CN102379316A - 一种抗茎点霉病菌和菌核病菌的中药组合物、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

一种抗茎点霉病菌和菌核病菌的中药组合物，含有活性成分秦皮或其提取物以及活性成分白藓皮或其提取物，其质量百分数分别为：秦皮或其提取物30%-90%，白藓皮或其提取物10%-70%。其制剂经乙醇浸泡、超声波提取、萃取、浓缩等步骤制备，对茎点霉病菌和菌核病菌抑菌率可达到90%以上，具有效果确切、药效长、无毒副作用，生产制作成本低廉等优点，可克服现有化学药物存在的易引发病原菌耐药性、导致化学试剂残留超标、不符合无公害要求等问题。

Description

一种抗茎点霉病菌和菌核病菌的中药组合物、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物农药技术领域，特别是涉及一种抗茎点霉病菌和菌核病菌的中药组合物，以及在制备抗茎点霉病菌和菌核病菌生物制剂中的应用。

背景技术

茎点霉属真菌(phoma)属半知菌纲、壳霉科。它分布广泛，能侵染多种植物，是引起很多植物斑病、枯病的主要病原真菌。张剑斌等发现茎点霉是杜松赤枯病病原菌之一；G. Bohar等发现茎点霉是引起豚草属叶斑病的病原菌；A. Garibaldi等报道了茎点霉引起杰克曼铁线莲发病；V. Gavrilovic等报道了茎点霉引起欧洲酸樱桃发病；S. G. Bobev等首次报道茎点霉是药用水苏属植物的病原菌；C. R. Hollingsworth 等报道茎点霉是紫花苜蓿褐根腐病的病原菌。可见，茎点霉在世界各地不同种类的植物上均可引起病害。国内外对于茎点霉的研究涉及铁线莲、欧洲酸樱桃、紫花苜蓿、黄瓜、桑树等植物，对于桑树，茎点霉病菌主要位于桑枝上，是使桑树茎干产生斑、枯病症的主要致病菌，最近也有文章报道，桑茎点霉病菌也作用于桑椹，是桑椹的致病菌之一。

对于由茎点霉属真菌引起的叶斑、茎枯、黒茎等病害，其主要防治方法为化学防治，主要药剂包括：50%多菌灵可湿性粉剂500-800倍液、50%托布津可湿性粉剂500-800倍液、70％代森锰锌600-800倍液、1％波尔多液、75％百菌清500-800倍液、1：1：160波尔多液、30%氧氯化铜600-800倍液、75%百菌清可湿性粉剂500-600倍液等。但这些防治方法会导致化学药剂大量残留于农作物，对环境造成污染，对人体，牲畜等产生危害。

中药因具有资源丰富，残留少，副作用小等特点，利用中药提取物进行植物病害的防治具有高效、绿色、环保等化学药品无法比拟的优势。但到目前为止，尚无有关利用中草药防治茎点霉病菌和菌核病菌的研究报道。

发明内容

鉴于现有技术存在的缺陷，本发明旨在提供一种抗茎点霉病菌和菌核病菌的中药组合物。

本发明的另一个目的在于提供一种该中药组合物制剂的制备方法。

本发明还有一个目的在于提供该中药组合物制剂在制备抗植物茎点霉病菌和菌核病菌生物制剂中的应用。

本发明的目的是通过下述方式实现的：

本发明所述的一种抗茎点霉病菌和菌核病菌的中药组合物，含有活性成分秦皮或其提取物以及活性成分白藓皮或其提取物，其质量百分数分别为：秦皮或其提取物30%-90%，白藓皮或其提取物10%-70%。

进一步，本发明所述的活性成分较佳的质量百分数为：秦皮或其提取物70%-90%，白藓皮或其提取物10%-30%。

更进一步，本发明所述的活性成分最佳的质量百分数为：秦皮或其提取物85%，白藓皮或其提取物15%。

本发明所述的一种抗茎点霉病菌和菌核病菌的中药组合物制剂，制备方法如下：

（1）按比例称取秦皮，研细成粉，按W：V=1：1~1：10的比例加入质量比浓度为20~90%的乙醇，浸泡24 h，超声波提取4-8 h，抽滤；残渣再重复提取2~4次，合并抽提液，浓缩得到含水量为20%的秦皮提取物；

