CN102304170B

CN102304170B - 一种角类多肽、其分离方法及抗氧化用途

Info

Publication number: CN102304170B
Application number: CN 201110278430
Authority: CN
Inventors: 刘睿; 段金廒; 钱大玮; 唐于平; 郭建明
Original assignee: Nanjing University of Chinese Medicine
Current assignee: Nanjing University of Chinese Medicine
Priority date: 2009-10-26
Filing date: 2009-10-26
Publication date: 2013-01-30
Anticipated expiration: 2029-10-26
Also published as: CN102304170A

Abstract

本发明涉及药物技术领域，具备涉及一种角类多肽、其分离方法及用途。本发明的角类多肽具有下列序列结构：Tyr-Glu-Asp-Cys-Thr-Asp-Cys-Gly-Asn。本发明的多肽提取分离自水牛角，药理试验证明，本发明的多肽具有良好的抗氧化活性。

Description

一种角类多肽、其分离方法及抗氧化用途

技术领域

本发明涉及药物技术领域，具备涉及一类具有抗氧化活性的角类多肽、其分离方法及用途。本申请为200910233784.1的分案申请。

背景技术

角类动物药材是祖国医学宝库的重要组成部分，其功效确切，作用特点突出。中国现已知最早的本草著作《神农本草经》中就已经记载了犀角(Cornu Rhinoceri Asiatici)和羚羊角(Cornu Saigae Tataricae)的性味与功效，而后汉代《名医别录》中出现了关于水牛角(CornuBubali)性味与功效的记载。千百年来，犀(广)角、羚羊角、水牛角等角类药材一直是中医临床不可或缺的要药，主要用于治疗热证。然而，目前法律已经明令禁止使用及交易犀角及其制品，赛加羚羊作为濒危物种，其角的使用也受到限制，只有水牛角因取材广泛，价格低廉，疗效确切而被沿用至今。从20世纪60年代起，科研人员就开始对多种角类药材进行比较研究与评价，结果认为水牛角在氨基酸组成、宏微量元素组成、药理药效作用等方面与犀角相似且功效确切，因此目前中医普遍采用水牛角及水牛角浓缩粉代用犀(广)角用作医药工业和临床调剂，取得良好的效果，以缓解中医临床千年来对于犀(广)角使用的依赖性。

水牛角Cornu Bubali为牛科动物Bubalus bubalis Linnaeus的双角，为2005版《中华人民共和国药典》收载品种，性味苦，寒，归心，肝经。水牛角主要含有角蛋白、多肽、氨基酸、胆固醇等物质，具清热解毒、凉血、定惊等功效，中医临床以直接煎汤或入方剂煎汤服用，主要用于治疗温病高热，神昏谵语，发斑发疹，吐血衄血，惊风，癫狂等证。

虽然犀(广)角、羚羊角、水牛角等角类药材应用历史逾千年，但因药材来源部位、材质、组成成分等特殊性，其效应物质基础与作用机制的研究还较为薄弱，关于其活性成分的报道几乎为零。因此，如何充分利用现代生物技术手段，从角类药材中分离纯化活性多肽并进行结构鉴定，深入开展研究角类药材效应物质基础与作用机制研究，是该领域科研技术人员多年来努力寻求突破的研究方向之一。

发明内容

本发明采用现代生化技术手段，对水牛角中具有抗氧化活性多肽成分进行跟踪，进行逐步的分离、纯化，并对此活性组分的结构进行分析鉴定。

本发明公开了下列3种结构式的多肽：

Gln-Tyr-Asp-Gln-Gly-Val(I)；

Tyr-Glu-Asp-Cys-Thr-Asp-Cys-Gly-Asn(II)；

Ala-Ala-Asp-Asn-Ala-Asn-Glu-Leu-Phe-Pro-Pro-Asn(III)。

它们均分离自水牛角，也可人工合成。

从水牛角分离的方法包括：

a、取水牛角粉，用纯水加热回流提取，滤过，滤液浓缩冷冻干燥，得粗提物；

b、对粗提物进行凝胶柱层析分离，在254nm下检测流出样品，根据检测器的样品峰收集每个组分，测定抗氧化活性；

c、将最高抗氧化活性的组分进一步利用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱分离纯化，离子交换柱先用50mM磷酸盐缓冲液(PBS)pH6.5，以1ml/min流速预处理3h；上样后，离子交换柱用50mM PBS pH6.5，以1ml/min流速洗脱2h，然后以线性梯度为0-0.3M NaCl的PBS缓冲液50mM，pH6.5洗脱，洗脱曲线在254nm下检测；根据洗脱峰收集每个组分，冷冻干燥；

d、将c得到的冻干粉，纯水溶解成较高浓度，通过Waters 2545-2489-2676自动纯化HPLC系统进行脱盐，测定抗氧化活性，得到较好抗氧化活性组分D2和D3；

e、将组分D2和D3，再通过Waters 2545-2489-2676自动纯化HPLC系统进一步分离纯化；以线性梯度为2％-60％甲醇洗脱，其中含0.1％三氟乙酸，在230nm下检测；D2组分反相HPLC层析分离时，收集保留时间约为4.6min和7.3min的两个色谱峰，分别为多肽I和II；D3组分反相HPLC层析分离时，收集保留时间约为5.4min的色谱峰，为多肽III；收集得到的样品，减压浓缩除去甲醇后，冷冻干燥；分别得到多肽I，II和III的冻干粉。

