CN102329835A - 纳米材料促进木质纤维生物质水解方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及的是一种生物工程技术领域的纳米材料促进木质纤维生物质水解方法，包括：第一步，纳米材料母液的配制：称取纳米材料加入到溶液中，分散至均一，配制成纳米材料母液；第二步，纳米材料加入纤维素酶-纤维素底物体系促进水解：配制纤维素酶与纤维素底物体系，再加入纳米母液至工作纳米浓度，进行纤维素酶水解，水解结束后收获单糖，其中所述工作纳米浓度大于0nmol/L且小于等于20nmol/L。本发明简便快速，稳定性佳，重现性好，适用范围广。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种生物工程技术领域的木质纤维生物质水解方法，特别是一种用纳米材料促进纤维素酶水解纤维素的速率，提高产糖率的方法。
背景技术
木质纤维生物质包括森林物质、野草和农业秸秆，是地球上最丰富的可再生资源，全球每年总产量高达1500亿吨，美国年增加储藏量达到10亿吨，中国年增加储藏量达到20亿吨以上，秸秆6亿多吨，林木9亿吨。大部分没有得到有效利用。 预计到2050年生物质将提供世界化学品和燃料的约30%的能量。木质纤维生物质原料来源的瓶颈是其中的纤维素成份水解成可进一步加工的单糖。市售商品化纤维素酶基本为复合纤维素酶组分，主要含有内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶（又称纤维二糖水解酶）和β-葡糖苷酶等，发挥作用的关键取决于内切葡聚糖酶的协同作用和酶与底物表面的聚集作用。在酶水解过程中，由于纤维素酶活性会发生钝化，活性急剧降低，酶本身有被木质素逐步吸附，造成水解反应产率不够高且处理时间需延长，底物难于完全转化，每生产1加仑纤维素乙醇所需酶的成本仍高达50美分。
提高纤维素酶的效率的有以下几种方式：第一类是利用菌株诱变和蛋白质工程改造纤维素酶结构改良纤维素酶活性与抗钝化能力，需要大量时间和精力实施。第二类方法是利用添加非离子型表面活性剂降低底物和木质素对纤维素酶吸附提高纤维素酶效率。表面活性剂难以回收，进入环境后，可能会污染土壤环境和天然水体环境，危害生态系统[非离子表面活性剂的环境行为及生物降解研究进展.西部皮革.2009，31（17）：24-31.]。需要进一步提高纤维素水解效率，降低纤维素转化为单糖的成本。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种纳米材料促进木质纤维生物质水解方法，可以直接简便地提高纤维素酶的催化活性和提高水解过程的底物分解率。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明首先配制一定浓度、分散均匀的纳米材料母液，与纤维素酶一起添加底物体系中，进行酶解反应，提高产糖率可高达30%。
本发明包括如下步骤：
第一步，纳米材料母液的配制：称取纳米材料加入到溶液中，充分分散至均一，配制成纳米材料母液。
所述纳米材料是指处于粒径在纳米尺度范围的各种天然或人工合成的材料，包括氧化物材料例，二氧化锡材料(SnO2)、纳米二氧化硅材料（SiO2）等、纳米四氧化三铁材料（Fe3O4），氢氧化物材料例如纳米氢氧化铝材料（Al(OH)3）等。
所述分散处理纳米材料母液的方法包括超声波处理等各种有效的改善溶液中纳米材料的分散性的方法。
所述溶液，是指适宜纤维素酶水解反应的具有一定pH值、离子强度等条件的缓冲溶液，与后续提到的纤维素酶供应商推荐的条件中所述的缓冲溶液相同。比如柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，醋酸-醋酸钠缓冲液等，但不限于这两种。
所述纳米材料母液，可以配制成几十或几百倍于后续提到的纤维素酶-纤维素底物水解体系的纳米工作浓度，浓度可根据纳米微粒的粒径、纳米级的材料密度计算得到。由于供应商提供的纳米材料一般为固态粉末，直接加入水解体系中呈聚结状态且不容易分散，所以先加少量溶液浸润、分散处理后，所得母液再稀释于最终的水解体系，分散效果较好。
第二步，纳米材料加入纤维素酶-纤维素底物体系促进水解：纤维素酶与纤维素底物体系，再加入纳米母液至工作纳米浓度，进行纤维素酶水解，水解结束后收获单糖。
