CN102304047A

CN102304047A - γ-羟基炔酸酯衍生物及其在制备抗肿瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN102304047A
Application number: CN201110184445A
Authority: CN
Inventors: 王锐; 林利; 宋虹瑾
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2011-07-04
Filing date: 2011-07-04
Publication date: 2012-01-04
Anticipated expiration: 2031-07-04
Also published as: CN102304047B

Abstract

本发明公开了一类具有抗肿瘤活性的γ-羟基炔酸酯衍生物及其在制备抗肿瘤药物中的应用，属于生化技术领域。本发明γ-羟基炔酸酯衍生物其结构为：

Description

γ-羟基炔酸酯衍生物及其在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于生化技术领域，涉及一种γ-羟基炔酸酯衍生物；本发明同时还涉及γ-羟基炔酸酯衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

癌症已成为威胁人类生命健康的主要杀手。据报道，全球癌症发病率呈急剧上升趋势，在未来十几年将增加50％。我国近二十多年来癌症发病率增长近70％，而死亡率增长近30％。随着有机化学的飞速发展，化疗已成为肿瘤治疗中发展最快的领域之一。它不仅是肿瘤治疗的辅助手段，而且已经逐渐发展成为最为普遍、有效的方法和手段之一。因而具有潜在抗肿瘤活性化合物的分离、设计合成与改造必将为化疗提供必备基础。

研究发现炔丙醇结构是许多天然产物及药物分子中重要的手性结构单元。该类化合物广泛存在陆生植物及海洋生海绵体类生物体内，近年研究人员也发现在各类真菌的次生代谢产物中也含有该类结构，目前已报道的天然产物中有超过1000种包含该结构的化合物。该类化合物表现出广泛的多重生物活性，例如细胞毒性，抗菌杀菌活性，抗癌抗肿瘤，抗HIV活性，多种酶抑制作用等。虽然几类重要的抗癌药物(如Calicheamycin，C-1027，Esperamicin，Maduropeptin)及AIDS药物(如Efavirenz)也含有该结构，但是不对称合成方法的发展大大限制了人们对此类化合物的构效关系研究及含有此类结构新药的创制。

以下为天然产物中分离所得含炔天然产物中的几类主要结构单元：

其中A、B、C三类手性炔丙醇结构最为普遍，含炔脂肪酸D、E类化合物次之，对于天然产物分离条件稳定性较差的γ-羟基丙炔酸结构F则较为罕见，但是表现有较好的生物活性。由此可见，炔丙醇结构以及不饱和的脂肪酸结构是该类化合物表现多重生物活性的重要结构砌块。

因而天然产物中结构较为罕见但有较好抗肿瘤活性的γ-羟基丙炔酸结构必将成为发展新型抗肿瘤药物的重要前体。但是由于此前缺乏成熟实用的γ-羟基丙炔酸的不对称合成方法，从而导致未能对此类化合物作系统的抗肿瘤活性研究。此外此类结构亦是合成其他具有生物活性化合物极为重要的结构砌块及合成中间体。虽然手性炔丙醇的不对称合成在近十年来得到了飞速的发展，但是此类不对称合成方法的发展仅限于A、B、C类简单结构的构建，γ-羟基丙炔酸(F)的不对称合成因其活泼的结构特点受到了极大的局限性。针对于此，发展了简便易行的各类手性炔丙醇结构的不对称合成方法，尤其手性γ-羟基丙炔酸酯的不对称合成方法，并成功将其应用于-系列重要生物活性化合物的不对称全合成。

发明内容

本发明的目的在于提供提供一种具有抗肿瘤活性的γ-羟基炔酸酯衍生物。

本发明的另一目的是提供一种γ-羟基炔酸酯衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。

一、γ-羟基炔酸酯衍生物

本发明γ-羟基炔酸酯衍生物，其结构式如下：

R₁为氢原子，(C1～C6)-烷基，卤原子取代的(C1～C6)-烷基，(C1～C6)-烷氧基，优选甲氧基，卤原子取代的(C1～C6)-烷氧基，氨基，单(C1～C6)-烷基氨基，二-N，N-(C1～C6)-烷基氨基。

R₂为苯基，取代的苯基，萘基，取代的萘基，杂芳香基，(C1～C20)饱和脂肪基，(C1～C20)不饱和脂肪基，(C2～C20)-链烯基，(C2～C20)-链炔基。

