CN102326080A

CN102326080A - A+生物标志物的试验

Info

Publication number: CN102326080A
Application number: CN2010800085033A
Authority: CN
Inventors: 曾钢
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2009-02-20
Filing date: 2010-02-19
Publication date: 2012-01-18
Anticipated expiration: 2030-02-19
Also published as: US9354233B2; WO2010096674A2; CN102326080B; US20110311998A1; WO2010096674A3

Abstract

本发明公开了一种试验方法，该方法包括检测样品中至少一种抗体的存在与否或数量，该抗体特异性的结合第一生物标志物或其抗原决定表位，以及检测至少一种第二生物标志物的存在与否或数量，该方法包括单一反应步骤，通过该步骤，针对所述抗体的第一捕获试剂和针对所述第二生物标志物的第二捕获试剂共同与所述样品接触，检测所述抗体的存在与否或数量，并检测所述第二生物标志物的存在与否或数量。本发明还公开了用于前列腺癌的试验方法。

Description

A+生物标志物的试验

相关申请的交叉参考

本申请要求享有递交于2009年2月20日的序列号为61/153,991的美国专利申请的利益，其全部内容在此引入作为参考。

通过EFS-WEB递交的序列表的参考

与本申请一起通过EFS-WEB电子提交的、名称为“*034044_072WO1_ST25”(大小为3.89kb，创建于2010年2月19日)的序列表的ASCII文本文件的内容的全部在此引入作为参考。

对于政府支持的致谢

本发明是在国立健康研究所授予的基金号为CA128086以及CA137651的政府支持下完成的。政府对本发明拥有一定的权利。

技术领域

本发明简言之是关于抗体加(A+)生物标志物(biomarker)的试验，该试验用于检测和诊断受试者的癌症。

背景技术

肿瘤相关抗原(TAAs)的分子鉴定已经清楚地证实：人类的免疫系统能够与内源性产生的癌症细胞反应。参见van der Bruggen等(1991)Science254：1643-7。人类免疫系统中的胞内和体液手臂(humoral arms)均识别癌症细胞衍生出的TAA。参见Rosenberg SA(2001)Nature 411：380-4；以及Old等(1998)J Exp Med 187：1163-7。出于对人类癌症的血清学分析的特别兴趣，就要鉴定被存在于癌症患者血清中的抗体(Ab)识别的TAA。参见Sahin等.(1997)Curr Opin Immunol 9：709-16。抗体定义的TAA提供了体液免疫对自体肿瘤应答的分子细节。

为了研究覆盖广泛的患有任何特定癌症患者中的抗体应答，需要大量的TAA。目前，表征循环的抗体主要应用两个策略：(1)利用编码特异性TAA的噬菌体裂解物的传统的血清学检测；和(2)用纯化的重组蛋白作为抗原靶标的，基于酶联免疫法(ELISA)的方法。参见Stone等(2003)Int J Cancer104：73-84；以及Tan等(2005)N Engl J Med 353：2815-7。前一种方法需要大量的单独预先吸附有大肠杆菌噬菌体裂解物的血清，来降低背景；后一种方法是强有力的方法，但却需要纯化的由单独的TAA编码的蛋白。参见Zhang等(2003)Cancer Epidemiol Biomarker Prev 12：136-43；以及Lagarkova等(2003)Immunol Lett 85：71-4。

发明内容

本发明提供了一种试验方法，该方法针对样品中至少一种抗体和至少一种第二生物标志物，所述抗体特异性结合第一生物标志物或者其抗原表位，该方法包括单一反应步骤，通过该步骤，针对所述抗体的第一捕获试剂和针对所述第二生物标志物的第二捕获试剂共同与样品接触，检测所述抗体的存在与否或数量；以及检测所述第二生物标志物的存在与否或数量。

本发明的这项试验可以用于诊断或指示受试者为患有疾病(affliction)或者可能患有疾病，该试验包括，当所述抗体的存与否或数量和所述第二生物标志物的存在与否或数量的组合表明疾病，则诊断或指示该受试者为患有该疾病或可能患有该疾病。

在一些实施方式中，所述抗体的存在与否或数量被设定为第一值，而所述第二生物标志物的存在与否或数量被设定为第二值，第一值和第二值相结合从而给出指标值(index value)，然后，该指标值被用作诊断和指示该受试者为患有该疾病或可能患有该疾病。在一些实施方式中，所述第一值被设为0，表示不存在所述抗体，被设为1表示存在所述抗体；所述第二值被设为0，表示正常数量的所述第二生物标志物，被设为1，表示非正常的高数量的所述第二生物标志物，或被设为0与1之间的数字，表示正常数量和非正常的高数量之间的所述第二生物标志物。在一些实施方式中，当所述第一值和所述第二值的加权值之和等于或大于给定数值，则该受试者被指示为患有该疾病。在一些实施方式中，逻辑回归分析用于计算基于所述第一值和所述第二值的指标值。在这些实施方式中，当所述指标值等于或大于给定数值，该受试者被确定为患有该疾病。

在一些实施方式中，所述疾病是癌症，例如：前列腺癌，肝癌，乳腺癌，肺癌，卵巢癌，胃癌，甲状腺癌，膀胱癌，尿路上皮细胞癌，以及包括本领域已知的其它上皮癌等等。

在一些实施方式中，所述癌症为前列腺癌，所述第一生物标志物是前列腺癌相关抗原，例如：NY-ESO-1，MAGE-1，XAGE-1b，SSX2，4，P53，MUC-1，CEA，SOX2，AMACR，p90自身抗原(autoantigen)，LEDGFp75，HIP-1，p62自身抗原，GRP78，TMPRSS2-ERG融合物，等等，以及它们的抗原决定表位，所述第二生物标志物为前列腺特异性抗原(prostate specificantigen)。在一些实施方式中，所述抗原决定表位选自以下物质组成的组：AMACR：341-371；p90：796-827；LEDGFp75：310-342；HIP-1：150-180；HIP-1：338-378；SSX2，4：110-139；NY-ESO-1：1-40；XAGE-1b：1-25；以及XAGE-1b：57-81。在一些实施方式中，可以试验一种或多种类型的自身抗体(autoantibody)，例如：一组六个不同的“第一”生物标志物与试验至少一种第二生物标志物相结合，用来检测和/或测量六种不同类型的自身抗体。