所述工作纳米浓度大于0nmol/L且小于等于20nmol/L，较佳浓度为1 nmol/L。
所述水解结束是满足底物水解反应达到平衡，水解液中糖浓度不再增加。
所述纤维素酶与纤维素底物体系可以按照纤维素酶供应商推荐的酶解配制纤维素酶与纤维素底物体系，也可以采用其他现有方法配制。
所述纤维素酶水解条件可以是纤维素酶供应商推荐的条件，也可以采用其他现有技术常用的条件，只要能够实现纤维素酶水解即可。
与现有技术相比，本发明利用纳米材料对生物体系可能存在功能调控效应、功能集成效应、功能融合效应和空间局限效应，通过添加微量纳米材料，降低现有纤维素酶水解底物过程中酶蛋白浓度降低，酶活力损失、催化效率低的问题。本发明具有以下优点：1）直接促进水解体系中纤维素酶的活性，促进效果明显； 2）方法简便，易于操作，成本低：本发明不需要昂贵的仪器和试剂，利用常规的实验设备即可完成操作；3）可以规模化促进纤维素酶的水解体系，结果稳定，重现性好。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。以下实施例中未说明的内容，按一般常规操作。
实施例1 终浓度0.25 nmol/L的SnO
2
纳米材料（20 nm粒径）辅助纤维素酶EC1800水解稻秆的方法
称量75mg纳米SnO2，溶于30 ml柠檬酸-柠檬酸纳缓冲液（0.05mol/L，pH5.0）中，用超声波匀浆处理120min以上，制成200nM SnO2悬液（2.5mg/ml）。分别取两份水稻秸秆粉1g (粉碎至粒径4mm左右)，加30ml柠檬酸-柠檬酸纳缓冲液（0.05mol/L，pH5.0）中，加入10U（500 μL纤维素酶，总蛋白约25mg）， 其中一份加62.5 μL SnO2母液，再加入无菌的柠檬酸-柠檬酸纳缓冲液（0.05mol/L，pH5.0）至总体积50ml，SnO2纳米微粒的终浓度为0.25 nmol/L。总反应体系置于恒温振荡箱中于50℃、120rpm反应40小时。40h后将反应瓶取出，体系离心10min（4℃，12000rpm），上清液即为直接还原糖产物，采用二硝基水杨酸（DNS）法测定产物浓度，添加纳米材料后提高还原糖产率28.6%。
实施例2 终浓度0.25 nmol/L的SnO
2
纳米材料（20 nm粒径）辅助纤维素酶HDL160水解稻杆的方法
称量75mg纳米SnO2，溶于30 ml柠檬酸-柠檬酸纳缓冲液（0.05mol/L，pH5.0）中，用超声波匀浆处理120min以上，制成200nM SnO2悬液（2.5mg/ml）。称取两份水稻秸秆粉1g (粉碎至粒径4mm左右)，加30ml柠檬酸-柠檬酸纳缓冲液（0.05mol/L，pH5.0），加入10U纤维素酶， 其中一份加125 μL SnO2母液，加入柠檬酸-柠檬酸纳缓冲液（0.05mol/L，pH5.0）至总体积至50ml，使得SnO2纳米微粒的终浓度为0.25 nmol/L。总反应体系置于恒温振荡箱中于50℃、120rpm反应40小时。40h后将反应瓶取出，体系离心10min（4℃，12000rpm），上清液即为直接还原糖产物，采用二硝基水杨酸（DNS）法测定产物浓度，添加纳米材料后提高还原糖产率25.5%。
实施例3 终浓度0.25 nmol/L的SnO
2
纳米材料（20 nm粒径）辅助纤维素酶EC1800水解甘蔗渣的方法
称量75mg纳米SnO2，溶于30 ml柠檬酸-柠檬酸纳（0.05mol/L，pH5.0）中，用超声波匀浆处理120min以上，制成200nM SnO2悬液（2.5mg/ml）。称取2份甘蔗渣1g(粉碎至粒径4mm左右)，加入30ml柠檬酸-柠檬酸纳缓冲液（0.05mol/L，pH5.0）中，加入10U 维素酶， 其中一份加62.5 μL均匀的SnO2母液，再加入无菌的柠檬酸-柠檬酸纳缓冲液（0.05mol/L，pH5.0）至总体积50ml，使得SnO2纳米终浓度为0.25 nmol/L。总反应体系置于恒温振荡箱中于50℃、120rpm反应40小时。40h后将反应瓶取出，体系离心10min（4℃，12000rpm），上清液即为直接还原糖产物，采用二硝基水杨酸（DNS）法测定产物浓度，添加纳米材料后提高还原糖产率32.6%。
实施例4 终浓度0.5 nmol/L的SnO
2
纳米材料（20 nm粒径）辅助纤维素酶HDL160水解甘蔗渣的方法