所述取代的苯基的结构式如下：

其中R₃，R₄，R₅，R₆、R₇为彼此独立的为氢原子，卤素，氰基，硝基，(C1～C6)-烷基，至少一个卤原子取代的(C1～C6)-烷基，(C1～C6)-烷氧基，至少一个卤原子取代的(C1～C6)-烷氧基，(C2～C6)-链烯基，(C2～C6)-链炔基，(C3～C8)-环烷基，(C1～C6)-烷氧基羰氧基，(C1～C6)-烷基羰氧基，(C1～C4)-烷硫基，(C1～C4)-烷基亚硫酰基，(C1～C4)-烷基磺酰基，(C1～C6)-烷氧基-(C1～C6)-烷基，氨基，单(C1～C6)-烷基氨基，二-N，N-(C1～C6)-烷基氨基。其中R₃和R₆优选卤素，三氟甲基，三氟甲氧基时，R₄、R₅、R₇优选氢原子。

X为氧原子，硫原子，NH，在相同的C原子上双取代的羟基。

二、γ-羟基炔酸酯衍生物的合成

1、手性(R)-γ-羟基炔酸酯的合成方法(参见Org.Lett.2007，9，2329-2332)：在氩气保护下，在含有手性配体((S)-2-(4-甲基苯磺酰氨基)-1，1-二苯基-3-苯基-1-丙醇，21.6mg，0.06mmol，30mol％)的甲苯(2.4mL)溶液中，一次性加入乙二醇二甲醚(20.7μL，02mmol，100mol％)、二乙基锌溶液(0.6mL，0.6mmol，300mol％)和丙炔酸甲酯(53.5μL，0.2mmol，300mol％)，于25℃下再搅拌7小时；溶液逐渐变为棕褐色，然后加入Ti(OiPr)₄(17.5μL，0.06mmol，30mol％)，搅拌半小时后加入0.2mmol醛，直至反应结束(TLC检测)。用饱和NH₄Cl水溶液萃灭反应，用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，无水Na₂SO₄干燥，减压浓缩至干。得到的油状物经过柱色谱纯化(硅胶柱，石油醚∶乙酸乙酯＝9∶1)。

2、手性(S)-γ-羟基炔酸酯的合成方法(参见Angew.Chem.，Int.Ed.2005，45，122-125.)：在氩气保护下，在含有手性配体(R)-联萘酚(28.6mg，0.10mmol，40mol％)的二氯甲烷(3mL)溶液中，依次加入六甲基磷酰胺(85μL，1.0mmol，200mol％)、1M的二乙基锌溶液(1mL，1.0mmol，400mol％)和丙炔酸甲酯(85μL，1.0mmol，400mol％)，于室温下搅拌16小时；溶液逐渐变为棕褐色，然后加入Ti(OiPr)4(74μL，0.25mmol，100mol％)，搅拌1小时后加入0.25mmol醛，直至反应结束(TLC检测)。用饱和NH₄Cl水溶液萃灭反应，用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，无水Na₂SO₄干燥，减压浓缩至干。得到的油状物经过柱色谱纯化(硅胶柱，石油醚∶乙酸乙酯＝9∶1)。所述醛的结构式如下：

所述取代的苯基的结构式如下：

其中R₃，R₄，R₅，R₆、R₇为彼此独立的为氢原子，卤素，氰基，硝基，(C1～C6)-烷基，至少一个卤原子取代的(C1～C6)-烷基，(C1～C6)-烷氧基，至少一个卤原子取代的(C1～C6)-烷氧基，(C2～C6)-链烯基，(C2～C6)-链炔基，(C3～C8)-环烷基，(C1～C6)-烷氧基羰氧基，(C1～C6)-烷基羰氧基，(C1～C4)-烷硫基，(C1～C4)-烷基亚硫酰基，(C1～C4)-烷基磺酰基，(C1～C6)-烷氧基-(C1～C6)-烷基，氨基，单(C1～C6)-烷基氨基，-N，N-(C1～C6)-烷基氨基。其中R₃和R₆优选卤素，三氟甲基，三氟甲氧基时，R₄、R₅、R₇优选氢原子。

三、γ-羟基炔酸酯衍生物的抗癌活性实验

肿瘤细胞EJ(膀胱癌)，购自武汉中国典型培养物保藏中心，用添加10％小牛血清、青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)、NaHCO₃(2-0mg/ml)的RPMI 1640培养液在37℃、5％CO₂条件下常规培养，取对数生长期细胞实验。