在一些实施方式中，所述第一生物标志物是第一肿瘤抗原，所述第二生物标志物是第二肿瘤抗原。在一些实施方式中，所述第一肿瘤抗原和/或所述第二肿瘤抗原是肿瘤的标志物，该标志物可能是肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原。在一些实施方式中，所述第一肿瘤抗原和/或所述第二肿瘤抗原是癌症特异性标志物或者组织特异性标志物。在一些实施方式中，所述第二肿瘤抗原选自由以下物质组成的组：阿尔法胚胎蛋白(AFP)，癌抗原125(CA-125)，癌胚抗原(CEA)，人表皮生长因子受体2(Her2/neu)，肿瘤相关抗原CA 15-3，肿瘤相关抗原CA 19.9，人天门冬氨酸(aspartyl)(门冬酰)贝塔羟基化酶(HAAH)，甲状腺球蛋白，膀胱肿瘤抗原等等。在一些实施方式中，第一肿瘤抗原是NY-ESO-1，XAGE-1b，或者SSX2，4，第二肿瘤抗原是前列腺特异性抗原(prostate specific antigen，PSA)，阿尔法胚胎蛋白(AFP)，肿瘤抗原125(CA-125)，癌胚抗原(CEA)，人表皮生长因子受体2(Her2/neu)，肿瘤相关抗原CA 15-3，肿瘤相关抗原CA 19.9，人天门冬氨酸(门冬酰)贝塔羟基化酶(HAAH)，甲状腺球蛋白，膀胱肿瘤抗原，等等。在一些实施方式中，可试验多于一个的数量的第二肿瘤抗原。

在一些实施方式中，本发明提供了一种纯化的或分离的肽。这种肽选自由以下物质组成的组：AMACR：341-371；p90：796-827；LEDGFp75：313-345；HIP-1：150-180；SSX2，4：110-139；XAGE-1b：1-25；NY-ESO-1：1-40；XAGE-1b：57-81；AMACR：251-282；HIP-1：338-378以及p62：156-184。

在一些实施方式中，本发明提供可以进行根据本发明的试验的试剂盒，其中包括共同包装而成的对于所述第一生物标志物的捕获试剂以及针对所述第二生物标志物的捕获试剂。例如：用于进行自身抗体加前列腺特异性抗原(autoAb+PSA)试验的试剂盒，包括共同包装而成的至少一种特异性结合针对前列腺癌相关抗原(不是前列腺特异性抗原)的autoAb的捕获试剂，以及至少一种特异性结合PSA的抗体。

本发明的试验可以用作疾病的早期发现(例如：在可观察的临床症状出现之前)，例如受试者的癌症，确定受试者是否可能患有周期性复发的癌症，确定患有癌症的受试者的预后。(例如：通过所述第一值和所述第二值的加和高于或者低于给定数值来指示受试者是否对一定的治疗具有较好的或较差的恢复或响应)。

在一些实施方式中，本发明提供了一种诊断或指示受试者为患有或可能患有前列腺癌的方法，该方法包括试验来自受试者的样本，与前列腺癌相关抗原或其抗原决定表位特异性结合的自身抗体的存在与否或数量，以及前列腺特异性抗原的存在与否或数量，其中，所述前列腺癌相关抗原不是前列腺特异性抗原，当所述自身抗体的存在与否或数量与所述前列腺特异性抗原的存在与否或数量的结合表明前列腺癌，则诊断或指示该受试者为患有或可能患有前列腺癌。在一些实施方式中，样品的试验仅通过单一反应步骤进行，通过该步骤，针对所述自身抗体的第一捕获试剂和针对所述前列腺特异性抗原的第二捕获试剂共同与所述样品接触。

前面的概述和接下来的细节描述仅为示例性和说明性的，意在对要求保护的发明提供进一步的解释。所包括的附图提供对本发明的进一步理解，在此引入并组成本说明书的一部分，阐述本发明的一些实施方式，并与说明书一起用于阐释本发明的原理。

附图说明

通过参考附图进一步理解本发明，其中：

图1A示出了对36个患者(20人患有前列腺癌，16人患有前列腺良性增生(BPH))进行PSA和antoAb+PSA试验的受试者工作特性(ROC)曲线。PSA水平由商品化的ELISA试剂盒所测定。针对6种肽抗原决定表位的所述自身抗体用ELISA测定。

图1B示出了比较对于特定的病人群的autoAb+PSA试验的组合指标和单独使用PSA的区分能力的表格。

图2是通过基于ELISA的试验和MAP的试验，比较随机抽取的受试者(包括健康受试者，患有BPH的受试者以及活体检查验证患有前列腺癌的受试者)血清中的PSA水平(ng/ml)的图。用MAP试验与基于商品化的ELISA试验所得到的PSA水平是类似的，范围为0.1-25ng/ml。

图3是autoAb+PSA试验板的示意图。具体地，示例了用于基于MAP试验的96孔板(密理博)。放大的孔显示了十种不同颜色的试验珠子，1个包被了作为对照的贝塔-半乳糖苷酶(β-gal)肽，8个包被了独立的PCAA肽用来检量自身抗体，1个包被了抗PSA(anti-PSA)抗体用来测量PSA。PSA标准品(n＝8)，和健康捐赠者(n＝8)的血清的每个样品加两个平行孔，目的分别是确定PSA装置(PSA units)以及血清阳性。已知的针对给定的抗原决定表位或者蛋白的阳性血清，例如：NY-ESO-1能被用作对照。所述珠子的底纹和尺寸仅为说明。

图4A用图表显示了单独使用基于MAP的试验，而不检测自身抗体，确定总PSA水平的线性范围的比较。线性回归方程显示在图的上方。而图4B显示了，存在针对8种抗原决定表位的自身抗体检测，线性范围同样能够达到0-30ng/ml的总PSA。

图4B用图表显示了用基于MAP的autoAb+PSA的多重试验确定总PSA水平的线性范围的比较(即，与针对8个肽抗原决定表位的自身抗体的相同反应步骤的相同样品中测定的PSA水平)。线性回归方程显示在图的上方。

图5显示的是在最小稀释浓度下，从252个患者(131人患有前列腺癌，121人患有BPH)的PSA和autoAb+PSA试验得到的ROC曲线。PSA水平以及自身抗体根据本文描述的autoAb+PSA的多重试验测出。

图6显示的是在最大稀释浓度下，从252个患者(131人患有前列腺癌，121人患有BPH)的PSA和autoAb+PSA试验得到的ROC曲线。PSA水平以及自身抗体根据本文描述的autoAb+PSA的多重试验测出。

具体实施方式

本发明提供了一种用于诊断受试者为存在癌症患病可能或患有癌症的试验，其中，至少一种特异性结合第一肿瘤抗原决定表位(TA)的自身抗体(autoAb)以及至少一种生物标志物，例如前列腺癌生物标志物，前列腺特异性抗原(PSA)，均能够在来自受试者的样本中被检测和/或测量到。在一些实施方式中，所述自身抗体和所述生物标志物在同一样品中被检测或测量到。在一些实施方式中，所述自身抗体和生物标志物在同一样品中同时被检测或测量到。

