表明，即使溶液中的双酚Ａ达到pM标准也能够检测出来，而且对具有与双酚Ａ极其相似构造的BPB、6F等其它双酚类不会引起反应，而只对双酚Ａ进行特异检测。这意味着，依据本发明的检测方法与现有技术检测溶液中代谢物、毒素等非常困难的情况不同，利用依据本发明的方法能够将溶液中的代谢物、毒素 等检测出来。
优选地，为了检测上述实施例的双酚Ａ而用于FET传感器的适体可以从序列号2至28的核酸序列中所示的适体中选择。在这种情况下，核酸适体可以用单链DNA或RNA，当上述核酸为RNA时，上述核酸序列中T用U表示，这种序列包含在本发明的范围内，这一点对于具有本发明所属技术领域相关知识的工作人员来说是显而易见的。
本发明从另一种观点出发，利用适体的阳极氧化铝 (AAO, Anodic aluminum oxide)传感器基础靶材的检测方法，它包含如下几个步骤：
(a)包含基板、在上述基板上形成并具有纳米大小的孔的阳极氧化铝、对上述阳极氧化铝的表面进行涂覆的金属，向与靶物质特异结合的适体作为探测器固定于上述金属表面的AAO传感器中添加含有靶物质的试料的步骤；
(b)测定靶物质与适体结合时产生的上述AAO传感器的静电容量的变化并检测靶物质的步骤。
所谓的“阳极氧化铝 (AAO, Anodic aluminum oxide)”是指利用电气方法氧化的铝。铝具有沿垂直方向规则排列的细小纳米气孔，它在电氧化过程中可以对其大小进行调节。当金属粒子溶入这种阳极氧化铝表面后就与适体结合。在这里，如果有选择性地使双酚Ａ等靶物质发生反应，就会导致电压与电流发生变化，并最终引起静电容量发生变化，从而就可以实现对微量的物质也能够检测出的纳米生物传感器。作为实施本发明而采用的AAO传感器也可以使用现有任何形态的AAO传感器。
在这种情况下，在上述阳极氧化铝表面涂覆的金属可以用金，但并非仅限定于此。
另外，上述AAO传感器上适体的固定可以发挥与适体的一个末端结合的功能基的作用，在本发明的一个实施例中，与适体的3’末端结合的硫氢基构成阳极氧化铝表面的金和共价键，并结合到AAO传感器的表面。
在这种情况下，如图6所示，上述AAO传感器的特征在于，优选地，能够同时执行多种物质的检测，可以作多通道利用。即，将互不相同的适体分别固定于各个通道，就可以同时对多种物质进行检测。另外，使互不相同的试料流入各个通道，从而就可以同时对多种试料进行调查。
在本发明的一个实施例中，为了确认依据本发明基于AAO传感器的检测方法是否也能够检测出溶液中低分子量的无极性物质，利用环境荷尔蒙做实验，看是否能够检测出大家熟知但检测极其困难的双酚Ａ，其结果表明，确认能够检测出溶液中的双酚Ａ。这意味着，依据本发明的检测方法与依据现有技术检测溶液中代谢物、毒素等非常困难的情况不同，利用依据本发明的方法能够将溶液中的代谢物、毒素等检测出来。
优选地，为了检测上述实施例的双酚Ａ而用于AAO传感器的适体可以从序列号2至28的核酸序列中所示的适体中选择。在这种情况下，核酸适体可以用单链DNA或RNA，当上述核酸为RNA时，上述核酸序列中T用U表示，这种序列包含在本发明的范围内，这一点对于具有本发明所属技术领域相关知识的工作人员来说是显而易见的。
另外，依据本发明的方法为了提高便携性，可以按试剂盒的形态提供。也就是说，本发明从另一种观点出发，涉及一种靶物质检测试剂盒，它包含如下几个步骤：与靶物质特异结合的第1适体固定于固体上的固相载体、含有与上述靶物质特异结合的第2适体的检测试剂。在这种情况下，含有上述第2适体的检测试剂既可以装入其它的容器中，也可以装入执行夹层结合的反应部。另外，上述检测试剂盒可以包含检测用缓冲溶液等。同时，优选地，还可以包含能够使上述检测试剂与需要检测的试料液混合的工具。
本发明从另一种观点出发，涉及一种靶物质检测用试剂盒，包括如下几个步骤：作为包含基板、在上述基板两侧相互分离形成的源极及漏极、与上述源极及漏极接触并在基板上形成入口的FET传感器，与靶物质特异结合的第1适体作为探测器固定于上述源极表面、入口表面及漏极表面中任意一种上的FET传感器；含有与上述靶物质特异结合的第2适体的检测试剂。在这种情况下，含有上述第2适体的检测试剂既可以装入其它的容器中，也可以装入执行使靶物质与适体间结合的反应部。另外，上述检测试剂盒可以包含检测用缓冲溶液等。同时，优选地，还可以包含能够使上述检测试剂与需要检测的试料液混合的工具。
本发明从另一种观点出发，涉及一种靶物质检测用试剂盒，其包括如下几个步骤：包含基板、在上述基板上形成并具有纳米大小孔的阳极氧化铝、对上述阳极氧化铝的表面进行涂覆的金属的阳极氧化铝(AAO)传感器；与靶物质特异结合的适体。优选地，在这种情况下，上述金属可以用金，但并非仅局限于此。在此后的执行步骤中，上述适体利用与适体末端结合的功能基固定于AAO传感器上，在这种情况下，上述功能基可以为硫氢基，它既可以通过吸附结合，也可以通过连接器(linker)结合。同时，上述试剂盒还可以包含流动系统。这里所谓的流动系统是指能够将包含试料或者适体的结合缓冲器送入上述AAO传感器的系统。
上述靶物质检测用试剂盒可以采用瓶、桶(tub)、小袋(sachet)、封套(envelope)、软管、细颈瓶(ampoule)等形态，它们可以部分或者全部采用塑料、玻璃、纸、铝箔、石蜡等形成。容器可以装配能够通过机械方式、粘着方式或者其它方式附着在容器上并能够完全或者部分分离的盖子。另外，容器还可以设置能够通过注射针接触内容物的塞子。上述试剂盒可以包含外包装。同时，外包装还可以包含有关构成要素的使用说明书。