1、MTT肿瘤细胞药物筛选实验

实验方法：MTT全称为3-(4，5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3，5-di-phenytetrazoliumromide，是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT，同时在细胞色素C的作用下，生成蓝色(或蓝紫色)不溶于水的甲臜(Formazan)，甲臜的多少可以用酶标仪在570nm处进行测定。在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目。由于死细胞中不含琥珀酸脱氢酶，因此加入MTT不会有反应。指数生长的癌细胞，用D-Hanks缓冲液配置的0.25％胰蛋白酶消化以后，吹打使之成为单细胞悬液。计数使细胞浓度为5×104/ml，90μl细胞液加入到96孔板中，放置过夜24小时，然后加入10μl不同浓度的药物，每浓度平行六孔。共同再培养48小时后，每孔加入10μl的MTT(5mg/ml)，并在37℃培养箱中共培养4小时。然后将培养液弃掉，每孔加入150μl DMSO来溶解甲臜。将细胞培养板在微孔震荡器上震荡使甲臜完全溶解，然后再Bio-Rad 680酶标仪上测定490nm处的吸光值。实验中每个浓度重复6孔，每次实验至少重复3次。分别测试不同浓度的药物作用，结果用IC50来表示。

实验结果：表明本发明γ-羟基炔酸酯衍生物对于肿瘤细胞均具有抑制增殖作用(表3和表4)，在10μM左右都表现出癌细胞的抑制作用。其中芳香族化合物明显比脂肪族表现出更好的活性，与此同时，邻位、对位含有卤素尤其是氟取代的化合物也表现出更好的肿瘤抑制增殖作用。

2、Annexin V/PI双染测定细胞凋亡

实验方法：使用1×106EJ细胞培养24h后，加入不同浓度的药物，共同再培养48小时后，胰蛋白酶消化悬浮细胞离心(2000rpm离心5min)收集，用PBS洗涤细胞二次(2000rpm离心5min)。然后加入500μl的Binding Buffer悬浮细胞，再加入5μl Annexin V/FITC混匀，最后加入5μl Propidium Iodide混匀。将细胞置于室温、避光环境，反应5～15min，使用Epics XL-4流式细胞仪(BECKMAN-Coulter，USA)检测。

实验结果：选取代表性的化合物LS-11为例，其结果显示如图1～4。由结果进一步证实药物的作用是使细胞发生凋亡，随着时间的增加凋亡数目也在增加，48小时后晚期凋亡数目增加，死细胞数目也增加。这说明在生理浓度的作用下，药物对于细胞凋亡的程度的影响是与时间的长短成正比，而在全血清的作用下，药物并没有降解，而是持续的发挥作用。而且，大量的Annexin V/PI双染测定细胞凋亡实验表明，所有的γ-羟基炔酸酯衍生物的作用结果基本相似。

3、细胞周期检测

实验方法：使用1×10⁶EJ细胞培养24h后，加入不同浓度的药物，共同再培养48小时后，胰蛋白酶消化悬浮细胞离心(2000rpm离心5min)收集，用预冷的PBS洗涤细胞二次(2000rpm离心5min)，然后加入预冷70％乙醇，于4℃固定过夜。第二天离心收集细胞，以1mL的PBS洗细胞一次，加入500uLPBS含50ug/mL溴化乙锭(PI)，100ug/mL RNaseA，02％Triton X-100，4℃避光孵育30分钟后，使用Epics XL-4流式细胞仪(BECKMAN-Coulter，USA)检测。

实验结果：选取代表性的化合物LS-11为例，其结果显示如图5～9。细胞周期的结果说明：和对照相比，细胞由于药物的作用大量阻滞在S期和G2期，说明药物通过作用于DNA的复制期和转录期而抑制肿瘤增殖。而且，大量的细胞周期检测表明，所有的γ-羟基炔酸酯衍生物的作用结果基本相似。

4、体内抗肿瘤实验

实验方法：使用小鼠移植性肿瘤S180，购自肿瘤医院，使用的小鼠是清洁级母鼠，体重18～22g，由兰州大学医学院动物实验中心购入。将S180肉瘤以107每只小鼠0.2ml接种在母鼠腋下。第二天再给接种了S180的小鼠随机进行腹腔给药，给药量为0.2ml，每日给药一次，连续11天。停药次日断椎处死，称体重，解剖剥离皮下瘤体，称瘤重。按下式计算抑瘤率∶抑瘤率(％)＝(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％。

实验结果：选取代表性的化合物LS-11(见图10)和LS-45(见图11)的结果分别显示：在离体条件下化合物LS-11和LS-45可以剂量依赖的减小肿瘤的体积，抑制肿瘤的生长，并在25mg以下计量毒性较低，对于小鼠的生命延长没有影响。而且，大量的体内抗肿瘤实验表明，所有的γ-羟基炔酸酯衍生物的作用结果基本相似。