如本文所用的，“抗原决定表位”是被给定的抗体所识别的分子的部分。

如本文所用的，“自身抗体”指的是受试者产生的一种抗体，其直接针对一种或多种受试者自身的抗原(例如：肿瘤抗原)。如本文所用的，“抗体”指的是免疫球蛋白分子及其中的免疫激活部分(即，含有抗原结合位点、特异性结合抗体直接针对的分子的分子)。如此，抗体这个术语不仅仅包括全部的抗体分子，也包括抗体的多聚体、抗体的片段以及抗体的变体(包括衍生物)，抗体的多聚体和抗体的片段。本文中，被术语抗体所定义的分子的例子包括但不限于：单链Fvs(scFvs)，Fab片段，Fab’片段，F(ab’)₂，二硫键连接的Fvs(sdFvs)，Fvs，以及含有VL或VH结构域，或可选择的由VL或VH结构域组成的片段。本文中所用术语“单链Fv”或“scFv”指的是含有抗体的VH结构域与抗体的VL结构域连接而成的多肽。本发明中的抗体也可包括抗体的多聚体形式。例如，本发明的抗体也可以为免疫球蛋白单体分子的二聚体、三聚体或更高级的聚合体。本发明的所述抗体可以为天然的或合成的，多克隆或者单克隆，或嵌合分子，并且可以为免疫球蛋白分子的任何形式(如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，任何类(如，IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁和IgA₂)，或任何亚类。

如本文所用的，分子，例如抗体，“特异性结合”另一分子，意思是这种相互作用依赖于被结合的分子上特异性结构的存在，例如，抗原决定表位。例如，特异性结合蛋白的抗体，识别和结合蛋白上的特异性结构，而不是无差别地结合从而引起非特异性结合和/或背景结合。如本文所用的，“非特异性结合”以及“背景结合”指的是不依赖特异性结构(例如，具体的抗原决定表位)存在的相互作用。

如本文所用的，“生物标志物”指的是用作过程，事件或者状态表征物的物质。生物标志物可以是生物分子，例如核酸分子(例如：微小RNA，基因组DNA等等)，蛋白，多糖，等等。生物标志物包括肿瘤抗原以及肿瘤标志物。

如本文所用的，“肿瘤抗原”指的是肿瘤特异性抗原(TSAs)，通常可分为只存在于肿瘤细胞上的抗原和肿瘤相关抗原(TAAs)，而肿瘤相关抗原又通常分为存在于一些肿瘤细胞上的抗原以及存在于一些正常细胞上的抗原。

如本文所用的，“肿瘤标志物”是指在机体组织或体液中可以找到的，由肿瘤细胞或非肿瘤细胞应答癌细胞(cancerous cells)的存在而产生的物质。肿瘤标志物的实例包括AFP(在肝癌中)，CA 125(在卵巢癌中)，CA 15-3(在乳腺癌中)，CEA(在卵巢癌，肺癌，乳腺癌，胰腺癌，胃肠道癌症中)，以及PSA(在前列腺癌中)。肿瘤标志物可以被分为两类：癌症特异性标志物以及组织特异性标志物。肿瘤标志物包括肿瘤抗原。但肿瘤标志物可不引发免疫应答。

如本文所用的，“可能患有癌症的受试者”指的是受试者显示出一种或多种表明癌症的症状(例如，可检测到的肿块或肿团(mass))。可能患有癌症的受试者通常没有被检测到患有癌症。然而，可能患有癌症的受试者可包括接受初期诊断(例如：显示肿团的CT扫描或者X射线)的人，但它们对癌症的类型或阶段并不知情。可能患有癌症的受试者也可包括曾经患过癌症的人(例如，病情缓解的个体)。可能患有癌症的受试者也可为具有患癌症风险的受试者。

如本文所用的，“具有患癌症风险的受试者”指的是受试者存在着一种或多种的发展为特定癌症的风险因子。风险因子包括基因易染病体质，环境暴露，先前存在的非癌症疾病，先前的癌症，以及生活方式。

如本文所用的，“受试者”可以与“患者”相互替换，指的是例如人类的哺乳动物。

如本文所用的，“癌症的阶段”指的是能够被本领域技术人员识别的给定癌症的发展水平。用于确定癌症的阶段的标准包括但不限于：肿瘤的尺寸，肿瘤是否扩散到身体的其它部位，肿瘤扩散到哪些部位(例如，在身体相同的器官或区域还是扩散到其它器官)。

如本文所用的，“检测受试者是否患有癌症”指的是检测表明癌症的肿瘤抗原或自身抗体存在与否。

如本文所用的，“被诊断为患有癌症的受试者”指的是具有癌细胞的受试者。可以通过任何合适的方法对癌症进行诊断，包括但不限于本发明的诊断方法。

当涉及到核酸分子或肽，多肽时，术语“分离的”指的是通常从自然界相关的组分或杂质中分离所得到的给定生物分子。

如本文所用的，“纯化的”成分，指的是从该成分中去除了其它组分(例如，污染物)。

如本文所用的，术语“样品”具有其广泛的含义。一方面，它表示包括从任何来源获得的样本或培养物，也包括生物和环境样本。生物样品可从动物(包括人类)中得到，包括液体，固体，组织和气体。生物样品包括血液制品，例如血浆，血清等等。

如本文所用的，“捕获试剂”指的是用来特异性结合感兴趣的分析物的分子。所述捕获试剂可被固定在基质上。例如，若所述感兴趣的分析物是抗原，所述捕获试剂可能是特异性结合该抗原的抗体；而若所述感兴趣的分析物是抗体，所述捕获试剂可能是该抗体特异性结合的抗原决定表位。

如本文所用的，“A+生物标志物试验”或者“A+B试验”指的是本发明的试验：其中，至少一种抗体(A)加上至少一种生物标志物(B)在样品中被检测和/或测量到。如本文所用的，“autoAb+生物标志物试验”或“autoAb+B试验”指的是本发明的试验：其中，至少一种特异性结合到第一生物标志物的抗原决定表位上的自身抗体(autoAb)加上至少一种第二生物标志物(B)在样品中被检测和/或测量到。如本文所用的，“autoAb+TA试验”指的是本发明的试验：其中，至少一种特异性结合第一生物标志物的抗原决定表位上的自身抗体(autoAb)加上至少一种作为肿瘤抗原(TA)的第二生物标志物在样品中被检测和/或测量到。如本文所用的，“A+抗原试验”指的是本发明的试验：其中，至少一种抗体(A)加上至少一种抗原在样品中被检测和/或测量到。A+生物标志物试验包括A+抗原试验，autoAb+生物标志物试验，以及autoAb+TA试验。

根据本发明中的A+生物标志物试验，得到针对第一生物标志物的抗体指数(indices)，然后用本领域已知的逻辑回归方法，将其与第二生物标志物的数值相结合，其中，二进制因变量为1表示存在给定癌症、疾病或感染，而为0表示不存在给定癌症、疾病或感染。而自变量为给定生物标志物以及总抗体指数。这种分析可以通过SAS统计学文库(8.2或9.1版本，SAS研究所，Cary，NC)完成。基于拟合模型，使用由受试者样本计算得到的指标值(index value)可以计算出给定受试者的预测可能性。大体上说，如果预测可能性超过截止值(cutoffvalue)，例如，0.50，个体将被归类为阳性。优化的截止值可以由ROC曲线确定，将在下面进行讨论。对于给定的癌症、疾病或者感染，A+生物标志物试验的指标的诊断能力可以通过研究它的ROC曲线来得到，ROC曲线是由灵敏度对1-特异性构成的图，截止值在它的整个取值范围内变化。对于任意给定特异性的A+生物标志物试验而言，使用ROC曲线可以评价指标的灵敏度。另外，可以通过ROC曲线与连接左上角和右下角的直线的交叉点来确定最优的截止值。对于给定的截止值，灵敏度和特异性的置信区间可以通过普通的理论方法或计算机辅助程序的方法得到。具有统计学意义的检测也可以通过使用ROC曲线下的面积(AUC)或部分面积比较ROC曲线来进行。