具体实施例
下面，将通过实施例对本发明进行更加详细的说明。这些实施例仅限于对本发明进行示例说明，本发明的范围并不仅仅局限于这些实施例，这一点对于具有本行业相关知识的工作人员来说是显而易见的。
特别是，在以下实施例中，虽然利用与双酚Ａ特异结合的适体确认双酚Ａ的检测效果。但是，也可以利用与其它靶物质特异结合的适体将依据本发明的方法运用于其它靶物质的检测，这一点对于具有本行业相关知识的工作人员来说是显而易见的。
实施例 1 ：与双酚Ａ特异结合的适体的分离及对其进行固定的溶胶-凝胶芯片的制造
1-1：与双酚Ａ特异结合的适体的分离
首先，将具有以下序列的随机ssDNA库化学合成之后再分离为 PAGE(Genotech Inc., Korea)。
5'-GGGCCGTTCGAACACGAGCATG-N60-GGACAGTACTCAGGTCATCCTAGG-3' (序列号 1)
对于上述ssDNA库，利用双酚Ａ-琼脂糖的亲和性，执行12次SELEX的筛选及放大过程之后，再筛选出以下总共27个双酚Ａ特异适体。
#31 5'-CGGCCCTAGG ATGACCTGAG TACTGTCCCT CACCCCTACT TCCGCCACTG GCCCAACAGC-3' (序列号2)
#23 5'-TGCCTAGGAT GACCTGAGTA CTGTCCAGGC TCCGACCTTG TCCCTGCCGC CACTCTCCCA-3' (序列号 3)
#47 5'-GCGGACGGGC TCGGCTCACC TAGGATGACC TGAGTACTGT CCCCGTGGCG CTAATTCGGG-3' (序列号 4)
#50 5'-CGGCCCGCCC CTAGGATGAC CTGAGTACTG TCCGCGGGAC GGTATCGCTG AGACAGGTGC-3' (序列号 5)
#41 5'-CGGCAGCCCT AGGATGACCT GAGTACTGTC CGCGAAAGAC TCCATGGTAC CCGGTGCTTA-3' (序列号 6)
#27 5'-GGGGGCGTCG NCCTAGGATG ACCTGAGTAC TGTCCGCACN CAGGGAGGAT GCATTGAC-3' (序列号 7)
#45 5'-GTGTCCCCAC GTCCTAGGAT GACCTGAGTA CTGTCCAATG CCGCTCCTCC CGATGCAGAC-3' (序列号 8)
#11 5'-CTCTTCNCTC CAATTCGTAA GATGACCTGA GGTCTGCCCA ACGGTGTTTA GAACCCCTTG-3' (序列号 9)
#12-3 5'-CGCAGCGCGC CCCTGAGTAC TGTCCGCCCA ACGGTGTGAC GGCCCTGCGA TCAACGATTG-3' (序列号 10)
#12-4 5'-GGGCCGTCCT AGGATGACCT GAGTACTGTC CGCCCAACGG TGTGACGGCC CTGCGATCAA-3' (序列号 11)
#22 5'-CCCTCGCCCT GAGTACTGTC CCCCGTCCGT CCGGTGAGGG CCACTATCGC TAACTGATCA-3' (序列号 12)
#4 5'-AGGCCGTTGG TGTGGTGGGC CTAGGGCCGG CGGCGCACAG CTGTTATAGA CGTCTCCAGC-3' (序列号 13)
#12-5 5'-CCGCCGTTGG TGTGGTGGGC CTAGGGCCGG CGGCGCACAG CTGTTATAGA CGTCTCCAGC-3' (序列号 14)
#6 5'-CCGCCGTTGG TGTGGTGGGC CTAGGGCCGG CGGCGCACAG CTGTTATAGA CGCCTCCAGC-3' (序列号 15)
#12-7 5'-CCGCCGTTGG TGTGGTGGGC CCAGGGCCGG CGGCGCACAG CTGTTATAGA CGCCTCCAGC-3' (序列号 16)
#12-2 5'-TGACGGTGGC GTGGAGGGCG CGTATCAATC GTTGATCGCA GGGCCGTCAT ACCGTTGGAG-3' (序列号 17)
#12-9 5'-TGACGGTGGC GTGGAGGGCG CGTATCAATC GTTGATCGCA GGGCCGTCAT ACCGTTGGGGG-3' (序列号 18)
#12-6 5'-TGACGGTGGC GTGGAGGGCG CGTATCAATC GTTGATCGCA GGGCCGTCAT ACCGGTCGGG-3' (序列号 19)
#2 5'-GCCGACAGGG CATGGGACGC TATCAGCGGT GTCAATCGAA TTCCCGCGGC CGCCATGCGG-3' (序列号 20)
#14 5'-GGTCCCCGCA GCTCATACGG CGCTCCAGCG TAATCGAATT CCCGCGGCCG CCATGCGGCC-3' (序列号 21)
#46 5'-GCGAGTGGCC CATCAGCAGA GCGTAATCCC CACGCACATC GAGTGCCCCC GGCCGGTGCT-3' (序列号 22)