附图说明

图1为：Annexin V/PI双染未使用LS-11药物作用的EJ细胞；

图2为Annexin V/PI双染10μM LS-11药物作用12h的EJ细胞；

图3为Annexin V/PI双染10μM LS-11药物作用24h的EJ细胞；

图4为Annexin V/PI双染10μM LS-11药物作用48h的EJ细胞；

图5为PI单染未使用药物作用的EJ细胞；

图6为PI单染10μM LS-11药物作用24h的EJ细胞；

图7为PI单染10μM LS-11药物作用48h的EJ细胞；

图8为PI单染10μM LS-45药物作用24h的EJ细胞；

图9为PI单染10μM LS-45药物作用48h的EJ细胞；

图10为化合物LS-11的体内抗肿瘤实验结果；

图11为化合物LS-45的体内抗肿瘤实验结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明γ-羟基炔酸酯衍生物的结构、合成及抗肿瘤活性作详细的说明。

实施例1～43中，γ-羟基炔酸酯衍生物的结构如下：

其合成方法可根据不同的构型选用前述手性(R)-γ-羟基炔酸酯的合成方法和手性(S)-γ-羟基炔酸酯的合成方法，并根据不同的化合物，在合成过程中注意选用对应的醛。实施例1～43中，γ-羟基炔酸酯衍生物的构型、表征等特征见表1。

表1.

实施例44～60中，γ-羟基炔酸酯衍生物的结构如下：

其合成方法见前述手性(R)-γ-羟基炔酸酯的合成方法，并根据不同的化合物，在合成过程中注意选用对应的醛。实施例44～60中，γ-羟基炔酸酯衍生物的构型、表征等特征见表2。

表2.

实施例61～98为γ-羟基炔酸酯衍生物LS-1～LS-38对于肿瘤细胞均具有抑制增殖作用的实验结果。各实施例相应IC₅₀值见表3。

表3.各实施例相应IC₅₀值

实施例99～114为γ-羟基炔酸酯衍生物LS-40～LS-55对于肿瘤细胞均具有抑制增殖作用的实验结果。各实施例相应IC₅₀值见表4。

表4.各实施例相应IC₅₀值。

Claims

1.γ-羟基炔酸酯衍生物，其结构式如下：

R₁ 为氢原子，(C1~C6)-烷基，卤原子取代的(C1~C6)-烷基，(C1~C6)-烷氧基，卤原子取代的(C1~C6)-烷氧基，氨基，单(C1~C6)-烷基氨基，二-N,N-(C1~C6)-烷基氨基；

R₂为苯基，取代的苯基，萘基，取代的萘基，杂芳香基，（C1~C20）饱和脂肪基，（C1~C20）不饱和脂肪基，(C2~C20)-链烯基，(C2~C20)-链炔基；

X 为氧原子，硫原子， NH，在相同的C原子上双取代的羟基。

2.如权利要求1所述γ-羟基炔酸酯衍生物，其特征在于：所述取代的苯基的结构式如下：

其中R₃，R₄，R₅，R₆、R₇ 为彼此独立的为氢原子，卤素，氰基，硝基，(C1~C6)-烷基，至少一个卤原子取代的(C1~C6)-烷基，(C1~C6)-烷氧基，至少一个卤原子取代的(C1~C6)-烷氧基，(C2~C6)-链烯基，(C2~C6)-链炔基，(C3~C8)-环烷基， (C1~C6)-烷氧基羰氧基，(C1~C6)-烷基羰氧基，(C1~C4)-烷硫基，(C1~C4)-烷基亚硫酰基，(C1~C4)-烷基磺酰基，(C1~C6)-烷氧基-(C1~C6)-烷基，氨基，单(C1~C6)-烷基氨基，二-N,N- (C1~C6)-烷基氨基。

3.如权利要求1所述γ-羟基炔酸酯衍生物作为活性物质在制备抗肿瘤药物中的应用。

4.如权利要求3所述γ-羟基炔酸酯衍生物作为活性物质在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：用于制备抗膀胱癌药物。

5.如权利要求3所述γ-羟基炔酸酯衍生物作为活性物质在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：用于制备抗肝癌药物。

6.如权利要求3所述γ-羟基炔酸酯衍生物作为活性物质在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：用于制备抗乳腺癌药物。

7.如权利要求3所述γ-羟基炔酸酯衍生物作为活性物质在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：用于制备抗前列腺癌药物。

8.如权利要求3所述γ-羟基炔酸酯衍生物作为活性物质在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：用于制备抗白血病的药物。