为了举例说明本发明中的autoAb+生物标志物试验，对前列腺癌相关抗原(PCAAs)的不同B细胞抗原决定表位进行研究，使其具有补充传统的前列腺特异性抗原(PSA)测试的能力。如本文所用的“传统的PSA测试”指的是那些被美国食品与药物管理局所许可的当时的发明。这种传统的PSA测试具有假阳性(10人中的7人被检出可疑的PSA水平，但却没有患前列腺癌)和假阴性(10人中的2.5人患有前列腺癌但PSA水平却没有升高)的倾向。参见Thompson等(2004)N Engl J Med 350(22)：2239-46，在此引入作为参考。

如本文公开的，AMACR，p90自身抗原，LEDGFp75，HIP-1，SSX2，4，NY-ESO-1，以及XAGE-1b潜在的B细胞抗原决定表位的候选肽可通过本领域的已知方法预测。参见蛋白鉴定：Rost等(2004)蛋白预测服务器。核酸研究32(网页发行)：W321-W326；Zeng等(2005)Int J Cancer 114：268-73，以及美国专利号7,420,032，在此引入作为参考。

AMACR，p90自身抗原，LEDGFp75，HIP-1，SSX2，4，NY-ESO-1，以及XAGE-1b的序列，已被它们的基因库(GenBank)登记号和GI号码验证，在此将它们的全部引入作为参考，如下：

AMACR＝AAD10205.1，GI：4204097，序列截止于2009年11月30日。

p90自身抗原＝NP_065941.2，GI：190194355，序列截止于2010年1月17日。

LEDGFp75＝AAC25167.1，GI：3283352，序列截止于2009年11月30日。

HIP-1＝NP_005329.3，GI：38045919，序列截止于2010年2月7日。

SSX2，4＝CAD90570.1，GI：30519359，序列截止于2008年10月15日。

NY-ESO-1＝CAA05908.1，GI：3255991，序列截止于2008年10月11日。

XAGE-1b＝CAC38108.1，GI：13992558，序列截止于2006年11月15日。

关于以上被登记号确认的序列，所提供的日期是最后更新的日期。需要注意的是当序列被修改时，就会被赋予一个新的GeneBank登记号以及一个新的GI号码。在网络的NCBI GenBank数据库中可以查找修订历史(例如：万维网网址ncbi.nlm.nih.gov/sviewer/girevhist.cgi？)。因此，以上所指的日期并不说明在该所指的日期之前，序列与给定日期提交的不同。例如，对于GI：190194355，该序列从2008年6月12日至2010年1月17日之间是相同的，但是，在2008年6月12日之前，这个序列是不同的，公布为GI：24308239。因此，阐明如下：

AMACR：341-371＝KRDPFIGEHTEEILEEFGFSREEIYQLNSDK(SEQ IDNo：1)；

p90：796-827＝DREHKLANLHQKTKVQEEKIKTLQKEREDKEE(SEQ IDNo：2)；

LEDGFp75：313-345＝DRKRKQEEQMETEQQNKDEGKKPEVKKVEKKRE(SEQ ID No：3)；

HIP-1：150-180＝MEYHTKNPRFPGNLQMSDRQLDEAGE SDVNN(SEQID No：4)；

SSX2，4：110-139＝KIMPKKPAEEGNDSEEVPEASGPQNDGKEL(SEQ IDNo：5)；

XAGE-1b：1-25＝MESPKKKNQQLKVGILHLGSRQKKI(SEQ ID No：6)；

NY-ESO-1：1-40＝MQAEGRGTGGSTGDADGPGGPGIPDGPGGNAGGPGEAGAT(SEQ ID No：7)；

XAGE-1b：57-81＝GVKVKIIPKEEHCKMPEAGEEQPQV(SEQ ID No：8)；

AMACR：251-282＝KSDELPNQMSMDDWPEMKKKFADVFAKKTKAE(SEQ ID No：9)；

HIP-1：338-378＝SQQNLFDNKFDDIFGSSFSSDPFNFNSQNGVNKDEKDHLIE(SEQ ID No：10)；和

p62：156-184＝DEEVSSPSPPQRAQRGDHSSREQGHAPGG(SEQ ID No：11)。

然后，通过本领域已知的方法合成候选肽。具体地，候选肽在Genscript公司(New Brunswick，NJ)和GeneMed合成公司(San Antonio，TX)的多肽合成仪(吉尔森公司，Worthington，OH)上，通过固相合成得到。每个候选肽的分子量均由质谱确定以确认其同一性。所述候选肽重悬于二甲基亚砜，浓度为20mg/ml，储存在-20℃待用。

接下来，采用本领域已知的方法，将候选肽与患有组织学证实的前列腺癌的受试者和健康受试者所采集到的血清样本一起进行筛选。参见Zeng等(2005)Int J Cancer 114：268-73以及Zeng等(2000)J Immunol 165：1153-9，在此将其全部内容引入作为参考。所有血清样品的采集均在加州大学洛杉矶分校所批准的内部评级标准(IRB)操作条件下完成。所述患有组织学证实的前列腺癌的受试者分别处于不同的癌症临床阶段。血清样品储存在-20℃待用。在96孔MaxiSorp板(Nunc，Denmark)上，以50微升PBS缓冲液将多肽稀释至10纳克/孔，4℃过夜。作为对照的96孔板包被了来自贝塔-半乳糖苷酶的肽。除非另外特殊说明，所有的血清样品均以含有5％胎牛血清的PBST(PBS缓冲液中加入吐温-20)稀释为1∶25、1∶125以及1∶625。这三个稀释浓度下的每个样品分别加入到预先包被的ELISA平板中。室温孵育2个小时后，洗涤平板，再加入以含有5％胎牛血清的PBST稀释的第二抗体(共价偶联了辣根过氧化物酶的山羊抗人免疫球蛋白，Sigma公司，圣路易斯)。平板显影后，利用酶标仪(ELISA reader)在450nm处读取吸收值。截止值被定义为健康捐赠者的平均光密度值(OD)加上三倍的标准偏差(SD)。每个血清样品的三个稀释浓度中，有两个的OD值超过截止值，则提供该血清的癌症患者被认定为阳性。

预测以及合成的候选肽列于下表1中：

通过确定抗给定候选肽的阳性血清样品与其相应的全长PCAA之间确实存在反应来证实候选肽为抗原决定表位。具体地，根据本领域已知的方法，重组表达所述相应的全长PCAA，并以血清反应阳性和阴性的血清样品进行western blot。参见例如Zeng等(2000)J Immunol 165：1153-9，在此将其全部内容引入作为参考。所有表1中的候选肽均通过了确认筛选，对于那些没有通过患有前列腺癌的受试者和健康受试者自身抗体识别的候选肽，没有进一步研究。

