CN102337321A

CN102337321A - 一种用于检测单核细胞吞噬能力的试剂盒

Info

Publication number: CN102337321A
Application number: CN2010102339801A
Authority: CN
Inventors: 韩红兵; 牟进菲; 连正兴
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2010-07-22
Filing date: 2010-07-22
Publication date: 2012-02-01
Anticipated expiration: 2030-07-22
Also published as: CN102337321B

Abstract

本发明涉及一种用于检测单核细胞吞噬能力的试剂盒。该用于检测单核细胞吞噬能力的试剂盒，包括经染料染色的肿瘤细胞。用本发明试剂盒实现了单核细胞的高通量快速检测。用本发明试剂盒进行检测时，可以在96孔板中进行，将样品及试剂盒中的试剂加入96孔板中，使其相互作用一定时间后，用酶标仪或荧光分光光度计检测各孔的OD值，再根据OD值计算出各孔中检测的单核细胞的吞噬能力。采用酶标仪等仪器进行读数，人为显微镜下读数相比，既节省时间，又避免了人为误差，提高了检测准确性和检测效率。传统方法每天仅可检测30只个体，而本发明每天可以检测2-300个样品、150-300只个体，大大提高了检测效率。

Description

一种用于检测单核细胞吞噬能力的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种用于检测单核细胞吞噬能力的试剂盒。

背景技术

我国每年因重大动物疾病造成的直接经济损失达到了300多亿元人民币，重大动物疾病给畜牧生产带来了严重影响。动物抗病育种研究进展缓慢，易感个体数量增加，重大传染性疾病时有发生。特别是人畜共患病(如禽流感等)的出现，给人类的社会生活也造成了巨大影响。

单核细胞是动物外周血中的一类多能干细胞。单核细胞核大，常呈肾形或马蹄形，胞质丰富，在瑞氏染色血涂片中，胞质为极弱嗜碱性，呈浅灰蓝色，细胞形状不一，有圆形，多角形等。单核细胞具有趋化作用和吞噬作用，可以吞噬、消化与消灭侵入机体的病原体，也可以将特异性抗原呈递给T细胞引发体液免疫。同时单核细胞还具有其他功能：识别和清除变性的血浆蛋白、脂类等大分子物质；识别和杀伤肿瘤细胞；清除衰老与损伤的细胞和细胞碎片；在吞噬衰老的红细胞和溶血时逸出的血红蛋白后，参与铁和胆色素代谢；参与调节粒系造血祖细胞的增殖和分化。动物外周血中的单核细胞在特异性免疫与非特异性免疫中发挥着重要作用，既具有吞噬、消化与消灭侵入机体的病原体的功能，又具有将特异性抗原呈递给T细胞引发体液免疫的双重功能。单核细胞吞噬能力具有良好的遗传基础、在品种间差异较大、且经过几代选育能够稳定遗传，因此可以作为一个重要的标记用于动物的抗病育种。

现有技术已经能够从外周血液中快速分离单核细胞以及单核细胞的鉴定，且充分证明了单核细胞吞噬特性同动物机体的抗病能力、病原体清除能力，以及攻毒后抗体产生水平有着显著的相关性，可以很好地反映机体的免疫能力。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于检测单核细胞吞噬能力的试剂盒。

本发明所提供的用于检测单核细胞吞噬能力的试剂盒，包括经染料染色的肿瘤细胞。

经染料染色的肿瘤细胞在制备用于检测单核细胞吞噬能力的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。

上述试剂盒或上述应用中，所述试剂盒包括细胞储存液，所述经染料染色的肿瘤细胞混合于所述细胞储存液中；所述细胞储存液组成：由磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠和水组成，磷酸二氢钠在所述细胞储存液中的浓度为1.14g/L，磷酸氢二钠在所述细胞储存液中的浓度为0.2g/L，氯化钠在所述细胞储存液中的浓度为8g/L。

上述试剂盒或上述应用中，所述试剂盒包括单核细胞培养液和二甲基亚砜；所述单核细胞培养液为添加胎牛血清的RPMI-1640培养基，胎牛血清在所述单核细胞培养液中的浓度为10％(体积百分含量)。

上述试剂盒或上述应用中，所述试剂盒由所述经染料染色的肿瘤细胞、所述细胞储存液、单核细胞培养液和二甲基亚砜组成；所述经染料染色的肿瘤细胞混合于所述细胞储存液中。

上述试剂盒或上述应用中，所述试剂盒中，所述染料染色的肿瘤细胞在所述细胞储存液中的浓度为1000个细胞/ml、2000个细胞/ml、4000个细胞/ml、6000个细胞/ml、8000个细胞/ml、10000个细胞/ml或12000个细胞/ml。