#12 5'-GTATTGTCAT TCATATCCTC GTGCTTGCTG TCCTCACCCC ACCCACCAGA ATGGAAA-3' (序列号 23)
#13 5'-CCTGGTATTG TCTTGCCAAT CCTCGCCCTG GCTGTCTTAC CCCTCCCCAC CCGCCTGAAG-3' (序列号 24)
#48 5'-GTCGACTCGC GGGTACCGTG CTCAATGTCC CAATCCGGGG AAGCGTTTAG ACCCGCAGCC CAC-3' (序列号 25)
#40 5'-GTCGCCACTG CGGGTACCGT GCTTGGGCNA CCGATGNACC NTGNNACCGT GTTTNGCC-3' (序列号 26)
#3 5'-CCGGTGGGTG GTCAGGTGGG ATAGCGTTCC GCGTATGGCC CAGCGCATCA CGGGTTCGCA CCA-3' (序列号 27)
#32 5'-GGGCGGTGGG TGGCGAGTTG TGAGACGCTG GAGGAGGTTG CTGCCCCCGG CACATTGGGA-3' (序列号 28)
1-2: 溶胶 - 凝胶芯片的制造
按照下述方法制造能够固定第1适体的传感器芯片。即，将溶胶-凝胶点与阴性对照菌、适体(适体#3及#12-5)、阳性对照菌一起按照如图3所示的顺序即阳性对照菌(P)、#12-5适体、#3适体及阴性对照菌(N)顺序利用OmniGrid Accent Microarrayer (DIGI LAB, USA)固定于PMMA涂层的96-孔上制造出溶胶-凝胶芯片。
上述溶胶-凝胶点的溶胶组成物按照下述方法制造。首先，将硅酸甲酯(tetramethyl orthosilicate, TMOS)与甲基三甲氧基硅烷(methyltrimethoxysilicate, MTMS)混合制造溶胶组成物。然后，准备溶液I即100mM的HCl。
另外，将100mM的SP缓冲溶液(pH 5.8)及2次蒸馏水(double distilled water, DDW) 20㎕混合后，分别向阳性对照菌、阴性对照菌、实验菌等上述混合物中添加10㎕Cy3抗体(Santa Cruz, USA)、为阴性对照菌时，将PBS缓冲溶液、筛选的适体(适体 #3及#12-5)，经5秒涡流后自旋减慢制造出溶液II。
然后，依次将上述溶胶组成物、溶液I及溶液II分株后，将溶胶-凝胶点经13~15小时的凝胶化处理，从而制造出溶胶-凝胶芯片。
实施例 2：利用溶胶-凝胶芯片的双酚Ａ的检测
首先，利用末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase；Fermentas, Canada)和Cy3-dUTP (GeneChem, Korea) 对适体#3及#12-5进行标记后用于本实验中。不过，标记也可以按照以下方式完成：分别将5'-GGGCCGTTCGAACACGAGCATG-3' (序列号 29)等片断与用作第2适体的适体#3及#12-5的末端连接后，将Cy3附着于能与之互补结合的序列即5'-CATGCTCGTGTTCGAACGGCCC-3'(序列号 30)等核酸片断上，从而使Cy3标记的上述核酸片断与上述第2适体的上述末端片断互补结合。
然后，向在上述实施例1-2中制造的溶胶-凝胶芯片的各个孔中添加50μM的双酚Ａ和2μM的cy3-标记的适体(第2适体)。即，向各个孔中添加的情况如图3所示，向上端右侧孔中添加双酚Ａ(BPA)和适体#12-5，向下端左侧孔中仅添加缓冲溶液和适体#3，向下端右侧孔中添加BPA和适体#3，并分别进行处理和培养。然后，经过清洗过程，再通过Multi-Image分析仪(FUJIFILM, Japan)进行观察。
其结果如图3所示，只有当双酚Ａ存在的情况下，固定#12-5适体及#3适体的位置才会出现信号(用红色圆表示)，即利用依据本发明的溶胶-凝胶芯片可以特异地检测出双酚Ａ。即，依据现有技术检测及其困难的无极性低分子量的双酚Ａ也可以通过依据本发明的方法特异地检测出来。
实施例3：双酚Ａ检测用FET CNT传感器的制造
利用上述实施例1中分离的适体，并根据现有的方法(Lee, M. et al., Nat. Nanotechnol., 1:66, 2006)制造单壁碳纳米管(swCNT)-FET传感器芯片。
为了制造以甲基终结的十八烷基三氯硅烷(octadecyltrichlorosilane: OTS)自组装单层(self-assembled monolayer)无极性钝化(passivating)分子模式，利用现有的光刻法在SiO2基板上进行模式化处理。在这种情况下，将基板浸渍于单壁碳纳米管(swCNTs)的溶液(ο-二氯苯0.05mg/ml)中，然后，将swCNTs直接组装于SiO2 部位并进行排列。另外，电极通过光刻法进行模式化处理后，再通过剥离工艺(lift-off process)将Pd及Au(10nm Pd上30nm Au)进行热沉积。
