CN102352332B - 固氮类芽孢杆菌1-43及其应用 - Google Patents

固氮类芽孢杆菌1-43及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株具有固氮能力的类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）菌株1-43，其保藏编号为CGMCC No.4965。该菌具有固氮酶结构基因nifH，乙炔还原法测定其固氮酶活为904.49nmolC2H4/(mgprotein h)。本发明提供的固氮类芽孢杆菌菌株1-43对多种植物病原菌有明显的抑制作用，将本发明的菌株1-43制成固氮微生物菌剂或生物有机肥可对植物种子的萌发生长产生明显的促进作用，可在农业生产中推广使用，有效降低尿素使用量。

Description

固氮类芽孢杆菌1-43及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种具有固氮能力的固氮类芽孢杆菌1-43及其应用。 
背景技术
禾本科作物如小麦、玉米和水稻等是全世界约65亿人口主要的食物。随着化肥工业的兴起，提高农作物的产量主要依赖于增加化学氮肥的施用量。我国是世界上最大的化肥生产国和消费国，每年化肥施用量高达4800万吨，其中氮肥2800万吨，磷肥1200万吨(P2O5)，而且耕地面积下降的情况下，化肥的年总需求不降反升。然而，只有少于30％施用的化肥能被利用，(Van Kessel et al.，2009)，过量施用氮肥所产生的氮氧化物每公斤对增温的影响大约是二氧化碳的298倍，而每年我国生产氮肥耗能达1亿吨标准煤，生产和使用过程中共排放了5亿吨二氧化碳当量，扣除氮肥施用作物增产所固定的0.7亿吨二氧化碳，温室气体净排放量达4.3亿吨二氧化碳，约占全国总排放量的8％。化肥的过量施用，导致土壤可吸收态微量元素含量下降，同时造成土壤中氟和重金属污染，导致土壤酸化严重，重金属、硝态氮在土壤中累积，土壤板结，肥力下降。大部分氮肥通过渗漏、挥发及硝化与反硝化等途径损失，一部分化肥随雨水进入江河湖泊，造成水体的富营养化，我国有80％以上的湖泊受到污染(IV类--劣V类)。按照世界卫生组织标准，我国地下水硝酸盐总体超标率为29.91％。菜地硝酸盐浓度在100ppm以上，设施蔬菜超过200ppm，严重威胁到食品安全与国民健康。 
而生物固氮不仅可以有效的减少化肥的使用量，提高化肥的利用率，而且还可以改善土壤物理性状，提高土壤肥力，增加有机质，从而提高农作物对营养的吸收，改善根际微生态系统，从而降低农业生产成本， 实现农业的可持续发展。 
根据固氮微生物与宿主植物之间的结合关系，可以将固氮作用分为共生固氮、联合固氮和自生固氮(尤崇杓主编，生物固氮，科学出版社，1987)。共生固氮微生物是与其它共生紧密生活在一起，形成特殊的共生结构进行固氮的一类微生物。它们一般生活在根瘤内，以宿主植物提供的光合产物为能源进行固氮，从而为宿主植物生长提供氮素营养。共生固氮效率高，固氮量大，是迄今研究的最为清楚的固氮体系；但其宿主范围及其狭窄，仅限于豆科植物(豆科植物根瘤菌)和某些非豆科树木(弗氏固氮放线菌)，严重的限制了它的广泛应用。联合固氮微生物是指定植于植物的根际或根表，有些可以进入根的皮层组织但不形成根瘤，进行固氮的微生物。由于联合固氮菌与植物根系之间只是一种松散的联合，而没有分化出有形的结构，而裸露在植物根表，是的联合固氮易受环境因素的影响，加之由联合固氮微生物固定的氮素不易分泌到体外，是造成了联合固氮微生物固氮效率低下的原因。自生固氮微生物是通常在自然环境或培养基中独立生活时，就可以将分子态氮固定为氨的一类微生物。自生固氮微生物不需要和其他生物联合就能固氮，具有条件宽、适应广的特点，而且还能分泌一些植物激素，刺激根系和植株的生长发育，现有的一些氮肥菌剂中便含有自生固氮菌。同时，自生固氮菌能够改善植物根际的微生态群落，起到促进植物生长，提高植物抗逆性的作用。 
类芽孢菌具有存活期长和抗逆性强等特点，广泛分布在不同的土壤和植物根际中，有的也可以侵入植物组织内部。该属中的许多菌株以其固氮能力、对致病菌的抗性和对植物的促生作用使得他们受到了研究者的广泛的关注。我国幅员辽阔，环境多样，土质情况差异很大，使得我国的自生固氮资源十分丰富，开发应用潜力巨大。但是，由于国内外特别是国内对自生固氮菌的研究起步较晚，大大限制了类芽孢杆菌菌种作为有潜力的微生物菌剂在农业上的应用。 
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有固氮能力的类芽孢杆菌及其应用。 
本发明提供的菌株1-43已于2011年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏编号为CGMCC No.4965，分类名为类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）。 
