CN102286536A - 一种胞壁结合型生物破乳剂的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于工业微生物技术领域，公开了一种胞壁结合型生物破乳剂的提取方法，该方法包括以下步骤：将产胞壁结合型生物破乳剂的破乳菌菌体干粉经过预处理，然后与碱液混合搅拌，经离心、中和、浓缩和冷冻干燥，得到胞壁结合型生物破乳剂。本发明的提取物破乳效果好，提取率较高，破乳活性物质提取完全，有利于生物破乳剂的纯化鉴定和生物破乳菌破乳机理进一步揭示，并能为生物破乳菌的培养和大规模工业化应用提供理论依据。
Description
技术领域
本发明属于工业微生物技术领域，涉及一种胞壁结合型生物破乳剂的提取方法。
背景技术
生物破乳剂是生物表面活性剂的一种，是一类能够使乳状液油水分离的新型破乳剂。与传统化学破乳剂相比，生物破乳剂具有高效低毒、可生物降解、在极端条件下发挥活性等优点，在原油开采、含油土壤修复等领域具有较大的应用前景。(Cairns，W.L.，Cooper，D.G.，Zajic，J.E.，Wood，J.M.，Kosaric，N.，1982.Characterization of Nocardia amarae as a Potent BiologicalCoalescing Agent of Water-Oil Emulsions.Appl.Environ.Microbiol.，43，362-366.)
目前发现的生物破乳剂多紧密结合于破乳菌株表面，难于提取因而不利于破乳活性物质的性质研究。因此，针对产胞壁结合型生物破乳剂的菌株，需要简捷、方便、高效的提取手段来得到其破乳活性物质，以便于对其进行纯化鉴定，进一步揭示生物破乳菌破乳机理，从而指导生物破乳菌的培养和大规模工业化应用。
目前大量应用于提取微生物胞壁结合物的方法是有机溶剂提取(Franzetti，A.，Bestetti，G.，Caredda，P.，La Colla，P.，Tamburini，E.，2008.Surface-active compounds and their role in theaccess to hydrocarbons in Gordonia strains.FEMS Microbiol.Ecol.，63，238-248.)，另外水提取法被广泛应用于植物提取(Geuenich，S.，Goffinet，C.，Venzke，S.，Nolkemper，S.，Baumann，I.，Plinkert，P.，Reichling，J.，Keppler，O.，2008.Aqueous extracts from peppermint，sage and lemonbalm leaves display potent anti-HIV-1 activity by increasing the virion density.Retrovirology，5，27.)，该法也可以借鉴用于微生物胞壁物质提取。但是这些方法应用于产胞壁结合型生物破乳剂的破乳菌时，普遍存在提取过程复杂、效率不高、提取产物破乳活性不好、提取不完全等问题。
发明内容
针对现有技术提取效率低，操作复杂，成本较高，提取产物破乳活性不好，提取不完全等问题，本发明的目的是提供一种胞壁结合型生物破乳剂的提取方法，该方法工艺简单、成本较低、提取效率高，且能较大程度上保留提取物的功能活性。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种胞壁结合型生物破乳剂的提取方法，该方法包括以下步骤：将产胞壁结合型生物破乳剂的破乳菌菌体干粉经过预处理，然后与碱液混合搅拌，经离心、中和、浓缩和冷冻干燥，得到胞壁结合型生物破乳剂。
所述的产胞壁结合型生物破乳剂的破乳菌选自产碱杆菌(Alcaligenes sp.)、诺卡氏菌(Nocardia sp.)、棒状杆菌(Corynebacterium sp.)、红球菌(Rhodococcus sp.)或微球菌(Micrococcus sp.)等菌种。
所述的产胞壁结合型生物破乳剂的破乳菌菌体干粉和碱液的料液比为5∶1～25∶1g/L。
所述的预处理是将产胞壁结合型生物破乳剂的破乳菌菌体干粉1-2g加入到50mLCH2Cl2中进行预处理，磁力搅拌1-3h，过滤，晾干，从滤纸上刮下备用。