（2）按比例称取白藓皮，研细成粉，按W：V=1：1~1：10的比例加入质量比浓度为20~90%的乙醇，浸泡24 h，超声波提取4-8 h，抽滤；残渣再重复提取2~4次，合并抽提液，浓缩得到含水量为20%的白藓皮提取物；

（3）将步骤（1）所得的秦皮提取物与步骤（2）所得的白藓皮提取物按前述比例混匀，按常规加入辅料，并进行剂型化设计，即得本发明所述的中药组合物制剂。

秦皮是我国民间常用中药。秦皮，别名岑皮（《淮南万毕术》）、梣皮（《别录》）、樊槻皮（陶弘景）、秦白皮（《药性论》）、蜡树皮（《中药志》）、苦榴皮（《全展选编·皮肤病》）等，为木犀科植物苦枥白蜡树Fraxinus rhynchophylla Hance、白蜡树Fraxinus chinensis Roxb.、尖叶白蜡树Fraxinus szaboana Lingelsh.或宿柱白蜡树Fraxinus stylosa Lingelsh.的干燥枝皮或干皮，主产陕西、河北、河南、山西、辽宁、吉林等地。秦皮中主要成分为香豆素类（秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷、秦皮素宿柱白蜡苷、6，7-二甲氧基-8-羟基香豆素等），此外，还有酚型、皂苷和鞣质等。秦皮不但资源丰富、价格低廉，还具有诸多的药理活性，如消炎、镇痛；利尿；治疗细菌性痢疾、慢性支气管炎等。此外，通过大量的实验证明，秦皮还具有显著的抗真菌作用。

白藓皮，别名白藓皮、北鲜皮、八股牛、山牡丹、羊鲜草等，多年生草本，全株有特异的刺激味，为芸香科植物白鲜Dictamnus dasycarpus Turcz.的干燥根皮，主产辽宁、河北、四川、江苏、浙江、安徽等地，也是民间常用中药。白藓皮其根含白鲜碱、白鲜内酯、谷甾醇、黄柏酮酸、胡芦巴碱、胆碱、梣皮酮。 尚含菜油甾醇、茵芋碱、γ-崖椒碱、白鲜明碱。 地上部分含有补骨脂素和花椒毒素等。白藓皮在分布广泛的同时，同样具有广泛的药理活性，如清热燥湿、祛风解毒，可用于湿热疮毒、黄水淋漓、湿疹、风疹、疥癣疮癞、风湿热痹、黄疸尿赤等，另外，白藓皮还具有不错的抗菌、抗癌作用。

虽然两种中药材均有一定的抑菌、抗菌效用，但各自起作用的菌的种类不尽相同，对于有植物茎点霉病菌和菌核病菌参与、多种病原菌共同导致的菌核病，以及茎枯、黒茎等斑、枯病症，单一用药的效果显然不够。

而本发明含有以上两种中药材的多种活性成分，在抑菌、抗菌过程中各有效成分相互配合、相互补充，协同作用，其药效已不仅仅是两种药的简单叠加。具有显著的抑菌、抗菌功效，适用于抑制植物茎点霉病菌和植物菌核病菌。实验结果表明，相同的药物浓度下，本发明中药组合物制剂较两种药物单独使用时的抑菌作用更强、更明显；在剂量相同的情况下，本发明对植物茎点霉病菌和植物菌核病菌的抑制作用明显强于活性成分单独给药（详见实验验证部分）。

本发明具有以下优点：

（1）本中药组合物制剂具有广谱抗菌作用，对金黄色葡萄球菌、福氏痢疾杆菌、宋内氏痢疾杆菌有显著的抑制作用，对茎点霉病菌和菌核病菌抑菌率可达到90%以上。

（2）由于秦皮与白藓皮二者均系常用药材，成分明确、质量可控，故本发明的中药组合物制剂效果确切、无毒副作用，对人和其它牲畜等无不良影响。

（3）药效长：本发明产品是中草药提取物，对光和温度具有较强的稳定性，可以保持较长时间的药效。

（4）改良土壤效果显著：本发明的中药组合物制剂的生产原料为植物，对土壤改良效果显著，它能在很大程度上减少土壤中的病原菌，从而给农业生产实现增产增收打下了良好的物质基础。            