上述分离纯化方法纯化的活性多肽I、II、III的分子量分别为708.090Da，1018.296Da和1271.379Da。结构式：

Gln-Tyr-Asp-Gln-Gly-Val(I)；

Tyr-Glu-Asp-Cys-Thr-Asp-Cys-Gly-Asn(II)；

Ala-Ala-Asp-Asn-Ala-Asn-Glu-Leu-Phe-Pro-Pro-Asn(III)。

将3个多肽溶于细胞培养液中，经过稀释分别配成0.5μM，5μM和50μM溶液，与大鼠脑微血管内皮细胞(rCMECs)预孵12h后，去除含多肽的细胞培养液，用PBS洗两遍，加入含有500μM H₂O₂的细胞培养液，共孵2h后，进行MTT实验，同时吸出细胞上清液用于测定LDH含量。结果表明，3个多肽在5μM和50μM浓度时，能够增加rCMECs细胞存活率，减少上清LDH释放量，对H₂O₂所致rCMECs损伤均有保护作用。其中以多肽III的抗氧化活最佳，明显优于多肽I和多肽II，能够显著提高细胞存活率，并减少LDH的释放。结果见图1和图2。

本发明对水牛角中具有抗氧化活性的多肽成分进行跟踪，进行逐步分离、纯化，并对纯多肽进行氨基酸序列分析，获得3个具有抗氧化活性的角类多肽。本发明工艺简单，应用范围广，为其它角类药材物质基础研究，活性成分的分离纯化提供思路与方法。

3个活性多肽的特点是具有良好的抗氧化活性，对H₂O₂所致的rCMECs过氧化损伤具有保护作用，体现了抗氧化活性；3个活性多肽分子量特点都低于2kDa，分子量越小的多肽越易于穿过机体半透膜到达作用部位；氨基酸组成特点是都含有疏水性氨基酸和质子供体氨基酸，疏水性氨基酸残基能够促进多肽与生物系统内脂质的结合，质子供体氨基酸能够提供质子参与氧化还原反应，因此3个活性多肽的脂溶性较好，并具有良好的抗氧化活性。本发明分离得到的多肽分子量小，活性突出，氨基酸序列明确，为进一步人工合成活性多肽提供了必要的基础，为今后开发利用角类抗氧化活性多肽进行药品、保健品等产品研究开发奠定了基础。

本发明的活性多肽可以和药学上可接受的载体混合制成各种剂型，也可以和食品添加剂混合制成保健食品。本发明的多肽还可以和药用盐形成药学上可接受的盐的形式存在。

附图说明

图1为纯化多肽I、II和III抗rCMECs氧化损伤MTT实验示意图。

图2为纯化多肽I、II和III抗rCMECs氧化损伤LDH释放实验示意图。

图3为Sephadex G-25凝胶柱层析分离水牛角提取物中活性多肽的层析示意图。

图4为DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析分离活性组分G3的层析示意图。

图5为Waters自动纯化HPLC系统纯化活性成分D2的层析示意图。

图6为Waters自动纯化HPLC系统纯化活性成分D3的层析示意图。

图7为纯化多肽I的串联质谱及氨基酸序列从头计算示意图。

图8为纯化多肽II的串联质谱及氨基酸序列从头计算示意图。

图9为纯化多肽III的串联质谱及氨基酸序列从头计算示意图。

具体实施方式

实施例1

(1)水牛角提取物的制备：

取水牛角粉500g，与5000ml纯水混合，加热微沸回流提取两次，每次8小时，煎煮结束后合并滤液，滤过，滤液在50℃减压旋转蒸发浓缩至适量后进行冷冻干燥，可得粗提物冻干粉，用于后面不同组分的分离及各组分抗氧化活性评价实验。

(2)对粗提物的凝胶柱层析分离：

将步骤(1)制得的粗提物与纯水混合，在4℃下充分搅拌，4℃下12000rpm后离心20min，收集上清液，采用滴定管将样品小心加到Sephadex G-25柱2.0×100cm顶端。用纯水进行洗脱，流速为0.15ml/min，检测波长为254nm，自动分部收集器收集洗脱液样品，每2ml收集1管。经G-25凝胶柱层析后共获得G1，G2，G3和G4四个组分，其层析示意图见图3。收集这四个组分，冷冻干燥后，进行细胞实验，以噻唑蓝(MTT)实验和乳酸脱氢酶(LDH)释放实验为指标，观察四个组分对H₂O₂所致rCMEC损伤的保护作用，评价其抗氧化活性。结果表明，G3具有最高的抗氧化损伤活性，进行进一步的阴离子交换层析。