然后，为了制造swCNT为基础双酚Ａ检测用传感器，将上述获得的与27个双酚Ａ特异结合的适体中#3适体(序列号27)固定于上述swCNT-FET传感器芯片的Au电极上。为了对其进行固定，首先，将芯片在10nM MCH (mercaptohexanol)溶液(中性化的水)中浸泡一夜，并利用MCH对其进行预处理。然后，将芯片放入缓冲溶液 (10nM Tris-HCl)中置于1μM适体上浸渍10小时，然后，利用与5'末端带有硫氢基 (thiol group)的双酚Ａ特异结合的ssDNA适体对金电极进行涂层，从而制造出双酚Ａ检测用FET传感器。
实施例 4：利用FET CNT传感器的双酚Ａ的检测
双酚Ａ(BPA)的电气检测可以将因BPA或者其它分子的导入而诱发的源极(source)与漏极(drain)之间的电流变化(源极-漏极偏压~0.1V)通过吉时利 4200半导体特性分析装置(Keithley 4200 Semiconductor analyser, USA)进行监测。
首先，作为对照菌监测源极-漏极间的电流变化(source-drain current change)，同时，将BPA溶液结合缓冲溶液(100mM Tris-HCl, 200mM NaCl, 25mM KCl, 10mM MgCl2, 2.5ppm DMSO)按多种浓度(1pM~100nM)向上述实施例3中制造的传感器中添加。然后，作为实验菌将与双酚Ａ特异结合的适体#3(序列号5)，即与第2适体结合的BPA也按照与上述相同的多种浓度(1pM~100nM)向上述实施例3中制造的传感器中添加(图4)。这时，按照下述方法准备与适体#3结合的BPA将其作为第2适体。 即，首先将BPA与适体溶液按相同的浓度混合后，再将混合的溶液在95℃条件下加热5分钟直至达到室温时为止，然后，冷却1~2小时。另外补充一点，在没有BPA的情况下，作为对照菌仅将含有适体#3的适体溶液按照与上述相同的条件向上述实施例3中制造的传感器中添加。
另外，为了确认制造的BPA检测用FET传感器是否只特异地检测BPA，就将具有与BPA类似结构的其它分子即双酚B(BPB)、4, 4'-双酚(BP)及6F双酚Ａ(6F) 导入1nM。
其结果如图5a所示，在只加入双酚Ａ溶液的情况下，即使是按照100nM的浓度添加，FET传感器芯片也不能够检测出溶液中的无极性分子即双酚Ａ。这是因为BPA自身不携带任何的电荷或者偶极子。与此相反，如图5b所示，依据本发明的方法在将包含双酚Ａ的试料与第2适体一起添加的情况下，可以确认其与背景信号有明确的差异。因此，可以将无极性分子即双酚Ａ从1pM中检测出来。另外，如图5c所示，在没有双酚Ａ的情况下，即使只将第2适体添加到传感器中，如图5a所示，也不会引起有意义的变化。
另外，如图5d所示，在导入具有与双酚Ａ(BPA)类似结构的双酚类即双酚B(BPB)、4, 4'-双酚(BP)及6F双酚Ａ(6F)的情况下，也不会引起有意义的电流变化。
上述实验结果表明，依据本发明的检测方法对于因现有FET传感器传输较低的电荷而不能检测的溶液中的含有低分子量无极性分子也能够特异地检测出来。
实施例 5：利用适体的多通道AAO(anodic aluminum oxide)传感器基础靶材检测。
5-1：AAO传感器的制造
在本实施例中使用的AAO(阳极氧化铝)传感器按下述方法制作。
(1)利用电子束蒸发器沉积的由1.3㎛厚的铝、5㎚厚的金与10㎚厚的钛构成的金属模式可以在具有200㎚厚二氧化硅层的硅基板上通过普通的光刻(photolithography)及lift-off方法制作。
(2)阳极氧化铝的纳米大小多孔的直径约75㎚，可通过2步骤阳极氧化过程制作(Masuda, H., Fukuda, K., 1995. Science 268 (5216), 1466–1468)。将阳极氧化的1步骤中沉积的铝膜在常温条件下浸入0.3 M的草酸中施加40V的恒定电压经过5分钟从而完成对阳极的处理。将这种阳极氧化铝膜在70◦C条件下浸入1.8 % (wt)的铬酸中溶解后再进行5分钟的阳极处理。将阳极氧化铝的临界层在常温条件下浸入6% (wt)的磷酸溶液中将其除去，然后，在阳极氧化铝区域外侧会沉积450 ㎚厚的二氧化硅。
(3)构成底部电极的金纳米线是使用硫酸在按pH4配的1mM的氯金酸(HAuCl4)电解质溶液中施加1.1V的恒定电压电积于纳米线内部，金电极的上部(0.3 X 5.5 ㎜) 是在阳极氧化铝区域内利用光刻和lift-off方法制作。
(4)然后，使PDMA微细流动通道紧贴于传感器上。
5-2：利用AAO传感器的靶物质的检测。
将实施例5-1中制造的AAO传感器与流动系统连接后，再将3’末端带有硫氢基的适体(序列号27的#3适体)10nM溶于结合缓冲器(25mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 25mM KCl, 10mM MgCl2, pH 8.0)中，然后按 0.1ml/hr的速度流入。同时，将其孵化一夜。由于在AAO传感器的表面涂覆有金粒子，因此，金粒子与适体3’末端的硫氢基构成共价键，就可以使适体与AAO传感器的表面结合。作为对照菌，在没有适体的情况下可以使用仅加入结合缓冲器后孵化的传感器。使双酚Ａ结合缓冲器按0.5ml/hr的速度流入，同时将其清洗1小时，然后，按照标准缓冲溶液的水平准备。流入1nM，10nM，100nM 浓度的双酚Ａ后，再通过结合缓冲器进行清洗，然后再测定传感器的静电容量 (capacitance, nF)。为了确定测定静电容量的频率，就需要进行扫频实验。