（5）提高农业投入产出效率：本制剂生产原料来源广泛，生产制作成本低廉。

（6）本发明还可克服现有化学药物存在的易引发病原菌耐药性、导致化学试剂残留超标、不符合无公害要求等问题。

本发明中药组合物的最终形态可以是将有效药用成分与药物可以接受的辅料混合，再用水调兑成方便使用的药剂形式。

以下实验结果及其阐述均以桑树茎点霉病菌和桑椹肥大性菌核病菌为例

本发明组合物抗菌剂的使用方法如下：

使用时，将提取物按0.5%~10.0%的质量比例混合于水中，即0.5~10 ml抗菌剂混合在99.5~90ml水中；喷洒剂量按每5天每棵树100~500ml喷施。

为验证本发明的抑菌、杀菌效果，发明人做了大量的试验将本发明的药物与两味主药单独使用时的药效情况做了比较，发现本发明中药组合物对桑茎点霉病菌和桑椹肥大性菌核病菌的抑制作用明显加强，可以很好的用于茎枯、黒茎等斑、枯病症以及桑椹菌核病的防治，是一种应用前景良好的生物制剂。

通过大量试验、预实验的筛选，分别从实验室平板实验和田间试验两方面对两种药物和本发明中药组合物（以85%的秦皮及其提取物和15%的白藓皮及其提取物为例）的抑菌效果，以及他们之间存在的效果差异进行比较。

1、实验室平板实验

采用药基混合法进行试验。将28.5 mL经灭菌的半固体培养基和1.5 mL中药提取液混匀，分装于3个培养皿中，冷却凝固，接种直径6 mm的供试菌落于混合培养基正中培养。分别培养2 d、4 d后目测观察，采用十字交叉法测量菌丝生长直径，以菌丝生长速率法测定各种中草药提取物对病原菌菌丝生长的抑制率。每处理重复3次，同时设对照组。根据下列公式计算抑制率：抑菌率=（对照菌落直径－处理菌落直径）/（对照菌落直径－接种菌落直径）×100% 。

表1   本发明中药组合物与单味药物的抑菌效果对比

实验结果表明，单味药物秦皮、白藓皮无论是对桑茎点霉病菌还是对桑椹菌核病菌都有很好的抑制效果，同时也可以发现，本发明所述的中药组合物的抑制效果要明显高于单味药物。

2、田间试验

为验证中草药提取物对肥大性菌核病的防治（治疗）效果，在背风地块选择间隔一定距离的桑树（鸡桑 M.australis Poir.），配制桑椹菌核病菌菌悬液，喷洒于盛开期的桑树雌花上，使其感染桑椹肥大性菌核病。两天后，再喷洒质量浓度为0.025 g/mL的初筛中草药提取物（抑菌率在75%以上），分别设置阴性和阳性对照，桑椹成熟后，就桑椹的外观形态进行统计分析，发病率=发病桑椹数/调查桑椹总数×100% 。

表2   本发明中药组合物与单味药物的田间抑菌效果对比

表2中处理组与对照组之间差异非常显著，故从表2可以看出，无论是单味药物或中药组合物，都能显著的降低肥大性桑椹菌核病的发病率，但本发明所述的中药组合物的效果更为明显。

