CN104671853A - 一种复合光合菌肥的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种复合光合菌肥的制备方法。采用着色菌科中的沙氏外硫红螺菌菌种与红螺菌科中的纤细红螺菌菌种经种子活化培养，种子培养，厌氧发酵罐光照培养等培养步骤，得到沙氏外硫红螺菌与纤细红螺菌的高浓度复合光合菌肥，该复合光合菌肥可以起到防病，施肥，降解药残，修复土壤，用量少，见效快，效果稳定的作用。本发明提供了一种沙氏外硫红螺菌与纤细红螺菌两种菌混合培养，生长速度快，菌体含量高，培养时间短的复合光合细菌肥的制备方法。

Description

一种复合光合菌肥的制备方法

技术领域

本发明是属于一种微生物菌肥技术范围，具体的说是涉及到一种复合光合菌肥的制备方法。

技术背景

光合细菌列为细菌门，真细菌纲，红螺菌目，下分为红螺菌亚目和绿菌亚目，其中红螺菌目下又分为红螺菌科（紫色非硫细菌）和着色菌科（紫硫细菌）。归属于红螺菌目的光合细菌能在厌氧条件下进行光合作用，且不释放氧。细胞中含有细菌叶绿素和多种类胡萝卜素，及细胞色素、泛酮和铁氧化还原型的非血红素铁蛋白。 根据《伯杰细菌手册》第八版，红螺菌科的光合细菌能光合同化简单的有机物质，大多数种不能以硫化物作为唯一光合电子供体而生长，当硫化物或硫代硫酸盐作为电子供体时，元素硫不是一个中间的氧化产物。当由硫化物形成元素硫时，元素硫不能进一步氧化为硫酸盐。所有的种都不能利用元素硫作为电子供体。主要包括三个属：红螺菌属，红假单胞菌属，红微菌属。红螺菌属中比较有代表性的菌种为：深红红螺菌，纤细红螺菌，黄裼红螺菌，莫氏红螺菌，度光红螺菌。红假单胞菌属中比较有代表性的菌种为：沼泽红假单胞菌，绿色红假单胞菌，嗜酸红假单胞菌，胶质红假单胞菌，荚膜红假单胞菌，球形红假单胞菌等。红微菌属主要代表菌种为万尼氏红微菌。

着色菌科（紫硫细菌）在光照下，能利用硫化氢、硫代硫酸盐、分子氢及其他无机或有机还原剂把二氧化碳还原成有机物，同时能固定大气中的氮。大多数种是严格厌氧的（只有一个种—沙氏外硫红螺菌能在黑暗中微好氧生长），在有元素硫和硫化物时，具有光自养同化二氧化碳的能力，元素硫在细胞内居中地以球状积累，有一个属（外硫红螺菌属积累在细胞外面。硫酸盐是硫化合物的最终氧化产物。许多菌株能利用分子氢作为电子供体。所有的菌株能光合同化一些简单的有机物质，其中最广泛被利用的是醋酸盐和丙酮酸盐。没有同化型硫酸还原作用的菌株仅在有硫化物或其它还原的硫化合物作为细胞硫来源时，才能利用有机物质，绝大多数菌株在无硫化氢或硫时，可利用有机物质，因此所有的类型都是潜在的混合营养菌。