称量75mg纳米SnO2，溶于30 ml醋酸-醋酸钠缓冲液（0.1mol/L，pH5.5）中，用超声波匀浆处理120min以上，制成200nM SnO2悬液（2.5mg/ml）。称取2份甘蔗渣1g(粉碎至粒径4mm左右)，加入30ml醋酸-醋酸钠缓冲液（0.1mol/L，pH5.5）中，加入10U纤维素酶， 其中一份加125 μL均匀的SnO2母液，最后再加入无菌的醋酸-醋酸钠缓冲液（0.1mol/L，pH5.5）至总体积50ml，使得SnO2纳米微粒终浓度为0.5 nmol/L。总反应体系置于恒温振荡箱中于50℃、120rpm反应40小时。40h后将反应瓶取出，体系离心10min（4℃，12000rpm），上清液即为直接还原糖产物，采用二硝基水杨酸（DNS）法测定产物浓度，添加纳米材料后提高还原糖产率9.6%。
实施例5 终浓度5 nmol/L的SiO
2
纳米材料（10 nm粒径）辅助纤维素酶EC1800水解稻秆的方法
称量16.7mg纳米SiO2，溶于100 ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.01mol/L，pH4.5）中，用超声波匀浆处理120min以上，制成200nM SiO2悬液（0.0835mg/ml）。称取2份水稻秸秆粉1g(粉碎至粒径4mm左右)，加入30ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.01mol/L，pH4.5）中，加入10U纤维素酶EC1800， 其中一份加1.25 ml均匀的SiO2母液，再加入无菌的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.01mol/L，pH4.5）至总体积50ml，使得SiO2纳米微粒终浓度为5 nmol/L。总反应体系置于恒温振荡箱中于50℃、120rpm反应40小时。40h后将反应瓶取出，体系离心10min（4℃，12000rpm），上清液即为直接还原糖产物，采用二硝基水杨酸（DNS）法测定产物浓度，添加纳米材料后提高还原糖产率24.1%。
实施例6 终浓度5 nmol/L的SiO
2
纳米材料（10 nm粒径）辅助纤维素酶HDL160水解稻秆的方法
称量16.7mg纳米SiO2，溶于100 ml柠檬酸-柠檬酸纳缓冲液（0.05mol/L，pH5.0）中，用超声波匀浆处理120min以上，制成200nM SiO2悬液（0.0835mg/ml）。称取2份水稻秸秆粉1g(粉碎至粒径4mm左右)，加入30ml柠檬酸-柠檬酸纳缓冲液（0.05mol/L，pH5.0）中，加入10U纤维素酶EC1800， 其中一份加1.25 ml均匀的SiO2母液，再加入无菌的柠檬酸-柠檬酸纳缓冲液（0.05mol/L，pH5.0）至总体积50ml，使得SiO2纳米微粒终浓度为5 nmol/L。总反应体系置于恒温振荡箱中于50℃、120rpm反应40小时。40h后将反应瓶取出，体系离心10min（4℃，12000rpm），上清液即为直接还原糖产物，采用二硝基水杨酸（DNS）法测定产物浓度，添加纳米材料后提高还原糖产率12.6%。
实施例7 终浓度5 nmol/L的SiO
2
纳米材料（10 nm粒径）辅助纤维素酶EC1800水解甘蔗渣的方法
称量16.7mg纳米SiO2，溶于100 ml醋酸-醋酸钠缓冲液（0.05mol/L，pH5.5）中，用超声波匀浆处理120min以上，制成200nM SiO2悬液（0.0835mg/ml）。将广西省桂林市所产甘蔗收获后榨糖的废弃部分剪碎成4mm左右的小段。在水解反应瓶中，加入1g干燥的磨碎的甘蔗渣于30ml醋酸-醋酸钠缓冲液（0.05mol/L，pH5.5）中，高压蒸汽灭菌处理20min，冷却至40℃。在上步体系中，加入10U（500 μL原始粗酶，总蛋白约25mg）的Iogen公司的纤维素酶EC1800和1.25 ml均匀的SiO2母液，最后再加入无菌的醋酸-醋酸钠缓冲液（0.05mol/L，pH5.5）使得SiO2纳米微粒辅助纤维素酶EC1800水解反应体系总体积至50ml，SiO2纳米微粒的终浓度为5 nmol/L。总反应体系置于恒温振荡箱中于50℃、120rpm反应40小时。40h后将反应瓶取出，体系离心10min（4℃，12000rpm），上清液即为直接还原糖产物，采用二硝基水杨酸（DNS）法测定产物浓度，添加纳米材料后提高还原糖产率9.6%。