使频率从0到1000赫兹之间变化，再将使适体与传感器结合时与使双酚Ａ流入时的静电容量进行比较，如图7所示，在100赫兹时出现最理想的结果。因此，在实验中测定100赫兹时的静电容量。
另外，利用未与适体结合的AAO传感器作为对照菌并利用与适体结合的AAO传感器作为实验菌进行双酚Ａ的检测实验。
其结果如图8a所示，未与适体结合的AAO传感器中流入双酚Ａ时静电容量没有变化。相反，如图8b所示，与适体结合的AAO传感器中流入10nM的双酚Ａ时静电容量减少25%，当流入100nM的双酚Ａ时减少36.1%。
同时，当双酚Ａ按照1nM，10nM，100nM的浓度流入时，静电容量的变化以函数图来表示。其结果如图9所示，当浓度达到1nM之前，稍微存在一些误差。但是，画面的函数图大体成直线形状。
上述实验结果表明，基于依据本发明AAO传感器的检测方法，对于因传输太低的电荷而不能检测的溶液中含有的低分子量无极性分子也能够特异地检测出来。
工业实用性
如上所述，利用依据本发明适体的靶物质检测方法及检测用试剂盒，对于依据现有技术很难检测的低分子量物质也能够检测出来，从而可以检测出存在于溶液中的疾病相关的代谢物、环境污染物及食品毒素等，作为一种直接而简便的方法，利用能够按一贯性再生产并且能够以较低费用生产的适体，因此也可以提高其经济性。
在上述说明中，对本发明内容的特定部分进行了详细叙述，对于具有本行业相关知识的工作人员来说，这种具体的技术只是理想的实施形态，并不意味着本发明的范围仅限定于此。因此，必须根据权利要求项确定本发明的实际范围。
序列表
<110> 东国大学校产学协力团
<120> 利用适体的靶物质检测方法
<130> FP11KR1320
<140> PCT/KR2010/000952
<141> 2010-02-16
<150> 10-2009-0012287
<151> 2009-02-16
<150> 10-2009-0012288
<151> 2009-02-16
<160> 30
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 106
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 任意ssDNA 文库
<220>
<221> 混合特征
<222> (23)..(82)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 1
gggccgttcg aacacgagca tgnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnggacagta ctcaggtcat cctagg 106
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 双酚A适体
<400> 2
cggccctagg atgacctgag tactgtccct cacccctact tccgccactg gcccaacagc 60
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 双酚A适体
<400> 3
tgcctaggat gacctgagta ctgtccaggc tccgaccttg tccctgccgc cactctccca 60
<210> 4
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 双酚A适体
<400> 4
gcggacgggc tcggctcacc taggatgacc tgagtactgt ccccgtggcg ctaattcggg 60
<210> 5
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 双酚A适体
<400> 5
cggcccgccc ctaggatgac ctgagtactg tccgcgggac ggtatcgctg agacaggtgc 60
<210> 6
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 双酚A适体
<400> 6
cggcagccct aggatgacct gagtactgtc cgcgaaagac tccatggtac ccggtgctta 60
<210> 7
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 双酚A适体
<220>
<221> 混合特征
<222> (11)..(11)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> 混合特征
<222> (40)..(40)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 7
gggggcgtcg ncctaggatg acctgagtac tgtccgcacn cagggaggat gcattgac 58
<210> 8
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 双酚A适体
<400> 8
gtgtccccac gtcctaggat gacctgagta ctgtccaatg ccgctcctcc cgatgcagac 60
