CN102286497A - 过表达zwf2基因提高达托霉素产量的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了过表达zwf2基因提高达托霉素产量的方法及其应用，克隆了初级代谢磷酸戊糖途径的一个关键酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因(zwf2)，利用大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒表达载体构建重组质粒。将重组质粒导入大肠杆菌ET12567中，将ET12567与玫瑰孢链霉菌共培养，通过结合转移的方法转化玫瑰孢链霉菌，然后通过安普霉素抗性筛选转化子，通过PCR对基因工程菌进一步验证，从而构建了基因工程菌HP-2。本发明构建的玫瑰孢链霉菌基因工程菌HP-2比出发菌种的产量提高了18％，达托霉素的产量高达700mg/L，可直接用于达托霉素的工业化生产，可提高产量降低成本。
Description
技术领域
本发明基因工程和微生物发酵技术领域，具体涉及一种过表达zwf2基因提高达托霉素产量的方法及其应用。
背景技术
达托霉素(图1)是一种钙离子依赖型的抗生素，在钙离子存在的条件下，达托霉素将以非共价键的形式结合到细胞膜蛋白上，细胞膜上的达托霉素结合蛋白(DBPs)为其作用靶位，达托霉素可扰乱细胞膜对氨基酸的转运，从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的磷壁酸脂质(LTA)的生物合成，改变细胞质膜的性质；另外，它还能通过破坏细菌的细胞膜，使其内容物外泄而达到杀灭细菌的目的。也有报道是其与细胞膜的结合，导致膜电位的降低，从而破坏胞内RNA和DNA的合成，最终抑制细菌生长。达托霉素由于独特的结构特征和作用机理，对于耐药菌，如耐万古霉素的肠球菌(VRE)，耐甲氧西林的金葡菌(MRSA)，糖肽类敏感的金葡菌(GISA)，凝固酶阴性的葡萄球菌(CNS)和耐青霉素的肺炎链球菌(PRSP)的感染具显著的治疗效果。是继万古霉素之后一种新型的抗生素，在治疗皮肤感染和心膜炎方面有着显著的疗效。2003年和2006年达托霉素(Daptomycin，LY146032)先后被美国FDA和了欧洲药品评价署(EMEA)的认证和批准上市。尽管国内已经有生产达托霉素的菌种，以初步实现中试生产，但是菌种原始，达托霉素的产量低，生产成本很高，因此通过基因工程技术选育高产优良菌株，进一步提高达托霉素的产量，具有重要的经济价值和社会意义。
发明内容
本发明提供过表达zwf2基因提高达托霉素产量的方法及其应用，与出发菌株相比实例菌株的达托霉素产量的到了显著提高。
Zwf基因编码葡萄糖-6磷酸脱氢酶基因。葡萄糖-6磷酸脱氢酶是磷酸戊糖途径的第一个酶也是调节整个PPP途径流量的关键酶。而磷酸戊糖途径可为细胞生长和抗生素提供还原力NADPH，以及核糖、芳香族氨基酸前体。达托霉素是大环内酯类脂肽抗生素，由13个氨基酸前体构成，其中包括芳香族氨基酸色氨酸Trp以及Trp有氧降解的产物犬尿氨酸Kyn。而氨基酸前体的合成过程中需要大量的还原力NADPH，所以调高PPP途径的代谢流量，不仅可以为达托霉素合成和菌体生长提供充足的还原力NADPH，而且也有利于增加芳香族氨基酸前体Trp和Kyn的供应。而zwf包含两个同工酶基因zwf1和zwf2，前人研究表明zwf2在磷酸戊糖途径起到关键作用。基于以上理论分析，过表达zwf2提高达托霉素产量，降低成本。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
达托霉素基因工程菌的构建方法，利用PCR扩增基因zwf2。将基因片段连接到过表达载体，然后利用结合转移的方法转化玫瑰孢链霉菌，通过抗生素抗性筛选获得目的基因工程菌。
所述表达载体为整合型载体。所述表达载体中NRPS附属基因的启动子为ermE*；表述载体的出发载体为pIB139。
达托霉素基因工程菌的构建方法，步骤如下：
(1)设计PCR引物扩增基因zwf2；
(2)将克隆得到的目的基因插入pIB139的组成型强启动子ermE*下游多克隆位点；