上述试剂盒或上述应用中，所述经染料染色的肿瘤细胞是按照包括如下步骤的方法制备得到的：将所述肿瘤细胞预培养，得到预培养后的肿瘤细胞，将所述预培养后的肿瘤细胞与染料溶液混合，培养10h-12h，得到经染料染色的肿瘤细胞。此过程中，一般培养10h后贴壁细胞容易被移液枪吹起。

上述试剂盒或上述应用中，所述预培养的方法包括如下步骤：将所述肿瘤细胞以10⁶个/ml密度接种于肿瘤细胞培养基中，置于37℃、5％CO₂的二氧化碳培养箱中培养，至所述肿瘤细胞汇合至60％-70％，得到所述预培养后的肿瘤细胞；

所述将所述预培养后的肿瘤细胞与染料溶液混合，培养12小时中，所述培养的方式为37℃、5％CO₂的二氧化碳培养箱中培养。

上述试剂盒或上述应用中，所述肿瘤细胞为结直肠癌HCT-8细胞或293T细胞；

上述试剂盒或上述应用中，所述染料为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐或荧光染料；所述荧光染料为PI、DAPI、Hoechst 33342、Hoechst 33258、EB、cy3或cy5；

所述染料溶液由3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐和水组成3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐在染料溶液中的浓度0.5％(质量百分比)。

上述试剂盒或上述应用中，所述用于检测单核细胞吞噬能力的试剂盒为用于检测鸡单核细胞吞噬能力或羊单核细胞吞噬能力的试剂盒；所述鸡为矮小鸡，所述羊为萨福克羊。

传统检测单核细胞吞噬能力是利用异种红细胞为吞噬物，在显微镜下观察单核细胞吞噬、消化的红细胞数量，此方法耗时长、准确率低、成本高、人为因素也很多，且检测量比较少，不利于规模化及产业推广。本发明针对传统红细胞检测方法的缺陷与不足，改进工艺技术，实现快速、准确稳定、高通量、自动化、低成本检测单核细胞吞噬能力。

本发明中不以红细胞为特异吞噬物，而是以经染色的肿瘤细胞系为吞噬物，肿瘤细胞系可从商业途径得到，使吞噬物的来源更加广泛，易于获得，降低成本。实验证明，本发明的试剂盒中的吞噬物(即经染料染色的肿瘤细胞)性能稳定，在4℃条件下保存2周、3周、1个月或二个月，其中经染料染色的肿瘤细胞混合于所述细胞储存液中形成的混合物的OD₅₇₀值均无显著差异，不影响单核细胞吞噬能力的检测结果。实验证明，相同条件下，用本发明试剂盒检测的结果与用传统方法检测的结果无显著差异，表明用本发明试剂盒检测单核细胞吞噬能力的结果可靠。本发明试剂盒制备简单，成本低廉。

用本发明试剂盒实现了单核细胞的高通量快速检测。用本发明试剂盒进行检测时，可以在96孔板中进行，将样品及试剂盒中的试剂加入96孔板中，使其相互作用一定时间后，用酶标仪或荧光分光光度计检测各孔的OD值，再根据OD值计算出各孔中检测的单核细胞的吞噬能力。采用酶标仪等仪器进行读数，人为显微镜下读数相比，既节省时间，又避免了人为误差，提高了检测准确性和检测效率。传统方法每天仅可检测30只个体，而本发明每天可以检测2-300个样品、150-300只个体，大大提高了检测效率。

实践中，一般通过检测单核细胞吞噬能力，来评估待测动物机体的抗病能力、病原体清除能力等免疫能力，然后将动物个体的免疫能力作为重要指标用于动物的抗病育种。用本发明试剂盒加快了动物个体单核细胞吞噬能力的检测速度，有利于短期内大规模判定禽类的免疫能力，为加快动物抗病育种进程提供了有力的保障，因此本发明试剂盒对动物育种及畜牧业发展起到了巨大的推动作用。

附图说明

图1为经MTT处理的肿瘤细胞HCT8的形态(200×)。

图2为染色后不同保存时间HCT8 OD值变化。

图3为鸡外周血单核细胞鉴定。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、用于检测单核细胞吞噬能力的试剂盒的组成及应用

结直肠癌HCT-8细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，产品目录号为TCHu 18。MTT(化学名称为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名称为噻唑蓝，)购自amresco，产品目录号为0793。