<210> 9
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 双酚A适体
<220>
<221> 混合特征
<222> (7)..(7)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 9
ctcttcnctc caattcgtaa gatgacctga ggtctgccca acggtgttta gaaccccttg 60
<210> 10
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 双酚A适体
<400> 10
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<210> 11
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 双酚A适体
<400> 11
gggccgtcct aggatgacct gagtactgtc cgcccaacgg tgtgacggcc ctgcgatcaa 60
<210> 12
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 双酚A适体
<400> 12
ccctcgccct gagtactgtc ccccgtccgt ccggtgaggg ccactatcgc taactgatca 60
<210> 13
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 双酚A适体
<400> 13
aggccgttgg tgtggtgggc ctagggccgg cggcgcacag ctgttataga cgtctccagc 60
<210> 14
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 双酚A适体
<400> 14
ccgccgttgg tgtggtgggc ctagggccgg cggcgcacag ctgttataga cgtctccagc 60
<210> 15
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 双酚A适体
<400> 15
ccgccgttgg tgtggtgggc ctagggccgg cggcgcacag ctgttataga cgcctccagc 60
<210> 16
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 双酚A适体
<400> 16
ccgccgttgg tgtggtgggc ccagggccgg cggcgcacag ctgttataga cgcctccagc 60
<210> 17
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 双酚A适体
<400> 17
tgacggtggc gtggagggcg cgtatcaatc gttgatcgca gggccgtcat accgttggag 60
<210> 18
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 双酚A适体
<400> 18
tgacggtggc gtggagggcg cgtatcaatc gttgatcgca gggccgtcat accgttgggg 60
g 61
<210> 19
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 双酚A适体
<400> 19
tgacggtggc gtggagggcg cgtatcaatc gttgatcgca gggccgtcat accggtcggg 60
<210> 20
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 双酚A适体
<400> 20
gccgacaggg catgggacgc tatcagcggt gtcaatcgaa ttcccgcggc cgccatgcgg 60
<210> 21
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 双酚A适体
<400> 21
ggtccccgca gctcatacgg cgctccagcg taatcgaatt cccgcggccg ccatgcggcc 60
<210> 22
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 双酚A适体
<400> 22
gcgagtggcc catcagcaga gcgtaatccc cacgcacatc gagtgccccc ggccggtgct 60
<210> 23
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 双酚A适体
<400> 23
gtattgtcat tcatatcctc gtgcttgctg tcctcacccc acccaccaga atggaaa 57
<210> 24