所述的碱液是浓度为0.05-0.25mol/L的NaOH溶液。
所述的搅拌是在温度为25-65℃，转速500-1000rpm的条件下，水浴磁力搅拌1-8h。
所述的离心其转速为10000-12000rpm，温度4-15℃，时间10-20min。
所述的中和是将001×7强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂加入离心后上清液中，不断搅拌，直至pH值为6.8-7.2。
所述的浓缩是在温度45-55℃的条件下，将中和后清液减压旋转蒸发至1-10mL。
所述的冷冻干燥是在-50℃下冷冻干燥24h。
本发明同现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
1.本发明提取产物破乳效果好，当投加浓度为500mg/L时，破乳率最高可达77％。
2.本发明相对于其它提取方法，提取率较高，最高可达35％以上。
3.本发明对破乳活性物质提取较完全，残余菌体无破乳活性。
4.本发明采用CH2Cl2进行预处理，洗脱菌体表面惰性物质，提高提取效率。
5.本发明采用碱液提取，工艺简单高效，成本低。
6.本发明采用树脂中和碱液，并去除钠离子，达到除盐效果，操作简单，成本低，效果较好。
7.本发明的提取物破乳效果好，提取率较高，破乳活性物质提取完全，有利于生物破乳剂的纯化鉴定和生物破乳菌破乳机理进一步揭示，并能为生物破乳菌的培养和大规模工业化应用提供理论依据。
附图说明
图1为实施例1提取率和提取物的破乳率随提取温度变化曲线。
图2为实施例2提取率和提取物的破乳率随提取时间变化曲线。
图3为实施例3提取率和提取物的破乳率随提取时碱液浓度变化曲线。
图4为实施例4提取率和提取物的破乳率随提取时料液比变化曲线。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的说明。
本发明适用于胞壁结合型生物破乳剂的提取，特别适用于专利200710046963.5中所述一株产胞壁结合型生物破乳剂的破乳菌：高效生物破乳菌产碱杆菌Alcaligenes sp.S-XJ-1(说明书第1页第28行)，以下将以此菌株为实施对象进行描述。
高效生物破乳菌产碱杆菌Alcaligenes sp.S-XJ-1取自克拉玛依油田某站采油井井口1m处长期受石油污染的土壤，于-4℃保存在斜面培养基上。将保藏菌种活化后接种至100mL肉汤培养基富集培养72h，再将10mL培养液接入100mL发酵培养基中培养7d。培养后将菌株的全培养液在10000rpm高速离心10min，获得湿菌，使用正己烷洗提离心三次，-50℃冷冻干燥24h得到菌体干粉，为本发明原料。
高效生物破乳菌产碱杆菌Alcaligenes sp.S-XJ-1所用的肉汤培养基(1L)组成为：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 25g，pH＝7.0。发酵培养基(1L)组成为：NH4NO3 4.0g，K2HPO4 4.0g，KH2PO4 6.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，微量元素溶液1mL，NaCl 25g。碳源为液体石蜡4％(V/V)。其中微量元素溶液(1L)包含CaCl2·2H2O 1000mg，FeSO4·7H2O 1000mg，EDTA 1400mg。用6mol/LHCl和6mol/LNaOH调节发酵培养基初始pH＝9.0。培养基使用前，使用高压蒸气灭菌，灭菌条件为：1×105Pa灭菌20min。培养条件为：35℃，130rpm。(陆丽君，黄翔峰，刘佳，等.一株高效生物表面活性剂产生菌的筛选鉴定及其性质研究.工业微生物，2008，38(5)：34-39.)
本发明中模型乳状液配制方法如下：用煤油和水配制油包水型(W/O)模型乳状液，在250mL高脚烧杯中，加入80mL溶有1.526g Span80和0.074g Tween80的煤油溶液，然后加入120mL蒸馏水，用高速搅拌乳化机搅拌3.5min，转速10000rpm。破乳试验用于验证提取物破乳活性。(黄翔峰，尚家佳，陆丽君，等.pH对破乳菌Alcaligenes sp.S-XJ-1破乳性能的影响.微生物学通报，2010，37(11)：1575-1580.)