一、试剂盒组成

1、经噻唑蓝染液(MTT染液)染色的HCT-8细胞和细胞储存液的混合物(细胞保存在细胞储存液中)；细胞在细胞储存液中的浓度为1x10⁶个/ml。

细胞储存液组成：由磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠和水组成，磷酸二氢钠在细胞储存液中的浓度为1.14g/L，磷酸氢二钠在细胞储存液中的浓度为0.2g/L，氯化钠在细胞储存液中的浓度为8g/L。

2、单核细胞培养液：添加胎牛血清的RPMI-1640培养基，胎牛曲清在单核细胞培养液中的浓度为10％(体积百分含量)。

3、二甲基亚砜(DMSO)。

二、试剂盒的制备

1、经噻唑兰染液(MTT染液)染色的HCT-8细胞的制备

方法：将HCT-8细胞以10⁶/ml密度接种于100mm装有细胞培养基的培养皿，置于37℃、5％CO₂的二氧化碳培养箱中培养，待细胞汇合至60-70％，去培养液，向培养皿中加入2ml、0.5％的MTT染液，37℃、5％CO₂的二氧化碳培养箱中培养12小时，弃上清，PBS洗2遍后收集细胞，即为经噻唑兰染液(MTT染液)染色的HCT-8细胞。

细胞培养基为DMEM，购自sigma，产品目录号为C7710。

噻唑兰染液的组成：由噻唑蓝和水组成，噻唑兰在染液中的浓度0.5％(质量百分比)。

2、将染色后的HCT-8细胞置于细胞储存液中，保存。细胞在储存液中的浓度为1x10⁶个/ml。

三、试剂盒的功能及性能检测

Hoechst 33342购自sigma，产品目录号为B2261。

(一)检测保存不同时间的经MTT染色的HCT-8细胞的形态

将MTT染色的HCT-8细胞置于细胞储存液中(细胞在储存液中的浓度为1x10⁶个/ml)，4℃保存，检测保存1周和1个月后的细胞形态。

方法：

(1)直接检测方法：显微镜观察。结果如图1中a-1和b-1所示。

(2)用Hoechst33342染色检测方法：

Hoechst33342染液(10微克/毫升，覆盖住细胞即可)，静置10分钟，吸出染液，PBS溶液洗2遍，荧光显微镜观察(激发波长320纳米)。结果如图1中a-2和b-2所示。

(3)用PI染色检测方法：PI染液(10微克/毫升，覆盖住细胞即可)，静置10分钟，吸出染液，PBS溶液洗2遍，荧光显微镜观察(激发波长520纳米)。结果如图1中a-3和b-3所示。

结果：经MTT染色后一周及一个月的细胞形态无显著差异。荧光显色观察到细胞核破裂释放核小体(a-2和b-2)，细胞死亡(a-3和b-3)，但细胞形态结构未随保存时间不同而变化(a-3和b-3)。(a)为染色后一周的细胞形态、(b)为染色后一个月的细胞形态。1为明视场、2为Hoechst染色、3为PI染色。表明，无论细胞储存一周还是一个月，细胞均死亡，且细胞形态结构均未变化，均可以用来检测单核细胞的吞噬能力。

实验设3次重复，结果无显著差异。

(二)染色后不同保存时间HCT8 OD值变化

将MTT染色的HCT-8细胞置于细胞储存液中，其中细胞浓度分别为1000、2000、4000、6000、8000、10000、12000个细胞/ml，4℃保存，检测保存不同时间的OD值。

OD值检测方法：将保存后的样品直接用荧光分光光度计进行检测，每种浓度样品每次检测100微升ml，检测波长为490nm。

实验设3次重复，结果取平均数。

结果如图2所示。结果显示相同浓度细胞，不同保存时间的OD值之间无显著性差异，说明MTT染色的HCT8的OD值稳定，细胞浓度相同时，OD值检测结果稳定，无显著性差异，表示以任何浓度保存细胞均可。

(三)试剂盒应用

1、鸡单核细胞吞噬能力的检测

矮小鸡品种购自北京北农大动物科技有限责任公司。

本实验分别用如下试剂盒进行检测：经噻唑兰染液(MTT染液)染色的HCT-8细胞在细胞储存液中的浓度为1x10⁶个/ml，试剂盒在4℃保存了1周、2周、3周、1个月和2个月。