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 双酚A适体
<400> 24
cctggtattg tcttgccaat cctcgccctg gctgtcttac ccctccccac ccgcctgaag 60
<210> 25
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 双酚A适体
<400> 25
gtcgactcgc gggtaccgtg ctcaatgtcc caatccgggg aagcgtttag acccgcagcc 60
cac 63
<210> 26
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 双酚A适体
<220>
<221> 混合特征
<222> (29)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> 混合特征
<222> (37)..(37)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> 混合特征
<222> (41)..(41)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> 混合特征
<222> (44)..(45)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> 混合特征
<222> (55)..(55)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 26
gtcgccactg cgggtaccgt gcttgggcna ccgatgnacc ntgnnaccgt gtttngcc 58
<210> 27
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 双酚A适体
<400> 27
ccggtgggtg gtcaggtggg atagcgttcc gcgtatggcc cagcgcatca cgggttcgca 60
cca 63
<210> 28
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 双酚A适体
<400> 28
gggcggtggg tggcgagttg tgagacgctg gaggaggttg ctgcccccgg cacattggga 60
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 结合第二适体的片段
<400> 29
gggccgttcg aacacgagca tg 22
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Cy3-结合片段
<400> 30
catgctcgtg ttcgaacggc cc 22

Claims (28)

1.一种利用适体检测小的无极性分子的方法，其特征在于，其包括如下几个步骤：
(a)向固定于固相载体且与小的无极性分子特异结合的第1适体中，添加含有上述小的无极性分子的试料以及与上述小的无极性分子特异结合且附着有标志物的第2适体，并使其反应，其中所述试料为从水、土壤、空气、食品、废弃物、及植物脏器和组织中的一种或以上中提取，其中所述第1适体通过溶胶-凝胶法与溶胶组合物混合并固定在固相上；和
(b)分析上述标志物并检测上述小的无极性分子，
其中第1适体和第2适体是从序列号2至28的核酸序列所示的适体中选择。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，上述标志物为荧光物质。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，上述荧光物质的分析是通过测定上述荧光物质的发光或者颜色变化而实现的。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，上述小的无极性分子为双酚A。
5.一种利用适体检测小的无极性分子的方法，其特征在于，包括如下几个步骤：
(a)向固定于固相载体上且与小的无极性分子特异结合的第1适体中，添加含有上述小的无极性分子的试料以及与上述小的无极性分子特异结合的第2适体，并使其反应，其中所述试料为从水、土壤、空气、食品、废弃物、及植物脏器和组织中的一种或以上中提取，其中所述第1适体通过溶胶-凝胶法与溶胶组合物混合并固定在固相上；
(b)使标志物与上述第2适体结合；和
(c)分析上述标志物并检测上述小的无极性分子，
其中第1适体和第2适体是从序列号2至28的核酸序列所示的适体中选择。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，上述(b)步骤使附着有标志物并与上述第2适体互补结合的核酸片段与上述第2适体互补结合。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，上述核酸片段与第2适体的末端互补结合。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，上述标志物为荧光物质。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，上述荧光物质的分析是通过测定上述荧光物质的发光或者颜色变化而实现的。