实施例8 终浓度2.5 nmol/L的SiO
2
纳米材料（10 nm粒径）辅助纤维素酶HDL160水解稻秆的方法
称量16.7mg纳米SiO2，溶于100 ml柠檬酸-柠檬酸纳缓冲液（0.05mol/L，pH5.0）中，用超声波匀浆处理120min以上，制成200nM SiO2悬液（0.0835mg/ml）。将江苏省溧阳市所产水稻收获后的秸秆粉碎成4mm左右直径的小粒。在水解反应瓶中，加入1g干燥的磨碎的水稻秸秆废弃物于柠檬酸-柠檬酸纳缓冲液（0.05mol/L，pH5.0）中，高压蒸汽灭菌处理20min，冷却至40℃。在上步体系中，加入10U（400 μL原始粗酶，总蛋白约25mg）的Iogen公司的纤维素酶HDL160和625 μL均匀的SiO2母液，最后再加入无菌的柠檬酸-柠檬酸纳缓冲液（0.05mol/L，pH5.0）使得SiO2纳米微粒辅助纤维素酶HDL160水解反应体系总体积至50ml，SiO2纳米微粒的终浓度为2.5 nmol/L。总反应体系置于恒温振荡箱中于50℃、120rpm反应40小时。40h后将反应瓶取出，体系离心10min（4℃，12000rpm），上清液即为直接还原糖产物，采用二硝基水杨酸（DNS）法测定产物浓度，添加纳米材料后提高还原糖产率11.8%。
实施例9 终浓度0.1 nmol/L的Al(OH)
3
纳米材料（50 nm粒径）辅助纤维素酶EC1800水解稻秆的方法
称量143 mg纳米Al(OH)3，溶于30 ml醋酸-醋酸钠缓冲液（0.1mol/L，pH5.0）中，用超声波匀浆处理120min以上，制成50nM Al(OH)3悬液（4.77 mg/ml）。将江苏省溧阳市所产水稻收获后的秸秆粉碎成4mm左右直径的小粒。在水解反应瓶中，加入1g干燥的磨碎的水稻秸秆废弃物于醋酸-醋酸钠缓冲液（0.1mol/L，pH5.0）中，高压蒸汽灭菌处理20min，冷却至40℃。在上步体系中，加入10U（500 μL原始粗酶，总蛋白约25mg）的Iogen公司的纤维素酶EC1800和100 μl均匀的Al(OH)3母液，最后再加入无菌的醋酸-醋酸钠缓冲液（0.1mol/L，pH5.0）使得Al(OH)3纳米微粒辅助纤维素酶EC1800水解反应体系总体积至50ml，Al(OH)3纳米微粒的终浓度为0.1 nmol/L。总反应体系置于恒温振荡箱中于50℃、120rpm反应40小时。后将反应瓶取出，体系离心10min（4℃，12000rpm），上清液即为直接还原糖产物，采用二硝基水杨酸（DNS）法测定产物浓度，添加纳米材料后提高还原糖产率23.3%。
实施例10 终浓度0.1 nmol/L的Al(OH)
3
纳米材料（50 nm粒径）辅助纤维素酶HDL160水解甘蔗渣的方法
称量143 mg纳米Al(OH)3，溶于30 ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.05mol/L，pH5.0）中，用超声波匀浆处理120min以上，制成50nM Al(OH)3悬液（4.77 mg/ml）。将广西省桂林市所产甘蔗收获后榨糖的废弃部分剪碎成4mm左右的小段。在水解反应瓶中，加入1g干燥的磨碎的甘蔗渣于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.05mol/L，pH5.0）中，高压蒸汽灭菌处理20min，冷却至40℃。在上步体系中，加入10U（400 μL原始粗酶，总蛋白约25mg）的Iogen公司的纤维素酶HDL160和100 μl均匀的Al(OH)3母液，最后再加入无菌的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.05mol/L，pH5.0）使得Al(OH)3纳米微粒辅助纤维素酶HDL160水解反应体系总体积至50ml，Al(OH)3纳米微粒的终浓度为0.1 nmol/L。总反应体系置于恒温振荡箱中于50℃、120rpm反应40小时。40h后将反应瓶取出，体系离心10min（4℃，12000rpm），上清液即为直接还原糖产物，采用二硝基水杨酸（DNS）法测定产物浓度，添加纳米材料后提高还原糖产率9.6%。
实施例11 终浓度15 nmol/L的SiO
2
纳米材料（10 nm粒径）辅助纤维素酶HDL160水解稻秆的方法