固氮类芽孢杆菌1-43在LD固体培养基上生长良好，菌落为圆形，边缘不规则，颜色乳白，直径为1～3mm。 
本发明提供了含有固氮类芽孢杆菌1-43的菌剂。 
本发明发现该菌含有固氮酶，其结构基因为nifH，编码该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1。乙炔还原法测定其固氮酶活性为904.49nmolC2H4/(mg protein h)。 
本发明提供类芽孢杆菌1-43或其发酵产物或含有类芽孢杆菌1-43的菌剂在抑制病原菌上的应用。 
所述的植物病原菌为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、禾谷丝核菌（Rhizoctonia cerealis）、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）和/或灰葡萄孢（Botrytis cinerea）。 
本发明提供类芽孢杆菌1-43或其发酵产物或含有类芽孢杆菌1-43的菌剂在促进植物生长上的应用。 
本发明提供了类芽孢杆菌1-43在制备生态固氮微生物菌剂或生物有机肥中的应用。 
本发明提供了以类芽孢杆菌1-43为有效成分的制剂在农业上的应用。 
本发明提供的类芽孢杆菌菌株1-43对多种植物病原菌具有明显的抑制作用，同时对植物生长具有促进作用，该菌株分泌植物激素吲哚乙酸的产量为19.97mmol/mL，将本发明的菌株1-43制成固氮微生物菌剂或生物有机肥可对植物种子的萌发生长产生明显的促进作用，能有效降低尿素的使用量，可在农业生产中推广使用。 
图1为Paenibacillus sp.1-43在无氮平板上的菌落形态； 
图2为菌株Paenibacillus sp.1-43相关的电泳图，其中M：ladder；1：PCR扩增得到的固氮酶结构基因nifH条带；2：PCR扩增得到的16S rDNA条带； 
图3为Paenibacillus sp.1-43对植物病原菌的抑制作用图，其中a图为Paenibacillus sp.1-43对灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的抑制作用图；b图为Paenibacillus sp.1-43核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的抑制作用图；c图为Paenibacillus sp.1-43对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的抑制作用图；d图为Paenibacillus sp.1-43对禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)的抑制作用图； 
图4为Paenibacillus sp.1-43对小麦种子的促生作用图，分别为菌液在稀释10倍、20倍、50倍、100倍情况下对小麦种子的促生作用。 
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。 
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 
实施例中所用的土样，来自各地不同植物根基土壤。 
实施例1固氮类芽孢杆菌1-43菌株的培养和鉴定 
(1)菌株的培养 
培养基的制作：液体培养基(1L)：20g蔗糖；12.06g K2HPO4；3.4gKH2PO4；0.2g MgSO4·7H2O；0.01g NaCl；0.01g FeCl3；0.002gNaMoO4·2H2O；H2O 1L。120℃灭菌25分钟。固体培养基的制作是在每升液体培养基中加入14g琼脂。将固氮类芽孢杆菌接种到固体或液体培养基中，30℃培养箱培养3天。 
(2)细菌总DNA的提取提取方法参照文献【Ausubel et al.Current Protocols in Molecular Biology.New York：Wiley.1987】的方法。 
(3)菌株的鉴定及固氮酶结构基因nifH及16S rDNA的扩增 
从本发明菌株Paenibacillus sp.1-43的纯培养物提取基因组DNA，并以此为模板，以表1中nifH P1和nifH P2为上下游引物，PCR扩增固氮酶结构基因nifH，得到了大小约为320bp的条带。将此条带进行回收纯化后，送交公司进行测序。基因nifH的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。将测序结果在GenBank数据库的在线的BLAST比对，结果和Paenibacillus sp.Bb54的同源性达到98％。 