10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，上述小的无极性分子为双酚A。
11.一种小的无极性分子检测用试剂盒，其特征在于，包括：在溶胶-凝胶点中固定有与上述小的无极性分子特异结合的第1适体的固相载体；以及含有与上述小的无极性分子特异结合的第2适体的检测试剂，其中第1适体和第2适体是从序列号2至28的核酸序列所示的适体中选择。
12.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，上述第2适体与标志物结合。
13.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，还包含具有附着标志物并与上述第2适体互补结合的核酸片段。
14.一种双酚A检测用试剂盒，其特征在于，包括：
固定有与双酚A特异结合的第1适体的固相载体；和
含有与附着标志物的双酚A特异结合的第2适体的检测试剂，
且上述第1适体和第2适体是从序列号2至28的核酸序列所示的适体中选择。
15.一种利用适体的场效应晶体管(FET)传感器基础的小的无极性分子检测方法，其特征在于，包括如下几个步骤：
(a)在包含基板、在上述基板两侧相互分离形成的源极及漏极、与上述源极及漏极接触并在基板上形成的入口，并且与小的无极性分子特异结合的第1适体作为探测器固定于上述源极表面、入口表面及漏极表面中任意一个上的FET传感器中，添加含有上述小的无极性分子的试料及与上述小的无极性分子特异结合的第2适体，所述试料从水、土壤、空气、食品、废弃物、植物脏器及组织中任意一种或以上中提取；和
(b)测定当上述小的无极性分子和第2适体与固定于上述FET传感器上的第1适体结合时产生的上述FET传感器的源极及漏极间流动的电流变化而检测小的无极性分子，
其中第1适体和第2适体是从序列号2至28的核酸序列所示的适体中选择。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，上述金属电极可以由金、铂、铬、铜、铝、镍、钯及钛构成的组中选择的任意一种或以上形成。
17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，碳纳米管沉积于基板上并与上述源极及漏极接触形成通道区，上述第1适体固定于上述金属电极表面。
18.如权利要求15所述的方法，其特征在于，上述小的无极性分子为双酚A。
19.一种小的无极性分子检测用试剂盒，其特征在于，包括：
FET传感器，该传感器包含基板、在上述基板两侧相互分离形成的源极及漏极、以及与上述源极及漏极接触并在基板上形成的入口；且与小的无极性分子特异结合的第1适体作为探测器固定于上述源极表面、入口表面及漏极表面中任意一个上，和
含有与上述小的无极性分子特异结合的第2适体的检测试剂，
其中第1适体和第2适体是从序列号2至28的核酸序列所示的适体中选择。
20.如权利要求19所述的试剂盒，其特征在于，上述金属电极可以从由金、铂、铬、铜、铝、镍、钯及钛构成的组选择任意一种或以上而形成。
21.如权利要求19所述的试剂盒，其特征在于，碳纳米管沉积于基板上并与上述源极及漏极接触构成通道区，上述第1适体固定于上述金属电极表面。
22.一种双酚A检测用试剂盒，其特征在于，包括：
FET传感器，该传感器包含基板、在上述基板两侧相互分离形成的Au电极、以及含有与上述Au电极接触并在上述基板上形成通道的单壁碳纳米管的通道区，且上述传感器中与双酚A特异结合的第1适体作为探测器固定于上述Au电极表面；和
含有与双酚A特异结合的第2适体的检测试剂，
且上述第1适体和第2适体是从序列号2至28的核酸序列所示的适体中选择。
23.一种利用适体的阳极氧化铝(AAO)传感器基础小的无极性分子检测方法，其特征在于，包括如下几个步骤：
(a)在包含基板、在上述基板上形成具有纳米大小的孔的阳极氧化铝、以及在上述阳极氧化铝的表面进行涂覆的金属；并且把与小的无极性分子特异结合的适体作为探测器固定于上述金属表面的AAO传感器中添加含有小的无极性分子的试料，所述试料从水、土壤、空气、食品、废弃物、植物脏器及组织中任意一种或以上中提取；和
(b)测定当上述小的无极性分子与适体结合时产生的上述AAO传感器的静电容量的变化并检测小的无极性分子，
其中第1适体和第2适体是从序列号2至28的核酸序列所示的适体中选择。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，上述金属为金。
25.如权利要求23所述的方法，其特征在于，上述适体的AAO传感器的固定利用与适体的一个末端结合的功能基实现。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，上述功能基为硫氢基。
27.如权利要求23所述的方法，其特征在于，上述AAO传感器与流动系统连接。
28.如权利要求23所述的方法，其特征在于，上述小的无极性分子为双酚A。
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