CN102319241B - 一种针对ccl18靶标的化合物在制备抗乳腺癌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种针对CCL18靶标的化合物在制备抗乳腺癌药物中的应用，该化合物为带保护基团的甘氨酸酯，能作为针对CCL18靶标的抗乳腺癌药物。该化合物的结构式如式I所示。本发明还提供了一种抗乳腺癌的药物，所述药物含有有效量的结构式如式I所示的化合物。本发明提供了如式I所示的带保护基团的甘氨酸酯化合物针对CCL18靶标，在制备抗乳腺癌药物中的应用，为治疗乳腺癌提供了一种新的药物。
Description
技术领域
本发明涉及一种针对CCL18靶标的化合物在制备抗乳腺癌药物中的应用，具体是一种带保护基团的甘氨酸酯作为针对CCL18靶标的抗乳腺癌药物的应用。
背景技术
在肿瘤微环境中存在多种与转移相关的基质细胞，大量临床研究证明肿瘤相关巨噬细胞(TAM)具有促进包括乳腺癌在内的多种肿瘤浸润迁移的作用。大量的研究证明TAM通过分泌趋化因子、炎症因子、生长因子促进乳腺癌浸润和转移。但目前研究的促进肿瘤进展的细胞因子，如EGF、VEGF、MMP7/9，不但来源于TAM，而且来源于肿瘤细胞或其他的基质细胞，还没有研究报道只来源于TAM促进肿瘤转移的细胞因子。
趋化因子是一类具有细胞趋化作用的细胞因子，在乳腺癌、肺癌、结肠癌、肝癌、宫颈癌、前列腺癌等一系列肿瘤的进展中起关键的作用(chemokinreceptors9-12)。在肿瘤的微环境中，来源于基质细胞的趋化因子募集不同类型的免疫细胞，如：TAMs，TANs，淋巴细胞，CAFs，MSCs和内皮细胞，调节局部的免疫反应。这些浸润到肿瘤微环境中的细胞是趋化因子的来源，可以影响肿瘤的生长、细胞生存、血管生成和转移。许多研究证明多种实体瘤细胞高表达趋化因子的受体(chemokinreceptors11-13)，表达趋化因子受体的肿瘤细胞很容易转移到表达相应趋化因子的器官。比如CXCR4的配体CXCL12在肺、肝和淋巴结高表达，这些部位出现表达CXCR4的转移瘤几率增高。单纯用趋化因子的趋化作用去解释肿瘤细胞远距离的迁移过程是不够的。
CCL18是一种由M2巨噬细胞特异性分泌的CC型趋化因子，在Goucher病、类风湿性关节炎等慢性炎症性疾病中M2巨噬细胞高表达CCL18。CCL18在组织纤维化、促进淋巴细胞、树突状细胞和单核细胞趋化过程中发挥重要的作用。我们前期研究证明TAM来源的CCL18在乳腺癌细胞上的功能性受体是PITPNM3，CCL18通过PITPNM3激活乳腺癌细胞Pyk2/FAK/Src，促进整合素聚集，促进乳腺癌细胞粘附于细胞外基质，从而促进乳腺癌浸润、迁移。
远处转移是乳腺癌病人死亡的主要原因，阐明乳腺癌转移的关键调控靶点并针对关键靶点开发新药具有巨大的应用前景。目前的肿瘤靶向治疗药物主要是靶向肿瘤细胞，但深入的基础研究表明肿瘤微环境对肿瘤的进展起关键的作用，靶向肿瘤微环境的靶向药物很少；由于肿瘤生物学特性的多变性，很多靶向肿瘤细胞的药物容易产生抗药性，已有的研究证明肿瘤微环境对靶向药物抗性的产生起关键的作用。目前还没有靶向肿瘤微环境中的细胞或趋化因子的靶向治疗药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种针对CCL18靶标的化合物在制备抗乳腺癌药物中的应用，该化合物为带保护基团的甘氨酸酯，能作为针对CCL18靶标的抗乳腺癌药物。
本发明的具体技术方案如下：
本发明的一种针对CCL18靶标的化合物能应用于制备抗乳腺癌药物中，所述化合物的结构式如式I所示：
上述化合物为带保护基团的甘氨酸酯。
本发明还提供了一种抗乳腺癌的药物，所述药物含有有效量的结构式如式I所示的化合物：