以原核生物的模式菌株大肠杆菌的16S rDNA序列设计引物，见表1，以提取的菌株Paenibacillus sp.1-43的纯培养物基因组DNA为模板，PCR扩增16S rDNA序列。结果得到了为1.5Kb左右的条带，然后将此条带进行回收纯化，并送交测序。16S rDNA序列如SEQ ID NO.2所示，测序结果进行在线的BLAST比对，结果显示此菌株属于类芽孢杆菌属。该菌株1-43已于2011年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.4965，分类名为类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)。 
表1用于克隆nifH及16S rRNA基因的引物 
Figure DEST_PATH_GDA0000107748810000021
扩增体系 
10×PCR buffer：         2μL 
Figure BDA0000101014030000061
扩增条件 
nifH基因的扩增： 
Figure BDA0000101014030000062
16S rDNA的扩增： 
Figure BDA0000101014030000063
固氮酶结构基因nifH及16S rDNA的扩增的电泳结果见图2。 
实施例2固氮酶活的测定 
1、将1-43菌株接种于5mL测酶活的培养基中，30℃静置培养过夜，按 1％的接种量转接到50mL三角瓶中，30℃再次过夜培养，然后收集菌体，并用适量测酶活的培养基悬浮具体，并调整OD600到1。将1.5mL菌液接种培养2h，取100μL气体用气象色谱法测定乙烯含量。 
测酶活培养基为：26.3g Na2HPO4·12H2O；3.4g KH2PO4；10μg生物素；26mg CaCl2·2H2O；30mg MgSO4；0.33mg MnSO4·H2O；36mg柠檬酸铁；7.6mg Na2MoO4·2H2O；10μg对氨基苯甲酸；4g葡萄糖。葡萄糖115℃灭菌30min后单独加入，其他试剂可配好后121℃灭菌30min。 
2、蛋白含量的测定方法(Bradford，1976) 
(1)溶液的配置 
Bradford储存液：100mL 95％乙醇，200mL 88％磷酸，350mg考马斯亮蓝G250； 
Bradford工作液：425mL双蒸水，15mL 95％乙醇，30mL88％磷酸，30mL Bradford储存液； 
滤纸过滤，保存于棕色瓶中，室温放置。可保存数周，但使用前需过滤。 
(2)标准曲线的制作 
取5mL Bradford工作液于试管中，分别加入40μL的0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL的BSA溶液，混匀，放置3～5min，显兰色。测定OD595值。以加入40μL水的5mL Bradford工作液作为对照。以OD595值为纵坐标，BSA溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。得到标准曲线方程以及R2值。R2值以大于0.99为宜。标准曲线方程是y＝0.3973x，R2是0.996。 
(3)检测 
离心收集菌体，加200μL 0.5M的NaOH煮沸5min，再加200μL0.5M的HCl混合均匀后离心吸取上清液40μL，加入到5mL Bradford工作液中，混匀，放置3～5min，显兰色。测定OD595值为0.094。将OD595值带入标准曲线方程中，计算蛋白浓度为0.2366mg。 
3、1nmol乙烯的标定 
（1）准备120mL血清瓶两个，标为1#、2#瓶； 
（2）将血清瓶灌满水，并用插有针头的胶塞塞好，防止气泡产生，取下胶塞，倒出100mL水（用容量瓶量取），换上新胶塞，这样瓶中的空气体积即为100mL； 
（3）向1#瓶中注射2.24mL（标准状况下为2.24mL，非标准状况下，根据PV=nRT来计算注入量）乙烯，再从1#瓶中取出1mL气体注入2#瓶中，从2#瓶中取出100μL气体打入气相色谱仪（仪器型号HP6890），所显示的峰面积即为1nmol乙烯的量，据此可计算出记录纸上每单位峰面积代表多少nmol乙烯。 
（4）固氮酶活【nmol C2H4/（mg protein h）】的计算公式为： 
Figure 729244DEST_PATH_GDA00002098122100021
乙炔还原法（ARA）表明该菌可以利用N2作为氮源，且具有较高的生物固氮活性，在纯培养条件下，其固氮酶活性为904.49nmolC2H4/(mg protein h)。 
实施例3固氮类芽孢杆菌1-43菌株的抑菌活性实验 
PDA培养基（马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉16g，加蒸馏水定容至1L）。在距离PDA平板中央2cm处的两点分别接种植物病原菌和本发明提供的类芽孢杆菌1-43，然后将平板置于30℃培养箱培养3～7天，观察该类芽孢杆菌对植物病原菌的抑制作用，结果见图3。本实施例所用的植物病原菌分别为：尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、禾谷丝核菌（Rhizoctonia cerealis）、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）。 