着色菌科内包括着色菌属，囊硫菌属，八球硫菌属，硫螺旋菌属，荚硫菌属，闪囊菌属，板硫菌属，可变杆菌属，外硫红螺菌属。

作为菌肥，光合细菌能促进土壤物质转化，改善土壤结构，提高土壤肥力， 促进作物生长。光合细菌大都具固氮能力，能提高土壤氮素水平， 通过其代谢活动能有效地提高土壤中某些有机成分、硫化物、氨态氮，并促进有害污染物(如农药、化肥) 的转化。同时能促进有益微生物的增殖, 使共同参与土壤生态的物质循环。此外，光合细菌产生的丰富的生理活性物质如脯氨酸、尿嘧啶、胞嘧啶、维生素、辅酶Q、类胡萝卜素等都能被植物直接吸收，有助于改善作物营养，激活植物细胞的活性，促进根系发育， 提高光合作用和生殖生长能力。光合细菌发酵液中含有多种生理活性物质，如叶绿素Ａ、Ｂ，类胡萝卜素，多种维生素(尤其是Ｂ族维生素)，多种植物激素(如IAA、GA3、ABA、乙烯、细胞分裂素)、核酸、水杨酸、多种氨基酸以及单细胞蛋白质等。这些生理活性物质具有或促进植株根系生长、或促进植株叶片生长、或促进果实中某些特异性成分的积累、或增加作物产量，从而改善农产品品质。光合细菌能增强作物抗病防病能力。光合细菌含有抗细菌、抗病毒的物质，这些物质能钝化病原体的致病力以及抑制病原体生长。同时光合细菌的活动能促进放线菌等有益微生物增殖，抑制丝状真菌等有害菌群生长，从而有效地抑制某些植病的发生与蔓延。由于光合细菌具有抗病防病作用， 能延长果品储存期。光合细菌可提高植株叶绿素含量，促进土壤中固氮菌、根瘤菌、放线菌等微生物菌群的生长，在烟草、萝卜、甘薯、大豆等作物上喷施光合细菌后,均能提高土壤中固氮菌、根瘤菌、放线菌及细菌数量，而丝状真菌则减少，起到土壤修复的作用。光合细菌还具有减轻农药对农作物的毒害和降解残留农药。因此，光合细菌在种植上具有广阔的应用前景。

但现有有关光合细菌的研究主要是针对红螺菌科进行研究，尽管也有些是一些复合光合细菌，但其主要是针对红螺菌科内进行混合培养，如专利号200910039525.5“一种农用光合细菌制剂的生产方法”使用的菌种为沼泽红假单胞菌和球形红细菌。专利号201210255225.2“高活菌数光合细菌原代菌种的制种方法”使用的菌种为沼泽红假单胞菌。专利号200410048678.3“高浓度光合细菌制剂的制备方法”使用的菌种为沼泽红假单胞菌，荚膜红假单胞菌和球形红假单胞菌；专利号201310734863.7“一种复合光合菌剂及其制备方法”使用的菌种为球形红假单胞菌，沼泽红假单胞菌及深红红螺菌菌种；从现有文献上来看，大部份复合光合细菌只是对红螺菌科中的菌进行混合培养，还未有报道红螺菌科与着色菌科的菌之间进行混合培养。

国内对着色菌科（紫色硫细菌）的研究仅见于少数几篇文献，刘蔚等分离到一株桃红荚硫菌，认为其具有较好的净水能力及生物肥料的能力，特别可以解决我国大部份土壤内因缺硫而影响农作物生长以至减产的问题。四川大学的冯甦对紫硫细菌中的桃红荚硫菌进行了研究，他认为桃红荚硫菌适于应用到制作菌肥和处理含硫污染物方面。但要投入实际运用，首要要解决的问题是，该菌的生长速度缓慢，一般要培养两周以后才会有明显的生长趋势，培养20-40天才能做为菌剂使用，且OD650的值不高于1，活菌含量低于1亿/毫升，较长的生长周期不利于大规模的应用。而到目前为止，还未见有关沙氏外硫红螺菌肥制备方法技术方案公开。也未有着色菌科（较强硫化氢的降解能力，促进硫元素的物质循环）与红螺菌科中的菌进行复合培养作为菌肥的技术方案进行公开。

发明内容

  针对现有技术的不足，本发明提供一种着色菌科中的沙氏外硫红螺菌与红螺菌科中的纤细红螺菌混合培养，生长速度快，菌体含量高，培养时间短，而且肥效活性高、稳定性高、作用效果快的复合光合细菌肥的制备方法。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：采用着色菌科中的沙氏外硫红螺菌菌种与红螺菌科中的纤细红螺菌按以下步骤进行培养：