实施例1
1.将2g生物破乳菌产碱杆菌Alcaligenes sp.S-XJ-1菌体干粉加入到50mL CH2Cl2中进行预处理，磁力搅拌1h，去除菌体表面的烷烃类物质，过滤，晾干，从滤纸上刮下备用。
2.将预处理后的菌体干粉0.5g和50mL 0.1mol/L NaOH溶液加入锥形瓶中(菌体干粉和碱液的料液比为10∶1g/L)，共准备5份，分别在25℃、35℃、45℃、55℃、65℃，转速900rpm的条件下水浴磁力搅拌4h。
3.对所得混合液进行离心分离，转速为12000rpm，温度15℃，时间10min，上清液备用，残菌冷冻干燥。
4.将一定量的001×7强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂加入上清液中，并不断搅拌，直至pH为6.8-7.2，将清液倒出，而后在50℃减压旋转蒸发浓缩至约5mL，在-50℃下冷冻干燥24h，得到提取破乳活性物质固体。
5.称取一定量所得破乳物质，加水溶解配成10g/L溶液，pH调节至中性，取2mL加入破乳管，再加入18mL模型乳状液，剧烈震荡120下，放入35℃水浴锅48h，观察破乳效果。
图1为活性物质提取率和破乳率随温度单因素变化趋势，温度由低到高提取物破乳率分别为：60％，82.5％，32.5％，27.5％，27.5％。最佳提取温度条件下残菌进行相同破乳试验验证失去破乳活性。
实施例2
1.将2g生物破乳菌产碱杆菌Alcaligenes sp.S-XJ-1菌体干粉加入50mL CH2Cl2中进行预处理，磁力搅拌1h，过滤，晾干，从滤纸上刮下备用。
2.将预处理后的菌体干粉0.5g和50mL 0.1mol/L NaOH溶液加入锥形瓶中(菌体干粉和碱液的料液比为10∶1g/L)，共准备5份，分别在35℃，转速900rpm的条件下水浴磁力搅拌1h、2h、4h、6h、8h。
3.对所得混合液进行离心分离，转速为12000rpm，温度15℃，时间10min，上清液备用，残菌冷冻干燥。
4.将一定量的001×7强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂加入上清液中，并不断搅拌，直至pH为6.8-7.2，将清液倒出，而后在50℃减压旋转蒸发浓缩至约5mL，在-50℃下冷冻干燥24h，得到提取破乳活性物质固体。
5.称取一定量所得破乳物质，加水溶解配成10g/L溶液，pH调节至中性，取2mL加入破乳管，再加入18mL模型乳状液，剧烈震荡120下，放入35℃水浴锅48h，观察破乳效果。图2为活性物质提取率和破乳率随提取时间单因素变化趋势，提取时间由低到高提取物破乳率分别为：70％，71％，80.5％，79％，28％。最佳提取时间条件下残菌进行相同破乳试验验证失去破乳活性。
实施例3
1.将2g生物破乳菌产碱杆菌Alcaligenes sp.S-XJ-1菌体干粉加入50mL CH2Cl2中进行预处理，磁力搅拌1h，过滤，晾干，从滤纸上刮下备用。
2.将预处理后的菌体干粉0.5g 5份分别和50mL 0.05mol/L、0.1mol/L、0.15mol/L、0.2mol/L、0.25mol/LNaOH溶液加入锥形瓶中(菌体干粉和碱液的料液比为10∶1g/L)，在35℃，转速900rpm的条件下水浴磁力搅拌4h。
3.对所得混合液进行离心分离，转速为12000rpm，温度15℃，时间10min，上清液备用，残菌冷冻干燥。
4.将一定量的001×7强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂加入上清液中，并不断搅拌，直至pH为6.8-7.2，将清液倒出，而后在50℃减压旋转蒸发浓缩至约5mL，在-50℃下冷冻干燥24h，得到提取破乳活性物质固体。