3、毒性试验

家蚕是非常娇贵的昆虫，对毒物很敏感，能检出人致死量十万分之一的任何毒物，可以检出食物中毒菌和医院内、农产品和食品，水和土壤等环境中的人类病原菌（Tazima，1978）。有研究报道，将杀灭天牛的有机磷农药MEP乳剂稀释5万倍后经口投药进入家蚕幼虫体内，能观测到典型的中毒症状（Sugiyama，1980）。近年来，日本学者利用无菌蚕不同的发育阶段，进行重金属的毒性检测，对单一或混合重金属引起的毒性反应以及家蚕后代体内微量残留的重金属进行了成功检测（增井博之，2002）。以家蚕的致死性为指标，还可以检出黄曲霉素和农产品的残留农药（Kaito，2002）。其他的系列研究表明，家蚕作为环境检测，具备敏感、易行和快速的特点，可广泛应用于农药残留生物学效应、环境致癌致突变因子检测和环境激素检测等多个领域。依据中华人民共和国国家环境保护总局《化学农药环境安全评价试验准则》，采用食下毒叶法测定供试中草药对家蚕的毒性。将药剂用蒸馏水稀释成5个系列浓度（1.56 mg/mL、3.1 mg/mL、6.25 mg/mL、12.5 mg/mL、25 mg/mL）进行预试验，并最终选择最大浓度25 mg/mL（与田间试验所用药剂浓度相同）继续进行实验。从桑树枝条上采摘第2、3位健康的叶片，擦干净叶面上的尘土等杂物，选取抑菌率在75%以上的中草药提取物，喷洒在桑叶上（或均匀涂抹，使其页面完全浸湿），室温自然风干。用其饲喂1龄第2天家蚕（大造）幼虫，连续添食21天，以不喷洒中草药提取物的桑叶饲喂的幼虫为对照，实验分为四个组，每组五个重复处理（对照组三个重复），每个处理25头蚕。比较观察家蚕幼虫的龄期经过、蛹的健康状况，并调查化蛹率、全茧量和茧层量等。

表3   本发明中药组合物与单味药物对家蚕生长发育和产茧量的影响

如表3所示，对照组与处理组之间无显著性差异，说明3处理组对家蚕的生长发育及吐丝营茧无不良影响，可用于果叶两用桑园的茎枯、黒茎等斑、枯病症和桑椹肥大性菌核病的防治。

以上实验结果显示，本发明所述的中药组合物制剂无论是通过实验室试验还是田间验证，均证明了其具有显著的抑制桑茎点霉病菌和桑椹菌核病菌的作用（强于单味药物）。同时还证明了它对家蚕并无毒害作用。故本发明中药组合物是一种应用前景十分良好的主要针对桑茎点霉病菌和桑椹菌核病菌的生物农药式制剂。

具体实施方式

下面通过具体实施例来进一步说明本发明的技术方案。

用乙醇加热连续回流提取等方法，从秦皮和白藓皮中提取有效成分。取供试中草药秦皮100 g，研细成粉，加入质量比浓度20~90%乙醇600 mL浸泡24 h，超声波提取4 h，抽滤；药渣再加入质量比浓度20~90%乙醇500 mL后用超声波提取8 h，抽滤；药渣再加入质量比浓度20~90%乙醇500 mL用超声波提取4 h。将3次提取液合并，低温低压浓缩至无醇味，再进行3-4次萃取、浓缩，用质量比浓度70%乙醇溶解浸膏并定容至200 mL（终浓度0.5 g/mL），即得到秦皮提取物，4 ℃密封保存备用。白藓皮提取物的获得方法同上。所得提取物用于以下实施例。

实施例 1

将秦皮提取物和白藓皮提取物按体积比3：7进行混合，如取3 mL秦皮提取物、7 mL白藓皮提取物，用水定容至200 mL，即得到本发明所述的质量份数：秦皮提取物30%，白藓皮提取物70%的中药组合物抗菌剂。本例中药组合物制剂对两种菌的平均抑制率分别为：桑茎点霉病菌88.81%；桑椹菌核病菌88.35%。

实施例 2

将秦皮提取物和白藓皮提取物按体积比5：5进行混合，如取5 mL秦皮提取物、5 mL白藓皮提取物，用水定容至200 mL，即得到本发明所述的质量份数：秦皮提取物50%，白藓皮提取物50%的中药组合物抗菌剂。本例中药组合物制剂对两种菌的平均抑制率分别为：桑茎点霉病菌89.37%；桑椹菌核病菌88.64%。