1-1、鸡单核细胞的分离

人淋巴分离液购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司，产品目录号为LTS1077。

矮小鸡鸡翅下静脉采血，将鸡抗凝血液加入等体积的Hanks溶液中，混合均匀，然后将该混合液1∶1沿管壁缓慢加到人淋巴分离液面上，2000r/min离心20min；收集细胞并加入Hanks溶液，3000r/min离心10min，弃上清，取细胞，即为单核细胞。

1-2、鸡单核细胞吞噬能力的检测：

完全培养液为添加胎牛血清的RPMI-1640培养基，胎牛血清在完全培养液中的浓度为10％(体积百分含量)。RPMI-1640培养基购自sigma，产品目录号为R6504。

将单核细胞接入完全培养液中，得到细胞悬浮液(细胞在细胞悬浮液中的浓度为1x10⁵个/ml)，接种到96孔板中(每孔中0.1ml细胞悬浮液)，37℃，5％CO₂的二氧化碳培养箱中培养3天，弃培养液；向每孔中加入经噻唑兰染液(MTT染液)染色的HCT-8细胞和细胞储存液的混合物(混合物中HCT-8细胞浓度为1x10⁶个/ml)20μl和完全培养液80μl，37℃，5％CO₂的二氧化碳培养箱孵育不同时间(8h、10h、12h)；弃上清，PBS清洗2次；加入DMSO 100μl，充分溶解，后酶标仪(570nm)测量吸光值。计算，吞噬积＝OD_570nm值/单核细胞总数，其中单核细胞总数是指刚开始接种时单核细胞的初始数目。吞噬积即代表细胞吞噬能力。通过检测样品的OD值(不同的浓度细胞OD值不同)来检测吞噬细胞的浓度或数量。

阴性对照：单核细胞和100μl DMSO。阴性对照的OD值是零。

实验设3次重复，每次实验从4只矮小鸡中分离单核细胞，再分别检测。结果取平均值±标准差。在4℃保存了2个月的试剂盒的检测结果如表1。

表1：鸡单核细胞吞噬积(平均值±标准差)

结果显示：将着色过的HCT8细胞与鸡单核细胞共同孵育8h、10、12h后测量的OD值未见显著性差异。注：标不同字母为差异显著，相同字母为差异不显著。

在4℃保存了1周、2周、3周、1个月的试剂盒的检测结果与表1中结果无显著差异。

2、本发明方法的结果可靠性检测

本实验的检测对象是按照实验1-1中所述方法获得的鸡单核细胞。

2-1、本发明中的检测方法：按照实验1-2中所述方法进行。在4℃保存了2个月的试剂盒的检测结果如表1所示。

2-2、传统方法：分离鸡的红细胞，将红细胞加入单核细胞液(单核细胞数量为A)中，共培养24小时后，PBS清洗2次，显微镜下观察吞噬的红细胞数量(数量为B)，吞噬积的计算公式吞噬积＝B/A。检测结果：检测12只鸡，平均吞噬积为0.7904。

对本发明中的检测方法与传统方法检测值进行相关系数的分析。结果如表2所示。表明本实验中传统方法和本方法之间有高度正相关性。证明本发明中的检测方法结果可靠，进一步证明本发明的试剂盒检测结果可靠。

表2、本方法、传统方法检测值的相关性分析

3、羊单核细胞吞噬能力的检测：

3-1、羊单核细胞的分离

人淋巴分离液购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司，产品目录号为LTS1077。萨福克羊品种购自北京奥鑫牧业有限公司。

萨福克羊羊颈静脉采血后加入抗凝剂，向羊抗凝血液加入等体积的Hanks溶液中，混合均匀，然后将该混合液1∶1沿管壁缓慢加到人淋巴分离液面上，2000r/min离心20min；收集细胞并加入Hanks溶液，3000r/min离心10min；弃上清，取细胞，即为单核细胞。

单核细胞的验证：分离后的单核细胞体外培养5天后，进行CD14间接免疫染色，荧光显微镜观察。如图3所示，C-1是明视场下观察单核细胞形态，C-2是CD14间接荧光免疫染色在暗视场下观察，几乎所有的细胞都CD14呈阳性，说明分离获得的细胞是单核细胞。