5.称取一定量所得破乳物质，加水溶解配成10g/L溶液，pH调节至中性，取2mL加入破乳管，再加入18mL模型乳状液，剧烈震荡120下，放入35℃水浴锅48h，观察破乳效果。图3为活性物质提取率和破乳率随碱液浓度单因素变化趋势，碱液浓度由低到高提取物破乳率分别为：76.5％，86％，30.5％，29％，28.5％。最佳碱液浓度下残菌进行相同破乳试验验证失去破乳活性。
实施例4
1.将2g生物破乳菌产碱杆菌Alcaligenes sp.S-XJ-1菌体干粉加入50mL CH2Cl2中进行预处理，磁力搅拌1h，过滤，晾干，从滤纸上刮下备用。
2.将预处理后的菌体干粉0.5g、1g、1.5g、2g、2.5g分别和50mL 0.1mol/LNaOH溶液加入锥形瓶中(菌体干粉和碱液的料液比分别为5∶1g/L、10∶1g/L、15∶1g/L、20∶1g/L、25∶1g/L)，在35℃，转速900rpm的条件下水浴磁力搅拌4h。
3.对所得混合液进行离心分离，转速为12000rpm，温度15℃，时间10min，上清液备用，残菌冷冻干燥。
4.将一定量的001×7强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂加入上清液中，并不断搅拌，直至pH为6.8-7.2，将清液倒出，而后在50℃减压旋转蒸发浓缩至约5mL，在-50℃下冷冻干燥24h，得到提取破乳活性物质固体。
5.称取一定量所得破乳物质，加水溶解配成10g/L溶液，pH调节至中性，取2mL加入破乳管，再加入18mL模型乳状液，剧烈震荡120下，放入35℃水浴锅48h，观察破乳效果。图4为活性物质提取率和破乳率随料液比单因素变化趋势，料液比由低到高提取物破乳率分别为：52.5％，79％，67.5％，67.5％，67.5％。最佳料液比条件下残菌进行相同破乳试验验证失去破乳活性。
实施例5
根据上述4个实施例中的单因素试验，以破乳率和提取率作为考察指标，设计正交试验，以得到最佳提取条件。
正交试验设计见表1：
表1
| 实验 | 温度(℃) | 碱液浓度(mol/L) | 料液比(g/L) | 反应时间(h) |
| 1 | 30 | 0.08 | 8 | 3 |
| 2 | 30 | 0.10 | 10 | 4 |
| 3 | 30 | 0.12 | 12 | 5 |
| 4 | 35 | 0.08 | 10 | 5 |
| 5 | 35 | 0.10 | 12 | 3 |
| 6 | 35 | 0.12 | 8 | 4 |
| 7 | 40 | 0.08 | 12 | 4 |
| 8 | 40 | 0.10 | 8 | 5 |
| 9 | 40 | 0.12 | 10 | 3 |
1.将2g生物破乳菌产碱杆菌Alcaligenes sp.S-XJ-1菌体干粉加入50mL CH2Cl2中进行预处理，磁力搅拌1h，过滤，晾干，从滤纸上刮下备用。
2.根据正交设计，将预处理后的菌体干粉0.4-0.6g和50mL 0.08-0.12mol/LNaOH溶液加入锥形瓶中(菌体干粉和碱液的料液比为8∶1g/L-12∶1g/L)，在30-40℃，转速900rpm的条件下水浴磁力搅拌3-5h。
3.对所得混合液进行离心分离，转速为12000rpm，温度15℃，时间10min，上清液备用，残菌冷冻干燥。
4.将一定量的001×7强酸性阳离子交换树脂加入上清液中，并不断搅拌，直至pH为6.8-7.2，将清液倒出，而后在50℃减压旋转蒸发浓缩至约5mL，在-50℃下冷冻干燥24h，得到提取破乳活性物质固体。