、沙氏外硫红螺菌半固体种子活化培养：将沙氏外硫红螺菌种穿刺在半固体沙氏外硫红螺菌培养基中，25-30℃光照培养7-10天，待穿刺的菌线变红并长出菌苔，即可为活化的沙氏外硫红螺菌种；

、纤细红螺菌平板活化：将纤细红螺菌菌种在平板上划线活化，温度25-35℃活化培养3-5天，挑取大个菌落作为活化种子；

、沙氏外硫红螺菌种子培养：将活化的菌种接种至沙氏外硫红螺菌种子液体培养基中，温度25-35℃，光照强度为：1000-3000lux，光照厌氧培养7-10天，检测种子的OD660≥1.2，活菌数≥6亿cfu/ml即为种子培养液；

、纤细红螺菌种子培养：将挑取大个纤细红螺菌菌落作为活化种子接种到种子培养基中，温度25-35℃，光照强度为：1000-3000lux，光照静置培养3-5天，检测种子的OD660≥0.8，活菌数≥4亿cfu/ml即为种子培养液；

、发酵培养：将沙氏外硫红螺菌种子培养液与发酵培养基以1：3-1：5的接种量接种，同时将纤细红螺菌种子培养液与发酵培养基按1：6-1：10的接种量接入，在光照培养罐中厌氧培养，培养温度25-35℃，光照强度为：1000-4000lux，搅拌速度为120转/分钟，待培养至第三天，开始流加300 g/L的硫代硫酸钠溶液至发酵培养基硫代硫酸钠的浓度至1-3 g/L，继续培养3-5天，待检测其OD650≥6，活菌数≥50亿cfu/ml，其中沙氏外硫红螺菌不低于25亿cfu/ml，纤细红螺菌不低于20亿cfu/ml，即可放罐，灌装，包装成品。

所述的半固体沙氏外硫红螺菌培养基为：氯化铵0.4-1.2g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，二水氯化钙0.05-0.2g/L，氯化镁0.1-0.5g/L，苹果酸钠2-10 g/L,醋酸钠1-3g/L，九水硫化钠0.1-1g/L，琼脂8-10g/L，氯化钠0.5-4g/L, 121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2,其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌。

所述的沙氏外硫红螺菌种子液体培养基为：氯化铵0.4-1.2g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，二水氯化钙0.05-0.2g/L，氯化镁0.1-0.5g/L，苹果酸钠2-10 g/L, 醋酸钠1-3g/L，九水硫化钠0.1-1g/L，氯化钠0.5-4g/L,121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2,其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌。

所述的纤细红螺菌种子液体培养基为: 氯化铵0.8-1.2g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，二水氯化钙0.05-0.2g/L，氯化镁0.1-0.5g/L，苹果酸钠2-10 g/L,醋酸钠1-3g/L，氯化钠1-2g/L,酵母膏0.2-1g/L ,121℃灭菌15分钟，用灭菌醋酸调PH至7.0-7.2。

所述的纤细红螺菌平板固体培养基为种子液体培养基加入20 g/L的琼脂形成的。

所述的发酵培养基：氯化铵1.2g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，二水氯化钙0.1g/L，氯化镁0.3g/L，苹果酸钠4g/L，醋酸钠8g/L，酵母膏0.4g/L , 氯化钠1g/L,121℃灭菌15分钟，用苹果酸调PH至6.8-7.0。

本复合光合菌肥中含有沙氏外硫红螺菌：细胞球形，直径1.2-3微米，一般为1.5微米，单个细胞通常被一层粘的荚膜包住，常见有双球形聚合体，四联体和不规则的堆，它们通常被粘液层所包围。厌氧的光能自养菌：有果糖、甘油或有机酸时所有菌株都能在微好氧到好氧的黑暗条件下生长。光合电子供体：硫化物，硫代硫酸盐，硫和分子氢。可光合同化醋酸盐、果糖、延胡索酸盐、甘油、苹果酸盐、丙酮酸和琥珀酸盐。大多数菌株具有同化型硫酸盐还原作用。沙氏外硫红螺菌生活在光线能及的滞水和污泥中，尤其是在含硫化物丰富的环境中。25-30℃、1000-3000lux或更强的光照，PH值7.0-7.5的厌氧环境最适合该菌的生长和氧化作用，在偏离最适条件下，沙氏外硫红螺菌也有较大的适应范围，10-40℃、500-6000lux和PH5-9，均能适应生长，在微好氧黑暗状态下也能生存，条件不适时，该菌的生长处于抑制状态，一旦条件允许，又能继续生长。

