CN102321695A

CN102321695A - 一种制备d-丝氨酸的化学-酶法

Info

Publication number: CN102321695A
Application number: CN201110292205A
Authority: CN
Inventors: 夏仕文; 方国兰
Original assignee: Chongqing University of Post and Telecommunications
Current assignee: Chongqing University of Post and Telecommunications
Priority date: 2011-09-29
Filing date: 2011-09-29
Publication date: 2012-01-18

Abstract

本发明提供一种制备D-丝氨酸的化学-酶法。该方法以DL-丝氨酸为原料，利用酰化剂衍生为DL-N-苯乙酰丝氨酸。以固定化青霉素酰化酶为生物催化剂，在水介质中对映选择性催化DL-N-苯乙酰丝氨酸水解为L-丝氨酸、苯乙酸和D-N-苯乙酰丝氨酸。利用金属络合、等电点结晶的方法，分离得到光学纯D-苯乙酰丝氨酸。D-N-苯乙酰丝氨酸经酸解、浓缩、结晶可得D-丝氨酸。D-丝氨酸收率为45%，ee99.6%。本发明提出的方法具有收率、化学纯度和光学纯度高，环境友好的特点，适合D-丝氨酸的规模化生产。

Description

一种制备D-丝氨酸的化学-酶法

技术领域

本发明涉及一种制备D-丝氨酸的化学-酶法，属于生物催化水解制备手性药物中间体技术领域。

背景技术

D-丝氨酸是一种内源性脑信息协传物质，可用于预防或治疗脑缺血或缺氧所致脑损伤。D-丝氨酸也是一些手性药物如环丝氨酸、拉科酰胺等的重要中间体。环丝氨酸(Cycloserine)亦称氧霉素，是从链霉菌代谢物中发现的一种广谱抗生素，对结核病、非结核性呼吸道感染、中耳炎、腹泻等均有一定的疗效，临床上主要用于抗结核杆菌，特别是对链霉菌产生耐药性的结核杆菌。环丝氨酸不仅作为抗结核病的二线药物应用于临床，而且也是合成非经典β-内酰胺抗生素Lactivicin的重要中间体。拉科酰胺（Lacosamide）系比利时UCB 公司开发的新型N-甲基-D-门冬氨酸受体甘氨酸结合位点拮抗剂，于2008 年8月和10月先后在欧盟和美国批准上市。拉科酰胺系新型功能性氨基酸类抗惊厥药物，具有双重抗惊厥作用，可选择性促进钠离子通道缓慢失活，并调控塌陷反应介导蛋白-2，从而延缓甚至阻止癫痫发作以及减轻糖尿病神经性疼痛。临床研究表明，拉科酰胺与其它抗惊厥药相比耐受性好，且不良反应（如嗜睡及认知和行为障碍）更轻。

D-丝氨酸的制备方法主要有物理拆分法、化学拆分法、生物拆分法和不对称转换法。

1）物理拆分法。Seung-Hee Son等（J. Appl. Poly. Sci., 2007, 104）采用界面聚合技术制备分子印迹膜，该膜能选择性透过D-丝氨酸，拆分DL-丝氨酸时，由于D-丝氨酸的扩散速度快于L-对映体，复合膜中D-丝氨酸ee80%。马云峰等（CN1900052）采用诱导结晶法制备L-丝氨酸和D-丝氨酸，收率96%以上。显然，由于物理拆分法选择性差，制备的D-丝氨酸光学纯度不能满足质量要求。

2）化学拆分法。吴刘洋等（氨基酸与生物资源，2007，2）以DL-丝氨酸为原料，经甲酯化后与L-2, 3-二苯甲酰酒石酸形成D-丝氨酸甲酯·L-2, 3-二苯甲酰酒石酸盐，经水解制备D-丝氨酸，收率48.8%。