3-2、羊单核细胞吞噬能力的检测：

将单核细胞接入完全培养液中，得到细胞悬浮液(细胞在细胞悬浮液中的浓度为1x10⁵个/ml)，接种到96孔板中(每孔中0.1ml细胞悬浮液)，37℃，5％CO₂的二氧化碳培养箱中培养3天，弃培养液；向每孔中加入经噻唑兰染液(MTT染液)染色的HCT-8细胞和细胞储存液的混合物(混合物中HCT-8细胞浓度为1x10⁶个/ml)10μl和完全培养液90μl，37℃，5％CO₂的二氧化碳培养箱孵育不同时间(12h、24h、36h)；弃上清，PBS清洗2次；加入DMSO溶液100μl，充分溶解，后酶标仪(570nm)测量吸光值。计算，吞噬积＝OD_570nm值/单核细胞总数。

实验设3次重复，结果取平均值±标准差，在4℃保存了2个月的试剂盒的检测结果如表3。结果显示：羊单核细胞吞噬HCT8细胞后孵育12h、24h、36h后检测的OD值。注：标不同字母为差异显著，相同字母为差异不显著.

表3：羊单核细胞吞噬积(平均值±标准差)

在4℃保存了1周、2周、3周、1个月的试剂盒的检测结果与表3中结果无显著差异。

Claims

1.一种用于检测单核细胞吞噬能力的试剂盒，包括经染料染色的肿瘤细胞。

2.经染料染色的肿瘤细胞在制备用于检测单核细胞吞噬能力的试剂盒中的应用。

3.根据权利要求1所述的试剂盒或权利要求2所述的应用，其特征在于：所述试剂盒包括细胞储存液，所述经染料染色的肿瘤细胞混合于所述细胞储存液中；所述细胞储存液由磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠和水组成，磷酸二氢钠在所述细胞储存液中的浓度为1.14g/L，磷酸氢二钠在所述细胞储存液中的浓度为0.2g/L，氯化钠在所述细胞储存液中的浓度为8g/L。

4.根据权利要求1或3所述的试剂盒或权利要求1或3所述的应用，其特征在于：所述试剂盒包括单核细胞培养液和二甲基亚砜；

所述单核细胞培养液为添加胎牛血清的RPMI-1640培养基，胎牛血清在所述单核细胞培养液中的浓度为10％(体积百分含量)。

5.根据权利要求1、3或4所述的试剂盒或权利要求1、3或4所述的应用，其特征在于：所述试剂盒由所述经染料染色的肿瘤细胞、所述细胞储存液、单核细胞培养液和二甲基亚砜组成；所述经染料染色的肿瘤细胞混合于所述细胞储存液中。

6.根据权利要求1-5中任一所述的试剂盒或权利要求1-5中任一所述的应用，其特征在于：所述试剂盒中，所述经染料染色的肿瘤细胞在所述细胞储存液中的浓度为1000个细胞/ml、2000个细胞/ml、4000个细胞/ml、6000个细胞/ml、8000个细胞/ml、10000个细胞/ml或12000个细胞/ml。

7.根据权利要求1-6中任一所述的试剂盒或权利要求1-6中任一所述的应用，其特征在于：所述经染料染色的肿瘤细胞是按照包括如下步骤的方法制备得到的：将所述肿瘤细胞预培养，得到预培养后的肿瘤细胞，将所述预培养后的肿瘤细胞与染料溶液混合，培养10h-12h或10h或12h，得到经染料染色的肿瘤细胞。

8.根据权利要求1-7中任一所述的试剂盒或权利要求1-7中任一所述的应用，其特征在于：所述预培养的方法包括如下步骤：将所述肿瘤细胞以10⁶个/ml密度接种于肿瘤细胞培养基中，置于37℃、5％CO₂的二氧化碳培养箱中培养，至所述肿瘤细胞汇合至60％-70％，得到所述预培养后的肿瘤细胞；

所述将所述预培养后的肿瘤细胞与染料溶液混合，培养10h-12h或10h或12h中，所述培养的方式为37℃、5％CO₂的二氧化碳培养箱中培养；

所述细胞培养基为DMEM培养基。

9.根据权利要求1-8中任一所述的试剂盒或权利要求1-8中任一所述的应用，其特征在于：所述肿瘤细胞为结直肠癌HCT-8细胞或293T细胞；

和/或，所述染料为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐或荧光染料；所述荧光染料为PI、DAPI、Hoechst 33342、Hoechst 33258、EB、cy3或cy5；

所述染料溶液由3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐和水组成，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐在染料溶液中的浓度为0.5％(质量百分比)。

10.根据权利要求1-9中任一所述的试剂盒或权利要求1-9中任一所述的应用，其特征在于：所述用于检测单核细胞吞噬能力的试剂盒为用于检测鸡单核细胞吞噬能力或羊单核细胞吞噬能力的试剂盒；所述鸡为矮小鸡，所述羊为萨福克羊。