(3)对分离组分的阴离子交换柱层析分离：

经过步骤(2)的分离得到的活性组分先用适量50mM PBS pH6.5缓冲液溶解，上样到DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱2.0×20cm，离子交换柱事先用50mM PBS pH6.5缓冲液充分平衡。上样后，用50mM PBS pH6.5以1ml/min流速洗涤，待出现穿透峰D1后，采用线性梯度为0-0.3M NaCl的50mM PBS pH6.5缓冲液洗脱，出现D2和D3两个组分，其层析示意图见图4。收集这三个组分冷冻干燥，冻干粉用少量蒸馏水溶解后，通过Waters2545-2489-2676自动纯化HPLC系统进行脱盐，分离柱为SunFire C₁₈反相柱，19mm×50mm；进样后，先采用2％甲醇洗脱2min，后用60％甲醇洗脱10min，收集60％甲醇洗脱液，减压旋转蒸发浓缩除去甲醇后，冷冻干燥；冻干粉进行细胞实验，以MTT实验和LDH释放实验为指标，观察三个组分对H₂O₂所致rCMEC损伤的保护作用，评价其抗氧化活性。结果表明，D2和D3均具有良好的抗氧化损伤活性，进一步通过反相HPLC进行纯化。

(4)反相HPLC层析纯化：

经阴离子交换柱层析分离后获得的具有较好抗氧化活性组分，再通过Waters2545-2489-2676自动纯化HPLC系统进一步分离纯化；以线性梯度为2％-60％甲醇洗脱，其中含0.1％三氟乙酸(TFA)，在230nm下检测；D2组分反相HPLC层析分离时，收集保留时间约为4.6min和7.3min的两个色谱峰，分别为多肽I和II，其层析示意图见图5；D3组分反相HPLC层析分离时，收集保留时间约为5.4min的色谱峰，为多肽III，其层析示意图见图6；根据洗脱峰收集样品，减压浓缩除去甲醇后，冷冻干燥；冻干后得到3个角类活性多肽冻干粉，分别为I，II和III。多肽I的序列为Gln-Tyr-Asp-Gln-Gly-Val，多肽II的序列为Tyr-Glu-Asp-Cys-Thr-Asp-Cys-Gly-Asn，多肽III的序列为Ala-Ala-Asp-Asn-Ala-Asn-Glu-Leu-Phe-Pro-Pro-Asn。多肽I和II从D2部分分离纯化获得，多肽III从D3部分分离纯化获得。

(5)纯化活性多肽的序列分析：

在此研究中，我们采用经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和串联质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)分析3个活性多肽的分子量及其氨基酸序列。MALDI-TOF上样基质选用α-氰基-4-羟基肉桂酸，将大约1μl的样品与1μl基质充分混合后，点样于上样靶，室温下干燥。MALDI-TOF/TOF-MS分析激光波长为337nm，一级质谱加速电压设置为19kV，串联质谱最终加速电压为29kV，串联质谱大约由1000次轰击累加而成。结果获得3个多肽的[M+H]⁺分别为709.090Da，1019.296Da和1272.379Da；3个多肽的氨基酸序列分别为：Gln-Tyr-Asp-Gln-Gly-Val，Tyr-Glu-Asp-Cys-Thr-Asp-Cys-Gly-Asn和Ala-Ala-Asp-Asn-Ala-Asn-Glu-Leu-Phe-Pro-Pro-Asn，3个多肽的串联质谱及氨基酸序列从头计算示意图见图7，图8和图9。

Claims

1.式II的多肽或其药学上可接受的盐：

Tyr-Glu-Asp-Cys-Thr-Asp-Cys-Gly-Asn（II）。

2.权利要求1的多肽的制备方法，包括：

c、将最高抗氧化活性的组分进一步利用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱分离纯化，离子交换柱先用50mM磷酸盐缓冲液pH6.5，以1ml/min流速预处理3h；上样后，离子交换柱用50mM磷酸盐缓冲液pH6.5，以1ml/min流速洗脱2h，然后以线性梯度为0－0.3MNaCl的磷酸盐缓冲液50mM，pH6.5洗脱，洗脱曲线在254nm下检测；根据洗脱峰收集每个组分，冷冻干燥；

e、将组分D2和D3，再通过Waters 2545-2489-2676自动纯化HPLC系统进一步分离纯化；以线性梯度为2％－60％甲醇洗脱，其中含0.1％三氟乙酸，在230nm下检测；D2组分反相HPLC层析分离时，收集保留时间约为7.3min的色谱峰，为多肽II；收集得到的样品，减压浓缩除去甲醇后，冷冻干燥；得到多肽II的冻干粉。

3.一种药物组合物，其中含有权利要求1的多肽或其药学上可接受的盐及药学上可接受的载体。

4.权利要求1的多肽或其药学上可接受的盐用于制备抗氧化药物的用途。