本复合光合菌肥含有纤细红螺菌，光能自养（有分子氢），光能异养，兼性好氧，能生长在有光厌氧或黑暗微好氧到好氧。最适PH：6.6-7.4，在25-35℃生长良好，不需要生长因子，在有复杂有机营养或酵母膏时，可增加生长速度。光同化的有机底物：乙酸盐、精氨酸、丁酸盐、已酸盐、辛酸盐、酪蛋白氨基酸、甲酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、壬酸盐、丙酸盐、丙酮酸、琥珀酸、戊酸盐。不利用：柠檬酸盐、乙醇、甘油、丙二酸盐、糖类和糖醇类、硫代硫酸盐。以下的物质可以抑制生长：苯甲酸盐、环已烷、羧酸盐、甲酸盐、果糖、乙二醇盐、甲醇、天冬氨酸盐和硫化物。纤细红螺菌具有较强的降解氨氮，固氮能力，以及具有较强的降解农药残留的能力，这与燕淑海报道的相一致。

本发明的紫硫光合细菌--沙氏外硫红螺菌与紫色非硫光合细菌--纤细红螺菌是从全国各地100多处池塘底泥，河涌底泥，猪粪水处理池，污水处理厂，光合细菌样品，垃圾处理滤池中分离得到的500多株光合细菌中筛选出来的，沙氏外硫红螺菌对硫化氢降解效率明显，0.2克/升的硫化氢含量经过24小时后即可全部降解，可快速促进硫元素在土壤的物质流动，并且具有较明显的固氮，促进植物生长的作用。纤细红螺菌具有较强的农药残留降解能力与固氮能力，且能够与该沙氏外硫红螺菌共生共存，互相促进生长。该复合光合细菌肥的各级培养基是经过多年的优化试验得到的，特别是其发酵培养基，是考察了40多种光合细菌培养基成份中筛选出来的，并充分考虑到了各个培养基成份相互影响，采用正交试验进行多次优化培养基与培养条件，优化后培养总菌数超过50亿cfu/ml，沙氏外硫红螺菌的浓度超过25亿cfu/ml，远远高于现有沙氏外硫红螺菌的培养浓度。

采用上述技术方案的有益效果：本发明沙氏外硫红螺菌种子培养基采用的半固体含硫化钠的培养基，能尽快使期形成无氧环境，从而能够快速促进沙氏外硫红螺菌的生长，而发酵培养基中用硫代硫酸钠代替硫化钠，并以流加的方式加入，以减少光合菌液中的硫代硫酸钠对纤细红螺菌的抑制作用。将两种菌种接入发酵培养基的后，前期由于纤细红螺菌的前期延滞期短，在酵母膏等营养物质的刺激下快速繁殖，经过两至三天的生长，菌含量已经达到较高浓度，而沙氏外硫红螺菌经过两至三天的延滞期，在纤细红螺菌的某些产物的刺激下，特别是流加入硫代硫代硫酸钠后，沙氏外硫红螺菌也在后期快速繁殖起来。从而可达到两种菌体浓度较高的复合型的光合菌制剂。这两种菌都能在微好氧到好氧的条件下进行生长与存活，可作为叶面肥与根肥施用都可。