实施例4固氮类芽孢杆菌1-43菌株对小麦种子的促生作用实验 
（1）植物激素吲哚乙酸（IAA）含量的测定 
将类芽孢杆菌1-43菌株单菌落接种于5ml LD液体培养基（蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 2.5g，去离子水定容至1L，用1mol/L HCl或NaOH调节pH值至6.8)中，置于30℃摇床上振荡培养过夜。然后按5％的接种量接种于200mL新鲜配制的LD或LB液体培养基中，置于30℃摇床中振荡培养48h后，测定它们的IAA产量。结果显示，本发明类芽孢杆菌1-43菌株可以分泌IAA，其产量为19.97mmol/mL，对植物具有促生作用。 
(2)固氮类芽孢杆菌1-43菌株对小麦种子的促生作用实验 
将培养好的该菌株菌液进行梯度稀释×10，×20，×50，×100，然后将颗粒饱满的小麦种子用1％次氯酸钠消毒15min，再用灭菌的去离子水洗涤5次。接下来分别用灭菌的去离子水和梯度稀释×10，×20，×50，×100的菌液浸小麦种2min。将小麦种子用灭菌的去离子水经同样的处理作为对照组。将处理后的小麦种子整齐的摆放于铺有湿润滤纸的无菌平皿中，每皿100粒。然后将平皿置于25℃恒温培养箱中，黑暗发芽。逐日记录处理组和对照组种子发芽数。当培养6～7天后，测定种子芽、根的长度、单株鲜重、单株干重、种子发芽指数、种子发芽率及幼苗活力指数，结果见表2。 
发芽指数(germination index，GI)、发芽率(germination percentage，GP)和种子活力指数计算公式如下： 
发芽率(％)＝发芽总粒数/试验总粒数×100％ 
发芽指数＝∑(T时间内发芽数/相应发芽天数T) 
活力指数＝种子发芽指数×单株幼苗平均干重。 
表2菌株Paenibacillus sp.1-43对小麦种子的促生效果 
Figure BDA0000101014030000091
Figure BDA0000101014030000101
如表2所示，与对照组相比，将本发明菌液梯度稀释×10，×20和×50时，对小麦种子的促生作用明显高于对照组。当菌液被稀释×20时，用它处理的小麦种子的发芽指数比对照组提高了67.45％，种子活力指数提高了66.44％。当菌液稀释×50时，发芽指数提高了87.92％，发芽率提高了3.92％，种子活力指数提高了79.14％。可见，本发明菌株1-43可以作为一种具有抑制植物病原菌和促进植物生长作用的生物固氮肥料在生产中得到应用。将本发明菌株进行培养后作为微生物肥料，可应用在玉米、小麦等禾本科作物的田间种植业中，能有效的降低尿素的使用量。 
Figure IDA0000101014110000011
Figure IDA0000101014110000031

Claims (6)

1.一种具有固氮能力的类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）菌株1-43，其保藏号为CGMCC No.4965。
2.含有权利要求1所述类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）菌株1-43的菌剂。
3.权利要求1所述的类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）菌株1-43产生的具有固氮活性的固氮酶，该固氮酶的编码基因为nifH，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
4.权利要求1所述的类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）菌株1-43或其发酵产物或权利要求2所述的菌剂在抑制病原菌上的应用，其特征在于，所述的病原菌为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、禾谷丝核菌（Rhizoctonia cerealis）、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）和/或灰葡萄孢（Botrytis cinerea）。
5.权利要求1所述的类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）菌株1-43或其发酵产物或权利要求2所述的菌剂在促进小麦生长上的应用。
6.权利要求1所述的类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）菌株1-43在制备生物固氮微生物菌剂或生物有机肥中的应用。
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