另外，对于ESO和XAGE肽，证实的用于自身抗体+PSA试验抗原决定表位在此示例性地列于下表2中：

如本文所述，每个给定的肽名字冒号后面的数值范围代表相应的由给定的肽构成的全长蛋白的氨基酸残基。例如，对于AMACR：341-371，其对应的全长蛋白为GI：4204097。因此，AMACR：341-371由GI：4204097的341-371位的氨基酸残基所构成。

XAGE-1b：1-25，XAGE-1b：57-87，以及NY-ESO-1：1-40是预先已经证实的抗原决定表位。参见例如，美国专利号7,420,032，其在此引入作为参考。除去这三种已经被证实的抗原决定表位以及表2中列出的六种被证实的抗原决定表位，AMACR：341-371，LEDGFp75：313-345，SSX2，4：110-139，p90：796-827，NY-ESO-1：1-40以及XAGE-1b：1-25被随机地抽取来确定使用自身抗体结合PSA水平的试验是否能够区分健康受试者、患有前列腺癌的受试者以及患有良性前列腺增生(BPH)的受试者的血清样品。

使用基于ELISA的测量，通过逻辑回归模型，生成了组合autoAb+PSA的指标，作为预测的患有前列腺癌的可能性。具体地，所述抗原决定表位的抗原决定表位指数与用逻辑回归方法得到的PSA值相结合，其中，二进制因变量为1表示前列腺癌，为0则表示BPH；并且自变量是PSA以及6种抗原决定表位指数。对于针对给定抗原决定表位的抗体，指标值是由三个不同稀释浓度下的三个标准化的OD值中的最大值计算得到的。对于给定的稀释浓度，标准化的OD值被定义为(OD-健康受试者的OD平均值)/(健康受试者的OD值的标准偏差)。

值得注意的是，当且仅当三个标准化的OD值中的至少一个超过截止值时，指标会超过截止值(因此将受试者归类为患有前列腺癌)。使用三种稀释浓度而非一种是为了发现不同浓度的血清样品的标准化OD值之间可能的差异性。受试者工作特征(ROC)曲线用来比较PSA水平和组合的PSA指数的区别前列腺癌患者和BPH患者的诊断能力。

对16个患有BPH的受试者以及20个患有由活体检测确认的前列腺癌的受试者的初步免疫学试验显示出：对于区分受试者为患有BPH或患有前列腺癌，PSA水平的检测结合针对一系列抗原决定表位的自身抗体水平的检测提供至少约23％的灵敏度的增加，至少约50％的特异性的增加以及至少29％的准确性的增加。初步的免疫学试验的结果总结在图1A和图1B中，图1A中描述了：PSA和autoAb+PSA的ROC曲线，以及显示出：组合autoAb+PSA指标在区分前列腺癌和BPH上明显具有优于单独的PSA的能力。如图1A所示，ROC曲线下的面积(AUC)由0.66显著上升到0.85。图1B以0.5作为预测可能性的截止值，总结了灵敏度、特异性以及预测的准确性。因此，根据本发明的autoAb+PSA试验可用于诊断受试者为患有良性的组织增生，例如BPH，或者为患有癌症，例如前列腺癌。

例如，为了确定受试者是否应当被归类为健康(未患有前列腺癌)，还是患有BPH，或者患有前列腺癌，从该受试者获得血清样品，然后试验自身抗体的数量和PSA的数量。每种检测的自身抗体，给出值0或值1。检测量超过了给定的自身抗体的截止值，设定为值1。给定的自身抗体的截止值是该给定的自身抗体在健康受试者体内的平均值加上两倍的标准偏差。例如，在一系列健康受试者中，自身抗体X的平均数量为0.23，其标准偏差为0.08。该截止值为0.39。因此，对于自身抗体X而言，大于0.39的数值则被设定为1。这样，自身抗体值之和除以检测的自身抗体的数目，得到总自身抗体值。例如，6种自身抗体值之和为4，则总自身抗体值为0.67(4/6)。这样，检测PSA数量，并被设定为0-1之间的数值。例如，低于4.0ng/ml的数量可被设定为0，高于10.0ng/ml的数量可被设定为1。在一些实施方式中，PSA在4-10ng/ml之间的可以将值设为0.5。

给定样品的总自身抗体值加上PSA数值得到指标。如果该指标落入与健康受试者一致的范围内，该受试者被归类为健康。如果该指标落入与患有BPH的受试者一致的范围内，该受试者被归类为患有BPH。如果该指标落入与患有前列腺癌的受试者一致的范围内，该受试者被归类为患有前列腺癌。

例如，在本文示例的基于ELISA的试验中，PSA的数量低于4.0ng/ml被设定为值0，PSA的数量高于10.0ng/ml被设定为值1，PSA的数量为4-10ng/ml之间的任意值被设定为值0.5，以及检测针对AMACR：341-371，LEDGFp75：313-345，p62：155-375，p90：796-827，NY-ESO-1：1-40和XAGE-1b：1-25的自身抗体的数量。指标为1.5或更大的受试者则被指定为患有前列腺癌。

本发明的autoAb+TA试验需要检测至少一种针对第一抗原的自身抗体加上第二抗原。本领域已知的免疫学试验只能(a)通过抗体作为捕获试剂检测和测量抗原，或者(b)通过抗原作为捕获试剂检测和测量抗体。现有技术中，没有免疫试验能在同一样品中同时检测和/或测量抗原和抗体，因为抗原和抗体的测量具有根本上的不同。

因此，为了确定是否可能实现在同一样品中同时检测和/或测量至少一种自身抗体和至少一种抗原，进行了接下来的基于珠子的多重分析物展示生物试验(MAP试验)，例如，进行基于

技术(Luminex公司，奥斯丁，德克萨斯)的生物试验。

采用本领域已知的方法，将捕获试剂，即，6种抗原决定表位以及抗-PSA抗体(MP011，Fullmoon Biosystems有限公司，森尼维耳市，加拿大)，固定在微球上，即，SeroMAP^TM微球(Luminex公司，奥斯丁)。具体地，对于每种捕获试剂，将约100微升(1.25×10⁶个SeroMAP^TM个微球)的储存微球悬浮液，通过10000rpm离心2分钟进行沉淀。去除上清液，使用微量震荡仪和超声仪将微球重悬在25微升PBS缓冲液(pH7.2)中。重复该洗涤步骤，最终将微球重悬在20微升PBS缓冲液中。将约2.5微升N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐(Sulfo-NHS，50毫克/毫升)和2.5微升1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC，50毫克/毫升)加入到微球悬浮液中，轻微震荡。该悬浮液在室温孵育20分钟，以5分钟的间隔进行震荡和超声。活化的微球以62微升的MES缓冲液(0.1M，pH6.0)洗涤两次，重悬于25微升MES中。将31.25微克的捕获试剂(在二甲基亚砜中的浓度为20微克/微升)用100微升MES缓冲液稀释，加入到活化和洗涤后的微球中，该悬浮液在室温中搅拌2小时，以30分钟为间隔进行震荡和超声。与捕获试剂连接的微球洗涤后重悬于PBS缓冲液中。