所述化合物是带保护基团的甘氨酸酯。
所述药物为片剂、丸剂、胶囊、注射剂、悬浮剂或乳剂。
本发明提供了如式I所示的带保护基团的甘氨酸酯化合物针对CCL18靶标，在制备抗乳腺癌药物中的应用，为治疗乳腺癌提供了一种新的药物。
附图说明
图1是在本实验室纯化的CCL18的SDS-PAGE，条带1为分子重量marker；条带2-7为CCL18蛋白；
图2是在化合物库中筛选得到的具有活性的化合物，包括带保护基团的甘氨酸酯在CCL18结合位点重叠；
图3是带保护基团的甘氨酸酯与CCL18蛋白的荧光色谱滴定变化图。
图4是带保护基团的甘氨酸酯在MDA-MB-231细胞上的细胞毒性测试的实验结果图；
图5是带保护基团的甘氨酸酯对CCL18诱导的MDA-MB-231细胞迁移的抑制作用的实验结果图；
图6是带保护基团的甘氨酸酯对CCL18诱导的MCF-7细胞迁移的抑制作用的实验结果图；
图7是带保护基团的甘氨酸酯对CCL18诱导的T淋巴细胞迁移的抑制作用的实验结果图；
图8是带保护基团的甘氨酸酯对CCL18诱导的MDA-MB-231细胞粘附的抑制作用的实验结果图；
图9是带保护基团的甘氨酸酯对CCL18诱导的MDA-MB-231细胞侵袭的抑制作用的实验结果图；
图10是带保护基团的甘氨酸酯对CCL18诱导的MDA-MB-231细胞迁移的抑制作用的IC50值的实验结果图；；A为各种浓度带保护基团的甘氨酸酯对细胞迁移抑制作用的代表性图片；B为各种浓度带保护基团的甘氨酸酯对细胞迁移抑制作用的柱形图；C为带保护基团的甘氨酸酯对CCL18诱导的细胞迁移的抑制率曲线。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
实施例1：纯化的CCL18的SDS-PAGE实验
CCL18基因编码89个氨基酸序列，氨基端的20个氨基酸残基被切除后，成熟的蛋白质包含69个氨基酸。人CCL18蛋白可包含69个氨基酸，也有68个氨基酸的形式(羧基端丢失丙氨酸)。在前期工作中，我们已克隆、表达、和纯化了成熟的人的CCL18，其SDS-PAGE如图1所示，其中，条带1为分子重量marker；条带2-7为CCL18蛋白。CCL18也可商品化购买得到，选自PeproTech96-300-34-100ugRecombinantHumanMIP-4(CCL18)。
实施例2：采用电脑模拟分子对接的方法从已有的小分子库中筛选抑制剂
随后用homologymodeling方法建立了人的CCL18的三维空间结构，采取电脑模拟分子对接的方法从已有的小分子库中筛选抑制剂。对分值较高的分子，进一步用电脑观察其与CCL18中氨基酸的作用情况，特别是氢键、正负电荷间作用、л-лstacking、和疏水基团间作用的情况。再选取有活性的多个小分子在结合位点中重叠，建立药效团(pharmacophore)，再以此药效团为基础进行电脑对接，得到一系列类似物。在初步筛选中，我们得到15个分值较高的化合物，有活性的多个小分子在结合位点中重叠电脑对接如图2所示。图2是在化合物库中筛选得到的具有活性的化合物，包括带保护基团的甘氨酸酯在CCL18结合位点重叠。
实施例3：带保护基团的甘氨酸酯与蛋白的相互作用实验
进一步通过荧光色谱、ITC(等温滴定量热)、CD(圆二色谱)、SPR(表面等离子共振)等方法研究了带保护基团的甘氨酸酯与蛋白的相互作用。SPR方法测得带保护基团的甘氨酸酯与CCL18的结合常数在几百纳摩尔范围内。CCL18的蛋白序列中有多个有荧光基团侧链的氨基酸(包括W＝Tryptophan色氨酸，Y＝Tyrosine酪氨酸)，其中有多个在CCL18与化合物的结合位点，因此通过荧光光谱可比较CCL18在结合化合物前后的构象变化。带保护基团的甘氨酸酯与CCL18蛋白的荧光色谱滴定变化如图3所示。以上实验表明带保护基团的甘氨酸酯确实与CCL18有相互作用。