称量25.1mg纳米SiO2，溶于100 ml柠檬酸-柠檬酸纳缓冲液（0.05mol/L，pH5.0）中，用超声波匀浆处理120min以上，制成300nM SiO2悬液（0.1253mg/ml）。将江苏省溧阳市所产水稻收获后的秸秆粉碎成4mm左右直径的小粒。在水解反应瓶中，加入1g干燥的磨碎的水稻秸秆废弃物于柠檬酸-柠檬酸纳缓冲液（0.05mol/L，pH5.0）中，高压蒸汽灭菌处理20min，冷却至40℃。在上步体系中，加入10U（400 μL原始粗酶，总蛋白约25mg）的Iogen公司的纤维素酶HDL160和2.50 ml均匀的SiO2母液，最后再加入无菌的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.05mol/L，pH5.0）使得SiO2纳米微粒辅助纤维素酶HDL160水解反应体系总体积至50ml，SiO2纳米微粒的终浓度为15 nmol/L。总反应体系置于恒温振荡箱中于50℃、120rpm反应40小时。40h后将反应瓶取出，体系离心10min（4℃，12000rpm），上清液即为直接还原糖产物，采用二硝基水杨酸（DNS）法测定产物浓度，添加纳米材料后提高还原糖产率6.2 %。
实施例12 终浓度20 nmol/L的SiO
2
纳米材料（10 nm粒径）辅助纤维素酶EC1800水解稻秆的方法
称量25.1mg纳米SiO2，溶于100 ml柠檬酸-柠檬酸纳缓冲液（0.05mol/L，pH5.0）中，用超声波匀浆处理120min以上，制成300nM SiO2悬液（0.1253mg/ml）。将江苏省溧阳市所产水稻收获后的秸秆粉碎成4mm左右直径的小粒。在水解反应瓶中，加入1g干燥的磨碎的水稻秸秆废弃物于柠檬酸-柠檬酸纳缓冲液（0.05mol/L，pH5.0）中，高压蒸汽灭菌处理20min，冷却至40℃。在上步体系中，加入10U（500 μL原始粗酶，总蛋白约25mg）的Iogen公司的纤维素酶EC1800和3.33 ml均匀的SiO2母液，最后再加入无菌的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.05mol/L，pH5.0）使得SiO2纳米微粒辅助纤维素酶EC1800水解反应体系总体积至50ml，SiO2纳米微粒的终浓度为20 nmol/L。总反应体系置于恒温振荡箱中于50℃、120rpm反应40小时。40h后将反应瓶取出，体系离心10min（4℃，12000rpm），上清液即为直接还原糖产物，采用二硝基水杨酸（DNS）法测定产物浓度，添加纳米材料后提高还原糖产率4.01 %。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
Claims (8)
1.一种纳米材料促进木质纤维生物质水解方法，其特征在于包括如下步骤：
第一步，纳米材料母液的配制：称取纳米材料加入到适宜纤维素酶水解反应的缓冲溶液中，充分分散至均一，配制成纳米材料母液；
第二步，纳米材料加入纤维素酶-纤维素底物体系促进水解：配制纤维素酶与纤维素底物体系，再加入纳米母液至工作纳米浓度，进行纤维素酶水解，水解结束后收获单糖。
2.根据权利要求1 所述的纳米材料辅助木质纤维素原料水解的方法，其特征是，所述纳米材料是指粒径处于纳米尺度范围的氧化物材料或氢氧化物材料或其组合。
3.根据权利要求1或2 所述的纳米材料辅助木质纤维素原料水解的方法，其特征是，所述纳米材料为SnO2, SiO2, Fe3O4，Al(OH)3中的一种或者几种。
4.根据权利要求1 所述的纳米材料辅助木质纤维素原料水解的方法，其特征是，所述工作纳米浓度大于0 nmol/L且小于等于20nmol/L。
5.根据权利要求1或4 所述的纳米材料辅助木质纤维素原料水解的方法，其特征是，所述工作纳米浓度为1nmol/L。
6.根据权利要求1 所述的纳米材料辅助木质纤维素原料水解的方法，其特征是，所述纤维素酶水解反应温度介于40℃到65℃之间。
7.根据权利要求1 所述的纳米材料辅助木质纤维素原料水解的方法，其特征是，所述配制纤维素酶与纤维素底物体系，是指按照纤维素酶供应商推荐的酶解配制纤维素酶与纤维素底物体系。
8.根据权利要求1 或7所述的纳米材料辅助木质纤维素原料水解的方法，其特征是，所述纤维素酶水解条件是纤维素酶供应商推荐的条件。
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