3）生物拆分法。生物拆分制备D-丝氨酸的方法主要包括酰化酶法、脱氨酶法、合成酶法、海因酶法等。朱延新等（CN1834257）以乙酰甘氨酸为原料，与甲醛反应制备DL-N-乙酰丝氨酸，然后采用酰化酶或蛋白酶拆分得到D-丝氨酸。焦庆才等（CN101659978）以DL-2-氨基-3-烷氧基丙酸为原料，经乙酰化得到DL-N-乙酰-2-氨基-3-烷氧基丙酸，然后采用氨基酰化酶拆分制备D-丝氨酸。池田创等（CN1280424）利用高活性的丝氨酸脱氨酶重组菌株，降解DL-丝氨酸中的L-对映体制备D-丝氨酸。安乐城正等（CN101040047）利用具有D-丝氨酸合成酶活性的基因工程菌，以甲醛和甘氨酸为原料制备D-丝氨酸。庞敏等（食品与发酵工业，2008，10）以吲哚和DL-丝氨酸为原料，利用大肠杆菌色氨酸酶制备L-色氨酸和D-丝氨酸。日本专利（JP61152291）公开了通过微生物作用由DL-羟甲基乙内酰脲形成N-氨甲基-D-丝氨酸，然后水解制备D-丝氨酸的方法。此外，日本专利（JP591895）公开了利用酪氨酸酶催化DL-丝氨酸和苯酚反应，制备L-酪氨酸和D-丝氨酸的方法。

4）不对称转换法。廖本仁等（CN101735085）公开了一种不对称转换制备D-丝氨酸的方法。DL-丝氨酸甲酯在消旋剂2-醛基吡啶存在下，与L-二苯甲酰酒石酸（L-DBTA）形成D-丝氨酸甲酯·L-DBTA二盐，L-丝氨酸甲酯·L-DBTA二盐同时实现消旋化，D-丝氨酸收率78-88%，化学纯度和光学纯度均大于99%。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的制备D-丝氨酸的化学-酶法。利用具有高度对映选择性的固定化青霉素酰化酶，拆分DL-N-苯乙酰丝氨酸为L-丝氨酸、苯乙酸和D-N-苯乙酰丝氨酸，D-N-苯乙酰丝氨酸酸解为苯乙酸和D-丝氨酸。技术路线如下：

本发明目的的实现包括下列步骤：

（1）DL-N-苯乙酰丝氨酸制备：在0～10℃和pH8-12的条件下，将摩尔比为1：1～3的DL-丝氨酸与酰化剂搅拌反应6～24h，反应完成后用盐酸调pH1～2，析出DL-N-苯乙酰丝氨酸固体；

（2）DL-N-苯乙酰丝氨酸酶催化水解：在20～40℃和pH8～10条件下， 0.1～0.5mol/L DL-N-苯乙酰丝氨酸在固定化青霉素酰化酶催化下水解8～32h，固定化酰化酶与DL-N-苯乙酰丝氨酸的质量比为1：3～10，反应完成后，抽滤，除去固定化青霉素酰化酶。滤液中加入硫酸铜，抽滤，除去L-丝氨酸铜络合物。滤液用浓盐酸调pH1～2，抽滤，固体用冷水洗涤，得D-N-苯乙酰丝氨酸。

（3）D-丝氨酸制备：D-N-苯乙酰丝氨酸溶于3～8mol/L的盐酸中，在90～120℃下水解4～15小时，水解液用活性炭脱色，脱色液浓缩至水解液体积的1/5～1/10，用与浓缩液等体积的乙酸乙酯萃取苯乙酸三次，水相调pH5.8，0～5℃下，静置过夜，过滤后滤饼用少量去离子水洗涤，烘干得到D-丝氨酸。

步骤（1）中DL-丝氨酸衍生为DL-N-苯乙酰丝氨酸的酰化剂为苯乙酸、苯乙酸甲酯、苯乙酰氯或苯乙酰溴。

步骤（2）中L-丝氨酸和D-N-苯乙酰丝氨酸的分离采用金属络合的方式分离。

本发明的有益效果

与现有技术相比，本发明提出的方法具有以下优点：1）酶反应产物L-丝氨酸、苯乙酸和D-N-苯乙酰丝氨酸共存时，通过调pH的方法，D-N-苯乙酰丝氨酸很难析出。采用金属络合使L-丝氨酸通过形成金属络合物的方式，可以使L-丝氨酸和D-N-苯乙酰丝氨酸得到有效分离；2）采用固定化青霉素酰化酶，不仅保证了D-丝氨酸的高光学活性，而且酶的来源易得，可循环使用，大大降低了过程成本。