实施例 3

将秦皮提取物和白藓皮提取物按体积比7：3进行混合，如取7 mL秦皮提取物、3 mL白藓皮提取物，用水定容至200 mL，即得到本发明所述的较佳质量份数：秦皮提取物70%，白藓皮提取物30%的中药组合物抗菌剂。本例中药组合物制剂对两种菌的平均抑制率分别为：桑茎点霉病菌90.34%；桑椹菌核病菌89.57%。

实施例 4

将秦皮提取物和白藓皮提取物按体积比9：1进行混合，如取9 mL秦皮提取物、1 mL白藓皮提取物，用水定容至200 mL，即得到本发明所述的较佳质量份数：秦皮提取物90%，白藓皮提取物10%的中药组合物抗菌剂。本例中药组合物制剂对两种菌的平均抑制率分别为：桑茎点霉病菌91.06%；桑椹菌核病菌89.91%。

实施例 5

将秦皮提取物和白藓皮提取物按体积比17：3进行混合，如取8.5 mL秦皮提取物、1.5 mL白藓皮提取物，用水定容至200 mL，即得到本发明所述的最佳质量份数：秦皮提取物85%，白藓皮提取物15%的中药组合物抗菌剂。本例中药组合物制剂对两种菌的平均抑制率分别为：桑茎点霉病菌91.99%；桑椹菌核病菌90.69%。

实施例 6 

取秦皮85 g、白藓皮15 g，研成细粉，混合均匀，加入质量比浓度20~90%乙醇600 mL浸泡24 h，超声波提取4 h，抽滤；药渣再加入质量比浓度20~90%乙醇500 mL后用超声波提取8 h，抽滤；药渣再加入质量比浓度20~90%乙醇500 mL用超声波提取4 h。将3次提取液合并，低温低压浓缩至无醇味，再进行3-4次萃取、浓缩，用质量比浓度70%乙醇溶解浸膏并定容至4000 mL（终浓度0.025 g/mL），即得本发明所述的最佳质量份数：秦皮或其提取物85%，白藓皮或其提取物15%的中药组合物抗菌剂。

Claims (5)

1.一种抗茎点霉病菌和菌核病菌的中药组合物，其特征在于含有活性成分秦皮或其提取物以及活性成分白藓皮或其提取物，其质量百分数分别为：秦皮或其提取物30%-90%，白藓皮或其提取物10%-70%。

2.根据权利要求1所述的一种抗茎点霉病菌和菌核病菌的中药组合物，其特征在于，所述活性成分的质量百分数为：秦皮或其提取物70%-90%，白藓皮或其提取物10%-30%。

3.根据权利要求1所述的一种抗茎点霉病菌和菌核病菌的中药组合物，其特征在于，所述活性成分的质量百分数为：秦皮或其提取物85%，白藓皮或其提取物15% 。

4.根据权利要求1、2或3所述的一种抗茎点霉病菌和菌核病菌的中药组合物，其特征在于，其制剂可有效防治植物菌核病，对引发菌核病、茎枯、黒茎等植物病害的两种致病菌茎点霉病菌和菌核病菌均有显著的抑制作用。

5.一种抗茎点霉病菌和菌核病菌的中药组合物制剂，其特征在于制备方法如下：

（1）按比例称取秦皮，研细成粉，按W：V=1：1~1：10的比例加入质量比浓度为20~90%的乙醇，浸泡24 h，超声波提取4-8 h，抽滤；残渣再重复提取2~4次，合并抽提液，浓缩得到含水量为20%的秦皮提取物；

（2）按比例称取白藓皮，研细成粉，按W：V=1：1~1：10的比例加入质量比浓度为20~90%的乙醇，浸泡24 h，超声波提取4-8 h，抽滤；残渣再重复提取2~4次，合并抽提液，浓缩得到含水量为20%的白藓皮提取物；

（3）将步骤（1）所得的秦皮提取物与步骤（2）所得的白藓皮提取物按前述比例混匀，按常规加入辅料，并进行剂型化设计，即得本发明所述的中药组合物制剂。