实施例4：带保护基团的甘氨酸酯的细胞毒性测试
对带保护基团的甘氨酸酯进行细胞毒性测试，化合物从10-7mol/L到10-4mol/L作用于乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞48小时，结果如图4所示。图4是带保护基团的甘氨酸酯在MDA-MB-231细胞上的细胞毒性测试的实验结果图；由图可见，在这个浓度范围内对细胞活性没有影响。
实施例5：带保护基团的甘氨酸酯对细胞迁移的作用
24孔的Boydenchambers用来检测肿瘤细胞的迁移情况，小室下层加入CCL18以及10μmol/L的小分子化合物，小室夹层加入1×105个细胞，37℃，5％CO2培养箱中孵育5个小时候检测细胞的迁移情况。并进一步在高转移乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞和低转移细胞株MCF-7细胞以及T淋巴细胞上进行验证，结果如图5-7所示，图5是带保护基团的甘氨酸酯对CCL18诱导的MDA-MB-231细胞迁移的抑制作用的实验结果图；图6是带保护基团的甘氨酸酯对CCL18诱导的MCF-7细胞迁移的抑制作用的实验结果图；图7是带保护基团的甘氨酸酯对CCL18诱导的T淋巴细胞迁移的抑制作用的实验结果图；结果发现带保护基团的甘氨酸酯有较强的抑制细胞迁移的作用。
实施例6：带保护基团的甘氨酸酯对细胞粘附的作用
粘附到细胞外基质是肿瘤细胞发生远处转移的必要步骤，我们前期的实验证明CCL18能促进肿瘤细胞粘附到FN基质，因此在我们的研究基础部分应用小分子化合物拮抗CCL18的作用，观察肿瘤细胞的粘附情况，结果如图8所示。图8是带保护基团的甘氨酸酯对CCL18诱导的MDA-MB-231细胞粘附的抑制作用的实验结果图；由该图可见，带保护基团的甘氨酸酯可以完全抑制CCL18诱导的肿瘤细胞的粘附作用。
实施例7：带保护基团的甘氨酸酯对细胞侵袭的作用
肿瘤细胞只有突破基底膜才能发生远处转移，我们前期实验发现CCL18可以促进乳腺肿瘤细胞突破matriggel转移到transwell小室的底部，因此我们也检测带保护基团的甘氨酸酯对细胞侵袭的影响，结果如图9所示。图9是带保护基团的甘氨酸酯对CCL18诱导的MDA-MB-231细胞侵袭的抑制作用的实验结果图；由该图可见，其可以完全抑制CCL18诱导的MDA-MB-231细胞的侵袭作用。
实施例8：带保护基团的甘氨酸酯对CCL18诱导的MDA-MB-231细胞迁移抑制作用的IC50值检测
应用带保护基团的甘氨酸酯从10-10mol/L到10-3mol/L检测其对100ng/mlCCL18诱导的细胞迁移的作用，小分子化合物同CCL18加到transwell小室的下层，1*105的细胞种在上室中，37℃，5％CO2培养箱中孵育5个小时检测细胞的迁移情况。结果见图10，图10是带保护基团的甘氨酸酯对CCL18诱导的MDA-MB-231细胞迁移的抑制作用的IC50值的实验结果图；A为各种浓度带保护基团的甘氨酸酯对细胞迁移抑制作用的代表性图片；B为各种浓度带保护基团的甘氨酸酯对细胞迁移抑制作用的柱形图；C为带保护基团的甘氨酸酯对CCL18诱导的细胞迁移的抑制率曲线。结果表明IC50值在10-7mol/L。
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1.一种针对CCL18靶标的化合物在制备抗乳腺癌药物中的应用，所述化合物的结构式如式I所示：
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