与基于ELISA的试验相类似的，计算特异性平均荧光强度(MFI)比率，即，针对靶标肽(抗原决定表位)的MFI与针对对照肽的MFI的比率。如果对于三个不同稀释浓度下的给定血清样品，其特异性MFI比率均超过95％的截止值(健康受试者的平均MFI比率加上两倍的标准偏差)，该样品被认为是阳性。如果对于三个稀释浓度下的给定血清样品，其中1个的特异性MFI比率超过95％的截止值，剩余2个稀释浓度中至少1个的特异性MFI比率超过99％的截止值(健康受试者的平均MFI比率加上三倍的标准偏差)，该样品也会被认为是阳性。MAP试验与基于ELISA的试验相比，在检测自身抗体时显示出了更优的信噪比(数据未示出)。

具体地，使用基于MAP的测量，通过逻辑回归模型，得到组合autoAb+PSA的指标，作为预测的患有前列腺癌的可能性。具体地，将自身抗体指数与用逻辑回归方法得到的PSA值相结合，其中，二进制因变量为1时表示前列腺癌，为0则表示BPH，并且自变量为PSA数量以及6种抗原决定表位指数。对于针对给定抗原决定表位的抗体，指标值是根据三个不同稀释浓度的三个标准化的MFI值的平均值(平均荧光强度)计算得到的。对于给定的稀释浓度，标准化的MFI值被定义为(MFI-健康受试者的MFI平均值)/(健康受试者的MFI值的标准偏差)。例如，对于患者X，如果针对NY-ESO-1的、血清稀释浓度为1/10的自身抗体的MFI值为24.5，而针对对照肽，例如贝塔-半乳糖苷酶、在1/10浓度的MFI值为0.94。一组健康受试者(例如为12个)也以同样的实验进行检测。针对NY-ESO-1的自身抗体与对照的MFI比率的平均值为1.1，标准偏差为2.1。在1/10稀释浓度中，患者X的针对NY-ESO-1的自身抗体的标准化的MFI比率为(24.5/0.94-1.1)/2.1＝11.9。与之类似的，计算在1/20和1/50稀释浓度中，针对NY-ESO-1的自身抗体的MFI比率为：1/20时为10.5和1/50时为9.9。3个标准化的MFI的平均值为：(11.9+10.5+9.9)/3＝10.8。

在这些基于MAP的试验中，可以通过上面所述的基于MFI比率的逻辑回归，通过线性拟合计算出给定的自身抗体的指标(即，y＝1/(1+exp(-线性回归)))。Y即为二分变量(dichotomized variable)(1＝疾病，例如癌症；0＝正常，例如BPH/前列腺良性增生(prostitis))是由线性回归的系数计算得到的，其中，生物标志物的系数由该数据估算。每个自身抗体的指标值可被结合给出组合自身抗体指标，然后与PSA指标一起得出总指标。如果从病人中得到的总指标超过了由健康受试者确定的指标值，那么这个病人则被认为患有给定的疾病。例如，前列腺癌。

或者，如本文示例的，为了得到autoAb+PSA试验的总指标值，上文所述的基于MFI比率的逻辑回归，可以通过线性回归的系数计算出来，其中，生物标志物的系数的训练数据中估算出来，例如：124位健康捐赠者，121位BPH/前列腺良性增生患者(非癌症＝0)，以及前列腺癌患者(癌症＝1)的MFI比率。患者患有前列腺癌的可能性(p)按如下计算：其中，βn是自身抗体或生物标志物的线性回归的系数，MFI是相对于对照的标志物的比率。Log(p/1-p)＝β0+β₁×MFI₁+β₂×MFI₂+β₃×MFI₃...+β_n×MFI_n。本领域技术人员能够容易地进行这个计算。

因此，根据本文描述的基于MAP的autoAb+PSA试验，若p值小于0.5，该受试者被指定为健康；等于或者大于0.5，该受试者被指定为患有前列腺癌或可能患有前列腺癌。

值得注意的是，使用A+生物标志物试验未知的样品或受试者时，不需要每次都测定一系列健康受试者的给定的生物标志物的平均数量，或截止值。换言之，由受试者获得的生物标志物的指标可以通过将该生物标志物的测量数量(微克/升)与之前测定的为给定数量获得的指标值相关联来确定，例如，使用标准化表格求得一个范围内的测量数量的指标值。

除此之外，还应当注意的是，使用A+生物标志物试验未知的样品或受试者时，不需要每次都确定生物标志物的系数。具体地，对于给定的人群组，给定的系数只需要测定一次，而且这个系数可以作为标准系数。还需要注意的是，给定的生物标志物的系数在不同人群组中是不断变化的，例如，不同的年龄组别，不同的种族组别等等。虽然如此，本领域技术人员仍然可以使用本文的方法，容易地测定给定人群组的生物标志物的系数。因此，可以预期的是，本发明的A+生物标志物试验，能够通过合适的调整，以针对感兴趣的特定的人群组。例如，使用本文公开的方法，通过合适的调整(例如，增加敏感度，特异性，准确性，和ROC曲线)自身抗体+PSA试验，以适应于50-55岁的男性受试者，能够很容易的确定对于该窄的人群组(例如50-55岁的老年男性)的生物标志物的系数。

将血清中总PSA定量的MAP试验与传统的基于ELISA的试验相比较。在这些实验中，使用纯化的PSA标准品(n＝8)，并通过MAP试验确定，该MAP试验针对可观察的荧光输出(MFI)来生成具有超过0.95(n＝8)的相关系数的高强度的反曲线。表2的结果显示出MAP试验可用于定量血清样品中的总PSA水平。

具体地，对于已知PSA水平的血清样品，(通过商品化的PSA试剂盒测定)，用图3中图示的MAP试验装置定量，其PSA水平范围由500pg/ml到高达5μg/ml。如图4A和图4B所示，MPA试验测得的PSA水平，其中，单独检测的PSA水平或者结合一些自身抗体的PSA水平，大体上与基于ELISA试验得到的已知的PSA水平是一致的。这些结果显示，在同一样品中，使用同一反应步骤试验抗原和一种或多种抗体，不会显著影响给定被测物的测量。因此，可以在同一样品中，通过同一反应步骤，试验至少一种抗体和至少一种抗原。

因此，本发明提供了A+生物标志物的多重试验。如本文所用的，“A+生物标志物的多重试验”和“A+多重试验”指的是在同一样品中，通过同一反应步骤，检测和/或测量至少一种针对第一生物标志物的抗体加上(A+)至少一种第二生物标志物的试验。换言之，如本文所用的，“多重试验”用于表明，所述一个或多个抗体以及另一个生物标志物，例如抗原，能够在同一样品中通过同一反应步骤被检测和/或测量到。例如，“autoAb+TA的多重试验”，即为autoAb+生物标志物的多重试验，指的是在同一样品中，通过同一反应步骤，检测和/或测量至少一种针对第一抗原的自身抗体以及至少一种第二抗原的试验。关于“多重试验”，所述“同一反应步骤”意味着所有的捕获试剂同时与所述样品接触。本发明的A+多重试验包括autoAb+生物标志物的多重试验，A+抗原多重试验，autoAb+TA多重试验，等等。本发明的A+多重试验可为基于MAP的试验。