本发明的复合光合菌肥既含有红螺菌科中繁殖速度较快的纤细红螺菌，也含有着色菌科中降解硫化氢能力较强的的沙氏外硫红螺菌，在红螺菌科（紫色非硫细菌）中的纤细红螺菌的存在下，沙氏外硫红螺菌（着色菌科）生长速度快，菌体含量高，培养时间短，从而形成一种菌含量高，兼具两类光合细菌（红螺菌科与着色菌科）的复合光合细菌肥的制备方法。

下面结合试验说明本发明复合光合菌肥的田间效果。

一、复合光合菌肥在烟草上的应用效果

1．试验地点：湖南省隆回县滩头镇龙竹村某农户种植地

2．试验方法：烤烟品种：中烟99-10-1，烤烟移栽苗时，用复合光合菌肥500倍液灌根一次；缓苗后20天用复合光合菌肥250倍液喷施第一次，然后连续每隔20天喷施第二次和第三次（总共每亩用复合光合菌肥4公斤）。对照区在每次试验区用菌肥250倍液喷施的同时，用同样用量的清水喷洒；

3．试验结果：

施用复合光合菌肥后, 株高、茎围、节距、有效叶数、最大叶面积均大于喷施清水的对照，说明可以有效改善烟株的农艺性状，促进烟株健壮生长。施用的烟株发病率和发病程度显著降低，可以有效提高烟株的抗病性；

表1复合光合菌肥对烟草产量产值增收效果

处理	产量（公斤/亩）	产值（元/亩）	均价（元/公斤）
				对照区	206.2	2833.2	13.74
处理区	248.3	3739.4	15.06

施用复合光合菌肥后烟草提早成熟、提高品质，很大程度上提高烟叶的产量、均价、产值、上中等烟比例。从表1可以分析得出，试验示范区烟叶产量、产值、均价分别比对照区域高出42.1公斤/亩、906.2元/亩、1.32/公斤。减去增加的成本400元（其中人工360元），可净增506.2元/亩。

二、复合光合菌肥在水稻上的试验效果

1．试验地点：湖南省隆回县滩头镇龙竹村某农户良田

2．试验方法：

⑴．用100倍复合光合菌肥稀释液浸种2-4小时；

⑵．在秧苗期、分蘖期、孕穗期分别用1000毫升/亩的复合光合菌肥 250倍稀释液喷施一次；

3．试验结果：

⑴.对水稻发芽率的影响 效果最好.能促进种子发芽、生根、提高发芽势和发芽率，发芽势增幅在5.4～7.8%，发芽率增幅为6.3～8.5%,发芽快而整齐，根系发达，粗白根多，成秧率高；

⑵.对水稻育秧和大田生长发育、提高单产均有明显效果，尤其分蘖期对提高每株的稻分蘖率比较明显，高成活秧，后其稻谷的丰满度，提高千粒重等有显著作用。小区试验随着施用时期不同，每亩可增产稻谷45-80千克，增产幅度为8～12%，增加收益90-160元，扣除成本30元，亩净增收益60-130元；

⑶．提高水稻的抗旱、抗病、抗倒伏等抗逆性。全程检测水体中无硫化氢，但对照组硫化氢在水稻生长后期超标严重。

三、复合光合菌肥在苹果上的应用效果

1．试验地点：辽宁省绥中县前所镇

2．试验方法：试验分为：对照区，就是不使用复合光合菌肥的区域。试验区，使用复合光合菌肥的区域。两个区域施用其它肥料以及别的农事操作相同，冲施用水的，对照也用相同的水。试验区：春季，把复合光合菌肥稀释500倍冲施或穴施。在苹果开花期和果实膨大期用复合光合菌肥250倍稀释液各喷雾一次（亩总共用5公斤）；

3．试验结果

在开花期使用完叶面喷施后，调查发现苹果座果率明显提高，和对照相比，试验区座果率提高 10-15 %；膨大期使用完后，和对照相比，试验区苹果畸型个数明显减少，收获时施用复合光合菌肥一级果比不施用光合菌肥的对照区提高了13%，而且果实大小比较均匀，产量明显提高，试验区产量比对照区产量提高了 18%；更重要的是果实着色均匀，表面圆滑，亮度增大，糖度增加2-3个波美度，形美味更佳。