具体实施方式

以下是以固定化青霉素酰化酶为生物催化剂，通过对映选择性水解制备D-丝氨酸的实施例，但本发明并不限于所列出的几个实例。

实施例1：DL-N-苯乙酰丝氨酸制备

将DL-丝氨酸42g（0.4mol），NaOH 40g（1.0mol）溶于400ml水中，然后在冰浴条件下冷却到0℃，滴加苯乙酰氯64ml（0.48 mol）。控制滴加速度，反应液温度不超过5℃。滴加完毕之后，继续搅拌反应12h。将反应液调至pH为1～2左右，抽滤，固体用水洗涤2次，干燥得DL-N-苯乙酰丝氨酸86g，收率为96.4%。

实施例2：DL-N-苯乙酰丝氨酸酶催化水解

将66.9g（0.3mol）DL-N-苯乙酰丝氨酸加入600ml水中，用氨水调pH8.0，至完全溶解后，加入13g固定化青霉素酰化酶，室温下搅拌反应28h。反应完成后，抽滤除去固定化青霉素酰化酶。滤液中加入CuSO₄·5H₂O 18.8g，抽滤，除去L-丝氨酸铜络合物。滤液用浓盐酸调pH1～2，抽滤，固体用冷水洗涤，烘干得D-N-苯乙酰丝氨酸32g，收率47.8%。

实施例3：D-丝氨酸制备

将32g D-N-苯乙酰丝氨酸加入200ml 6mol/L盐酸中，在100°C下酸解8h，加入10g活性炭脱色。脱色液浓缩至40 ml，乙酸乙酯（40ml×3）萃取三次，水层用氨水调pH至5.8，0～5℃下，静置过夜，过滤后滤饼用少量去离子水洗涤，烘干得到D-丝氨酸13.6g，收率为90%，采用HPLC法测得ee为99.6%。

Claims

1.一种制备D-丝氨酸的化学-酶法，其特征是包括以下步骤：

（1）DL-N-苯乙酰丝氨酸制备：在0～10℃和pH8～12的条件下，将摩尔比为1：1～3的DL-丝氨酸与酰化剂搅拌反应6-24h，反应完成后用盐酸调pH1～2，析出DL-N-苯乙酰丝氨酸固体；

（2）DL-N-苯乙酰丝氨酸酶催化水解：在20～40℃和pH8～10条件下， 0.1～0.5mol/L DL-N-苯乙酰丝氨酸在固定化青霉素酰化酶催化下水解8-32h，固定化酰化酶与DL-N-苯乙酰丝氨酸的质量比为1：3～10，反应完成后，抽滤，除去固定化青霉素酰化酶,滤液中加入硫酸铜，抽滤，除去L-丝氨酸铜络合物,滤液用浓盐酸调pH1～2，抽滤，固体用冷水洗涤，得D-N-苯乙酰丝氨酸;

（3）D-丝氨酸制备：D-N-苯乙酰丝氨酸溶于3～8mol/L的盐酸中，在90～120℃下水解4～15小时，水解液用活性炭脱色，脱色液浓缩至水解液体积的1/5～1/10，用与所得浓缩液等体积的乙酸乙酯萃取苯乙酸三次，水相调pH5.8，0～5℃下，静置过夜，过滤后滤饼用少量去离子水洗涤，烘干得到D-丝氨酸。

2.根据权利要求1所述的DL-N-苯乙酰丝氨酸的制备方法，其特征是步骤（1）中DL-丝氨酸衍生为DL-N-苯乙酰丝氨酸的酰化剂为苯乙酸、苯乙酸甲酯、苯乙酰氯或苯乙酰溴。

3.根据权利要求1所述的D-丝氨酸制备方法，其特征是步骤（2）中L-丝氨酸和D-N-苯乙酰丝氨酸的分离采用金属络合的方式分离。