在一些实施方式中，本发明的A+生物标志物试验，包括A+多重试验，的捕获试剂的选择是为了最小化交叉反应。例如，优选选择这样的抗原决定表位：该抗原的特异性抗体不会与其它抗原产生交叉反应。该抗原决定表位也可以通过本领域已知的方法进行修饰以进一步减少可能产生假阳性的与类似片段的交叉反应。例如，序列分析可以用来确定抗原决定表位中的特定序列，去除与其它基因产物相似的非必需的氨基酸残基。修饰的多肽可以通过本领域已知的方法进行筛选以确保不丧失与对应抗体的结合。相似的，作为捕获试剂的针对抗原的抗体，优选选自这样的抗体：给定的抗体不会特异性结合多于一个的可能存在于给定的测试样品中的抗原，或导致非特异性的结合。其它本领域已知的办法可以用来修饰和优化本发明的A+抗原试验。

用来自124个健康受试者，121个患有BPH的受试者和131个患有组织活检确认的前列腺癌的受试者的血清样品进行进一步的免疫学检测。结果如下：

表3显示了通过本领域传统可用的PSA测试得到的MFI值的平均值，中位值，以及标准偏差。

如表3所示，患者的血清样品被稀释为1/10、1/20和1/50。稀释后的血清样品根据本发明的autoAb+PSA试验进行测量。获得针对每个多肽的MFI并除以对照肽，例如贝塔-半乳糖苷酶的MFI。然后得到每个肽的MFI的相对比率。基于该相对比率，计算平均值，中位值以及SD。“非”癌症类别来自121位BPH/前列腺良性增生患者，而“是”癌症类别来自131位癌症患者。两个类别均被121位健康捐赠者标准化。标准化后的MFI比率被定义为(患者的MFI比率-健康捐赠者的MFI比率的平均值)/(健康捐赠者的MFI比率的标准偏差)。这些数值不意味着表明是否患有癌症，而是用来评价和确保它们有助于最终的autoAb+PSA试验。最终的组合autoAb+PSA指标就是用上述的逻辑回归建立在这些数值基础上的。

表4显示了通过本文描述的自身抗体+PSA试验得到的MFI值的平均值，中位数，以及标准偏差。

表5显示了针对6种抗原决定表位中每种的自身抗体的MFI比率以及标准化后的平均值和标准偏差：

表6比较了每种方法的灵敏度，特异性，准确性以及AUC：

图5显示了平均稀释浓度的ROC曲线，图6显示了最大稀释浓度的ROC曲线。这些表格中的数据可以证实，根据本发明的autoAb+PSA多重试验与单独的PSA相比，显示出了更好的灵敏度，特异性，准确性和AUC值。

因此，基于MAP的A+生物标志物多重试验可以基于来自受试者的血清样品来确定该受试者应该被归类为健康(未患前列腺癌)，患有BPH或者患有前列腺癌。

例如，患者X进行基于MAP的autoAb+PSA多重试验，以检测针对n个PCAA和PSA的自身抗体。来自n个PCAA的MFI比率计算为：MFI₁，MFI₂，MFI₃，...MFI_n。患者X患有前列腺癌的可能性(p)如下计算：Log(p/1-p)＝β0+β₁xMFI₁+β₂×MFI₂+β₃×MFI₃…β_n×MFI_n，其中，n表示PCAA的数量，βn表示n个PCAA中每个PCAA的线性系数，是由给定的人群组(如本文所示的，针对121个BPH/前列腺良性增生患者和131前列腺癌患者)确定或曾经确定的。当p为0.5或者更大值时，患者X则被指定为患有前列腺癌或者可能患有前列腺癌。

应用

本发明的A+生物标志物的试验可用于一系列研究和临床目的。

例如，所述A+生物标志物试验可以用于创建给定人群组(例如，基于年龄，性别，人种，病史，地域，外部因素(例如，用药，酒精以及吸烟习惯，环境污染等)等等的群组)的各种抗体(包括自身抗体)和抗原(A+生物标志物图谱)组合的图谱。这些A+生物标志物图谱可用于进一步促进对于属于给定人群组的给定受试者的给定疾病的给定A+生物标志物试验的诊断能力。

给定人群组的一系列A+生物标志物图谱可以在一段时间内进行采集，在某一事件(例如，药物施用)之前或之后，以得到A+生物标志物图谱的趋势。这些A+生物标志物图谱的趋势可以用于：1)早期发现，2)诊断，3)预后，4)治疗安排，5)对于属于给定人群组的受试者的给定疾病复发的预测。

例如，对于给定的疾病、感染或者紊乱(即，给定的疾病)，受试者的A+生物标志物图谱可以与已经患有该给定疾病的受试者的A+生物标志物图谱(即，疾病图谱)和/或健康的受试者建立的A+生物标志物图谱(即，健康图谱)(或者一个标准化或规范化的A+生物标志物图谱)相比较。如果该受试者的A+生物标志物图谱与疾病图谱相似或者一致，那么该受试者则被诊断为患有该给定的疾病。或者，该受试者则应被指定为或划分为可能患有该给定疾病或具有患有该给定疾病的风险，因此，应当计划和实施下一步的测试、附加测试和/或治疗。因此，本发明的A+生物标志物试验不需要确定的表明受试者具有患有给定疾病的风险或事实上已经患有该给定疾病。相反的，本发明的A+生物标志物试验可以同来验证受试者是否需要进行进一步的测试(例如，用于监测的周期性未来检测，用于证实的组织活检等等)和/或治疗(例如，考虑检测的给定生物标志物来确定一种治疗手段是否优于另外一种，监测治疗是否具有效果，等等)。

尽管本文列举的A+生物标志物试验是与PSA以及前列腺癌相关的，但是本发明的A+生物标志物试验却不仅局限于此。本发明的A+生物标志物试验可以用于其它癌症以及疾病，包括自体免疫疾病和感染性疾病等。

具体地，一些不同的癌症可能会形成特异性结合相同的肿瘤抗原的自身抗体。例如，前列腺癌，肝癌，肺癌，卵巢癌，乳腺癌以及很多上皮癌症都会形成特异性结合NY-ESO-1，XAGE-1b以及SSX-4的自身抗体。因此，本文示例的autoAb+PSA的多重试验很容易通过选择特异性针对TA的抗体而非PSA作为捕获试剂用于样品中TA的检测来进行适当的修饰，以测定除前列腺癌以外的癌症。例如，为了检验乳腺癌和肺癌，特异性识别CEA的抗体可以用作捕获试剂。