四、复合光合菌肥对降解药残的效果

我们在黄瓜上做试验，利用马拉硫磷，氰戊菊酯，三氯杀螨醇进行试验，前一天喷施农药，第二天喷施复合光合菌肥，对照组喷施清水，7天后采摘黄瓜送检，对照组全部药物残留超标，而试验组分别为：马拉硫磷1.8mg/kg(药残标准：≤8mg/kg)，氰戊菊酯0.08mg/kg(药残标准：≤0.2mg/kg)，三氯杀螨醇0.04mg/kg(药残标准：≤0.1mg/kg)。

五、复合光合菌肥对土壤修复的效果

取试验一与试验三的土壤进行检测，发现试验一中试验组中土壤微生物总量增加了25%，光合细菌增加了220%，固氮菌增加了20%，放线菌增加了28%，而真菌减少了12%。试验三中土壤微生物总量增加了23%，光合细菌增加了180%，固氮菌增加了15%，放线菌增加了24%，而真菌减少了12%。同时光合细菌还使土壤容重下降，阳离子代换量增加，土壤全氮、全磷、速效氮、速效钾增加，从而改善了土壤的结构和营养状况，对土壤起到了修复作用，使产量增加明显。

具体实施方式

本发明实质性特点可从下述实施例中得以体现，但这些实施例仅作为说明，而不是对本发明进行限制。

实施例1

一种复合光合菌肥的制备方法，采用着色菌科中的沙氏外硫红螺菌菌种与红螺菌科中的纤细红螺菌按以下步骤进行培养：

、沙氏外硫红螺菌半固体种子活化培养：将沙氏外硫红螺菌种穿刺在半固体沙氏外硫红螺菌培养基中， 30℃光照培养8天，待穿刺的菌线变红并长出菌苔，即可为活化的沙氏外硫红螺菌种；

、纤细红螺菌平板活化：将纤细红螺菌菌种在平板上划线活化，温度30℃活化培养4天，挑取大个菌落作为活化种子；

、沙氏外硫红螺菌种子培养：将活化的菌种接种至沙氏外硫红螺菌种子液体培养基中，温度30℃，光照强度为： 3000lux，光照厌氧培养8天，检测种子的OD660为1.3，活菌数≥6.5亿cfu/ml即为种子培养液；

、纤细红螺菌种子培养：将挑取大个纤细红螺菌菌落作为活化种子接种到种子培养基中，温度30℃，光照强度为： 3000lux，光照静置培养4天，检测种子的OD660为1，活菌数为5亿cfu/ml即为种子培养液；

、发酵培养：将沙氏外硫红螺菌种子培养液与发酵培养基以1：4的接种量接种，同时将纤细红螺菌种子培养液与发酵培养基按1：8的接种量接入，在光照培养罐中厌氧培养，培养温度30℃，光照强度为：3000lux，搅拌速度为120转/分钟，待培养至第三天，开始流加300 g/L的硫代硫酸钠溶液至发酵培养基硫代硫酸钠的浓度至2 g/L，继续培养4天，待检测其OD650为6.5，活菌数为55亿cfu/ml，其中沙氏外硫红螺菌为30亿/毫升，纤细红螺菌为25亿/毫升，放罐，灌装，包装成品。

所述的半固体沙氏外硫红螺菌培养基为：氯化铵1.2g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，二水氯化钙0.1g/L，氯化镁0.3g/L，苹果酸钠4 g/L,醋酸钠2g/L，九水硫化钠0.5g/L，琼脂8g/L，氯化钠2g/L, 121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2,其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌。

所述的沙氏外硫红螺菌种子液体培养基为：氯化铵1.2g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，二水氯化钙0.1g/L，氯化镁0.3g/L，苹果酸钠4g/L, 醋酸钠2g/L，九水硫化钠0.5g/L，氯化钠2g/L,121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2,其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌。