5.称取一定量所得破乳物质，加水溶解配成5g/L溶液，pH调节至中性，取2mL加入破乳管，再加入18mL模型乳状液，剧烈震荡120下，放入35℃水浴锅48h，观察破乳效果。残菌进行相同破乳试验验证破乳活性。得到的最佳提取条件为：温度35℃、碱液浓度0.08mol/L、提取时间4h、料液比12g/L。
实施例6
验证最佳提取条件。
1.将2g生物破乳菌产碱杆菌Alcaligenes sp.S-XJ-1菌体干粉加入50mL CH2Cl2中进行预处理，磁力搅拌1h，过滤，晾干，从滤纸上刮下备用。
2.根据正交设计，将预处理后的菌体干粉0.6g和50mL 0.08mol/LNaOH溶液加入锥形瓶中(菌体干粉和碱液的料液比为12∶1g/L)，在35℃，转速900rpm的条件下水浴磁力搅拌4h。
3.对所得混合液进行离心分离，转速为12000rpm，温度15℃，时间10min，上清液备用，残菌冷冻干燥。
4.将一定量的001×7强酸性阳离子交换树脂加入上清液中，并不断搅拌，直至pH为6.8-7.2，将清液倒出，而后在50℃减压旋转蒸发浓缩至约5mL，在-50℃下冷冻干燥24h，得到提取破乳活性物质固体，提取率36.1％。
5.称取一定量所得破乳物质，加水溶解配成5g/L溶液，pH调节至中性，取2mL加入破乳管，再加入18mL模型乳状液，剧烈震荡120下，放入35℃水浴锅48h，观察破乳效果。此条件下破乳率为77％，破乳率高于正交试验数据，残菌进行相同破乳试验验证失去破乳活性，且提取率较高，可认为是最佳提取条件。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种胞壁结合型生物破乳剂的提取方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：将产胞壁结合型生物破乳剂的破乳菌菌体干粉经过预处理，然后与碱液混合搅拌，经离心、中和、浓缩和冷冻干燥，得到胞壁结合型生物破乳剂。
2.根据权利要求1所述的胞壁结合型生物破乳剂的提取方法，其特征在于：所述的产胞壁结合型生物破乳剂的破乳菌选自产碱杆菌、诺卡氏菌、棒状杆菌、红球菌或微球菌。
3.根据权利要求1所述的胞壁结合型生物破乳剂的提取方法，其特征在于：所述的产胞壁结合型生物破乳剂的破乳菌菌体干粉和碱液的料液比为5∶1～25∶1g/L。
4.根据权利要求1所述的胞壁结合型生物破乳剂的提取方法，其特征在于：所述的预处理是将产胞壁结合型生物破乳剂的破乳菌菌体干粉1-2g加入到50mL CH2Cl2中进行预处理，磁力搅拌1-3h，过滤，晾干，从滤纸上刮下备用。
5.根据权利要求1所述的胞壁结合型生物破乳剂的提取方法，其特征在于：所述的碱液是浓度为0.05-0.25mol/L的NaOH溶液。
6.根据权利要求1所述的胞壁结合型生物破乳剂的提取方法，其特征在于：所述的搅拌是在温度为25-65℃，转速500-1000rpm的条件下，水浴磁力搅拌1-8h。
7.根据权利要求1所述的胞壁结合型生物破乳剂的提取方法，其特征在于：所述的离心其转速为10000-12000rpm，温度4-15℃，时间10-20min。
8.根据权利要求1所述的胞壁结合型生物破乳剂的提取方法，其特征在于：所述的中和是将001×7强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂加入离心后上清液中，不断搅拌，直至pH值为6.8-7.2。
9.根据权利要求1所述的胞壁结合型生物破乳剂的提取方法，其特征在于：所述的浓缩是在温度45-55℃的条件下，将中和后清液减压旋转蒸发至1-10mL。
10.根据权利要求1所述的胞壁结合型生物破乳剂的提取方法，其特征在于：所述的冷冻干燥是在-50℃下冷冻干燥24h。
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