另外，捕获试剂组可以包括一系列肿瘤抗原的抗原决定表位以及一系列抗体，所述抗原决定表位被多种癌症共有，所述抗体中的每个特异性结合特异性针对给定癌症的TA，从而提供了普适的A+生物标志物试验，该试验可用于诊断受试者为患有特定类型的癌症和/或排除其它类型的癌症。例如，用于综合的癌症的根据本发明的A+生物标志物试验的捕获试剂组可包括，各种不同的癌症中共同存在的TA的抗原决定表位，以及特异性结合用于前列腺癌的PSA和/或AMACR、用于肺癌和乳腺癌的CEA，用于肝癌的AFP(阿尔法胎蛋白)，用于卵巢癌的CA125，用于各个时期的乳腺癌的Her2/neu和/或CA15-3，用于甲状腺癌的甲状腺球蛋白，用于尿路上皮细胞癌的膀胱肿瘤抗原，用于胰脏癌的CA19.9，用于肺癌的天门冬氨酸(门冬酰)贝塔-脱氢酶(HAAH)的抗体。在一些实施方式中，该捕获试剂组可进一步含有一种或多种的TA抗原决定表位，这些抗原决定表位对于特定类型的癌症是有差别的。

本发明的A+生物标志物试验可以用于确定或指定受试者是否患有给定的感染或者自体免疫疾病。例如，为了检测由病毒X引起的感染，可以检测针对来自病毒X的几个抗原决定表位的抗体，例如，抗原A1，A2，A3，…(可以来自不同的病毒X的亚型，例如，来源于特定地域或特定种族的受试者，可具有更多的针对A2的抗体，或者通过特殊途径而引发的感染会产生更多的针对A5的抗体，等等)。与此同时，已知的生物标志物，B，针对更容易被病毒X感染的患者。这个生物标志物B可以是特定的HLA亚型，X感染的共同受体，细胞因子或者化学因子，等等。最终的指标可以是针对A1，A2，A3，…的抗体+B的组合。组合指标可通过类似本文所述的autoAb+PSA试验获得，从而确定感染的可能性、感染的预后等等。相似地，自体免疫疾病，包括炎症的患病可能性和预后等等也可通过本发明的A+生物标志物试验来确定。

出于理解或完善本发明公开的需要，本发明提及的所有的公开物、专利和专利申请，在此每篇特别地以同样程度独立引入作为参考。

因此，本领域技术人员需要特别注意的是，已描述的本发明的示例性实施方式在公开范围内仅为示例性的，各种其它的改变、调整和修饰应被视为在本发明的保护范围内。因此，本发明并不限于本文所示的具体实施方式，而仅限于随附的权利要求书。

Claims

1.一种试验方法，其特征在于，该方法针对样品中的至少一种抗体以及至少一种第二生物标志物，所述抗体特异性结合第一生物标志物或其抗原决定表位，该方法包括

通过单一反应步骤，使针对所述抗体的第一捕获试剂以及针对所述第二生物标志物的第二捕获试剂共同与所述样品接触；

检测所述抗体的存在与否或数量；以及

检测所述第二生物标志物的存在与否或数量。

2.根据权利要求1所述的试验方法，其中，所述抗体是针对前列腺癌的自身抗体，以及所述第二生物标志物是前列腺特异性抗原；或其中，所述至少一种抗体是多个自身抗体，它们中的每个特异性地结合多个表明前列腺癌的第一生物标志物，而不结合前列腺特异性抗原，以及所述第二生物标志物为前列腺特异性抗原。

3.根据权利要求1或2所述的试验方法，其中，所述第一捕获试剂不同于所述第二生物标志物，且所述第二捕获试剂不同于所述抗体。

4.一种诊断或指定受试者为患有疾病或者可能患有疾病的方法，其特征在于，该方法包括

使用根据权利要求1-3中任意一项所述的试验方法试验来自受试者的样本，和

当所述抗体的存在与否或数量与所述第二生物标志物的存在与否或数量表明疾病，则诊断或指定该受试者为患有该疾病或可能患有该疾病。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述疾病为癌症，所述第一生物标志物为第一肿瘤标志物，所述第二生物标志物为第二肿瘤标志物。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述第一肿瘤标志物为肿瘤抗原、所述第二肿瘤标志物为肿瘤抗原、或者二者均为肿瘤抗原。

7.根据权利要求4-6中任意一项所述的方法，其中，所述抗体的存在与否或数量被设定为第一值，所述第二生物标志物的存在与否或数量被设定为第二值，所述第一值和所述第二值相结合以得到指标值，以及所述方法还包括

使用该指标值以诊断或指定该受试者为患有该疾病或可能患有该疾病。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述第一值可以为基于其在患有该疾病的受试者中的普遍性的加权值、所述第二值可以为基于试验的数量的加权值、或者二者均为加权值。

9.根据权利要求5-8中任意一项所述的方法，其中，所述癌症为前列腺癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、甲状腺癌、尿路上皮细胞癌、以及包括本领域已知的其它上皮癌等等。

10.根据权利要求5-9中任意一项所述的方法，其中，至少一种所述第一肿瘤抗原和至少一种所述第二肿瘤抗原为前列腺癌相关抗原，或者所述第一肿瘤抗原和所述第二肿瘤抗原均为前列腺癌相关抗原。

11.根据权利要求1-10中任意一项所述的方法，其中，所述抗原决定表位选自由以下物质组成的组：AMACR：341-371；p90：796-827；LEDGFp75：313-345；HIP-1：150-180；HIP-1：338-375；SSX2，4：110-139；NY-ESO-1：1-40；XAGE-1b：1-25以及XAGE-1b：57-87。

12.根据权利要求1-11中任意一项所述的方法，其中，所述第二标志物为前列腺特异性抗原(PSA)。

13.根据权利要求7-12中任意一项所述的方法，其中，所述第一值设定为0，表示不存在所述抗体，以及被设定为1，表示存在所述抗体；所述第二值被设定为0，表示正常数量的所述第二生物标志物，被设定为1，表示非正常的高数量的所述第二生物标志物，或者被设定为0-1之间的数值，表示正常数量和非正常的高数量之间的所述第二生物标志物。

14.根据权利要求7-13中任意一项所述的方法，其中，当所述指标值超过给定的截止值，则该受试者被诊断或指定为患有该疾病或可能患有该疾病。

15.一种诊断或指定受试者为患有或可能患有前列腺癌的方法，其特征在于，该方法包括

测定来自所述受试者的样品中，自身抗体的存在与否或数量，所述自身抗体特异性结合前列腺癌相关抗原或其抗原决定表位，以及测定前列腺特异性抗原的存在与否或数量，其中，所述前列腺癌相关抗原并非前列腺特异性抗原，以及

当所述自身抗体的存在与否或数量与前列腺特异性抗原的存在与否或数量表明前列腺癌，则诊断或指定该受试者为患有或可能患有前列腺癌。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，试验该样品在单一反应步骤中进行，通过该步骤，针对所述自身抗体的第一捕获试剂和针对前列腺特异性抗原的第二捕获试剂共同与所述样品接触。