所述的纤细红螺菌种子液体培养基为: 氯化铵1.2g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，二水氯化钙0.1g/L，氯化镁0.3g/L，苹果酸钠4 g/L,醋酸钠2g/L，氯化钠2g/L,酵母膏1g/L ,121℃灭菌15分钟，用灭菌醋酸调PH至7.0-7.2。

所述的纤细红螺菌平板固体培养基为种子液体培养基加入20 g/L的琼脂形成的。

所述的发酵培养基：氯化铵1.2g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，二水氯化钙0.1g/L，氯化镁0.3g/L，苹果酸钠4g/L，醋酸钠8g/L，酵母膏0.4g/L , 氯化钠1g/L,121℃灭菌15分钟，用苹果酸调PH至6.8-7.0。

实施例2

一种复合光合菌肥的制备方法，采用着色菌科中的沙氏外硫红螺菌菌种与红螺菌科中的纤细红螺菌按以下步骤进行培养：

、沙氏外硫红螺菌半固体种子活化培养：将沙氏外硫红螺菌种穿刺在半固体沙氏外硫红螺菌培养基中， 30℃光照培养8天，待穿刺的菌线变红并长出菌苔，即可为活化的沙氏外硫红螺菌种；

、纤细红螺菌平板活化：将纤细红螺菌菌种在平板上划线活化，温度30℃活化培养5天，挑取大个菌落作为活化种子；

、沙氏外硫红螺菌种子培养：将活化的菌种接种至沙氏外硫红螺菌种子液体培养基中，温度30℃，光照强度为： 3000lux，光照厌氧培养9天，检测种子的OD660为1.4，活菌数≥7亿cfu/ml即为种子培养液；

、纤细红螺菌种子培养：将挑取大个纤细红螺菌菌落作为活化种子接种到种子培养基中，温度30℃，光照强度为： 3000lux，光照静置培养4天，检测种子的OD660为1.2，活菌数为6亿cfu/ml即为种子培养液；

、发酵培养：将沙氏外硫红螺菌种子培养液与发酵培养基以1：4的接种量接种，同时将纤细红螺菌种子培养液与发酵培养基按1：10的接种量接入，在光照培养罐中厌氧培养，培养温度30℃，光照强度为：3000lux，搅拌速度为120转/分钟，待培养至第三天，开始流加300 g/L的硫代硫酸钠溶液至发酵培养基硫代硫酸钠的浓度至2 g/L，继续培养4天，待检测其OD650为6.8，活菌数为58亿cfu/ml，其中沙氏外硫红螺菌为32亿/毫升，纤细红螺菌为26亿/毫升，放罐，灌装，包装成品。

所述的半固体沙氏外硫红螺菌培养基为：氯化铵1.2g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，二水氯化钙0.1g/L，氯化镁0.3g/L，苹果酸钠6 g/L,醋酸钠2g/L，九水硫化钠0.5g/L，琼脂8g/L，氯化钠2g/L, 121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2,其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌。

所述的沙氏外硫红螺菌种子液体培养基为：氯化铵1.2g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，二水氯化钙0.1g/L，氯化镁0.3g/L，苹果酸钠6g/L, 醋酸钠2g/L，九水硫化钠0.5g/L，氯化钠2g/L,121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2,其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌。

所述的纤细红螺菌种子液体培养基为: 氯化铵1.2g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，二水氯化钙0.1g/L，氯化镁0.3g/L，苹果酸钠6 g/L,醋酸钠2g/L，氯化钠2g/L,酵母膏1g/L ,121℃灭菌15分钟，用灭菌醋酸调PH至7.0-7.2。

所述的纤细红螺菌平板固体培养基为种子液体培养基加入20 g/L的琼脂形成的。

所述的发酵培养基：氯化铵1.2g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，二水氯化钙0.1g/L，氯化镁0.3g/L，苹果酸钠4g/L，醋酸钠8g/L，酵母膏0.4g/L , 氯化钠1g/L,121℃灭菌15分钟，用苹果酸调PH至6.8-7.0。

Claims (6)

1.一种复合光合菌肥的制备方法，其特征在于：采用着色菌科中的沙氏外硫红螺菌菌种与红螺菌科中的纤细红螺菌按以下步骤进行培养：

沙氏外硫红螺菌半固体种子活化培养：将沙氏外硫红螺菌种穿刺在半固体沙氏外硫红螺菌培养基中，25-30℃光照培养7-10天，待穿刺的菌线变红并长出菌苔，即可为活化的沙氏外硫红螺菌种；

纤细红螺菌平板活化：将纤细红螺菌菌种在平板上划线活化，温度25-35℃活化培养3-5天，挑取大个菌落作为活化种子；

沙氏外硫红螺菌种子培养：将活化的菌种接种至沙氏外硫红螺菌种子液体培养基中，温度25-35℃，光照强度为：1000-3000lux，光照厌氧培养7-10天，检测种子的OD660≥1.2，活菌数≥6亿cfu/ml即为种子培养液；

纤细红螺菌种子培养：将挑取大个纤细红螺菌菌落作为活化种子接种到纤细红螺菌种子培养基中，温度25-35℃，光照强度为：1000-3000lux，光照静置培养3-5天，检测种子的OD660≥0.8，活菌数≥4亿cfu/ml即为种子培养液；

发酵培养：将沙氏外硫红螺菌种子培养液与发酵培养基以1：3-1：5的接种量接种，同时将纤细红螺菌种子培养液与发酵培养基按1：6-1：10的接种量接入，在光照培养罐中厌氧培养，培养温度25-35℃，光照强度为：1000-4000lux，搅拌速度为120转/分钟，待培养至第三天，开始流加300 g/L的硫代硫酸钠溶液至发酵培养基硫代硫酸钠的浓度至1-3 g/L，继续培养3-5天，待检测其OD660≥6，活菌数≥50亿cfu/ml，其中沙氏外硫红螺菌不低于25亿cfu/ml，纤细红螺菌不低于20亿cfu/ml，即可放罐，灌装，包装成品。

2.根据权利要求1所述的复合光合菌肥的制备方法，其特征在于所述的半固体沙氏外硫红螺菌培养基为：氯化铵0.4-1.2g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，二水氯化钙0.05-0.2g/L，氯化镁0.1-0.5g/L，苹果酸钠2-10 g/L,醋酸钠1-3g/L，九水硫化钠0.1-1g/L，琼脂8-10g/L，氯化钠0.5-4g/L, 121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2,其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌。

3.根据权利要求1所述的复合光合菌肥的制备方法，其特征在于所述的沙氏外硫红螺菌种子液体培养基为：氯化铵0.4-1.2g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，二水氯化钙0.05-0.2g/L，氯化镁0.1-0.5g/L，苹果酸钠2-10 g/L, 醋酸钠1-3g/L，九水硫化钠0.1-1g/L，氯化钠0.5-4g/L,121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2,其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌。

4.根据权利要求1所述的复合光合菌肥的制备方法，其特征在于所述的纤细红螺菌种子液体培养基为: 氯化铵0.8-1.2g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，二水氯化钙0.05-0.2g/L，氯化镁0.1-0.5g/L，苹果酸钠2-10 g/L,醋酸钠1-3g/L，氯化钠1-2g/L,酵母膏0.2-1g/L ,121℃灭菌15分钟，用灭菌醋酸调PH至7.0-7.2。

5.根据权利要求1所述的复合光合菌肥的制备方法，其特征在于所述的纤细红螺菌平板固体培养基为种子液体培养基加入20 g/L的琼脂形成的。

6.根据权利要求1所述的复合光合菌肥的制备方法，其特征在于所述的发酵培养基：氯化铵1.2g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，二水氯化钙0.1g/L，氯化镁0.3g/L，苹果酸钠4g/L，醋酸钠8g/L，酵母膏0.4g/L , 氯化钠1g/L,121℃灭菌15分钟，用苹果酸调PH至6.8-7.0。