(3)然后将重组质粒导入大肠杆菌ET12567中，以备结合转移之用；
(4)将大肠杆菌ET12567与玫瑰孢链霉菌在MS培养基上37℃共培养20小时，然后用含有萘啶酮酸(25μg/ml)和安普霉素(50μg/ml)的无菌水将平板覆盖，再在30℃培养48小时，筛选转化子。
(5)提取筛选的转化子的基因组，用PCR验证转化子，从而获得过表达zwf2基因的基因工程菌HP-2(CGMCC No.4132)。
达托霉素基因工程菌的应用，其特征是：
(1)在室温下取玫瑰孢链霉菌Streptomyces roseosporus基因工程菌HP-2的斜面孢子用无菌水制成孢子悬液；
(2)取0.5毫升孢子悬液接种到装有30毫升种子培养基的250毫升的摇瓶中，30℃，180～220rpm摇床中培养48小时，制备种子液；
(3)以1％～4％的接种量，接种到7.5L自动发酵罐中，在发酵培养中30℃培养，在0～30h，控制pH 6.5，溶氧45％；在30h～144h，控制pH 7.0，通气量控制0.8v/v/m，30h时以0.10mL/h的速度开始流加1∶1的癸酸和油酸甲酯溶液，并在96h开始补加甘油，流速为0.25mL/L·h，发酵144小时；
(4)通过HPLC检测发酵液中的达托霉素浓度。
所述的培养基组成及质量含量为：
种子液体培养基组成及质量含量为：糊精1g，葡萄糖0.5g，蛋白胨0.5g，酵母浸粉0.5g，K2HPO4·3H2O 0.05g，MgSO4·7H2O 0.05，CaCO3 0.02g，溶解到1L蒸馏水中，初始pH 7.0。
所述的发酵培养基组成及质量含量为：葡萄糖1.0g/L，糊精3g/L，干酪素1.0g/L，花生饼粉0.6g/L，L-天冬素0.12g/L，K2SO4 0.6g/L，初始pH 7.0。
本发明的达托霉素基因工程菌，为玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)HP-2，与2010年9月2日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号的保藏于中国微生物菌种保藏管理中心，保藏编号分别为CGMCC No.4132。
本发明的效果和作用是：
本发明提供了能提高达托霉素产量的基因工程菌的构建方法。属于基因重组技术。该方法包括以下过程：克隆磷酸戊糖途径第一个关键酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf2，利用大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒表达载体构建重组质粒(如图2)。将重组质粒导入大肠杆菌ET12567中，将ET12567与玫瑰孢链霉菌共培养，通过结合转移的方法转化玫瑰孢链霉菌，然后通过安普霉素抗性筛选转化子，通过PCR进一步确认。本发明构建的玫瑰孢链霉菌基因工程菌HP-2可直接用于达托霉素的工业化生产，可提高产量18％，并可有利于降低分离纯化难度和提高收率，从而显著降低达托霉素生产成本。
附图说明
图1：达托霉素结构及非核糖体蛋白合成酶(NRPS)基因簇示意图；
图2：过表达重组载体构建流程。
具体实施方式
实施例1
基因工程菌HP-2的构建(CGMCC 4132)
设计引物PCR克隆zwf2。(上下游引物分别为：上引：GAGGGCTGCATATGTTGTCTGCTGTTCCC(下划线为NdeI酶切位点)；下引：GTACAATCTAGATCACTTGACGCTCCCTG(下划线为XbaI酶切位点)。将PCR产物和表达载体pIB139分别用NdeI/XbaI双酶切，回收后，将zwf2和pIB139以3∶1～1∶1的比例用T4连接酶在16℃连接2小时构建重组表达载体pIB139-zwf2(如图2)，然后用热激法导入ET12567大肠杆菌感受态细胞，在LB培养基活化培养一小时后涂到安普霉素筛选平板。然后挑取转化子提取质粒严证。然后用结合转移的方法将重组表达载体pIB139-zwf2导入玫瑰孢链霉菌。
具体步骤如下：
(1)将ET12567单克隆挑进10ml含50μg/ml氯霉素，50μg/ml卡那霉素，50μg/ml的安普霉素过夜培养
(2)取1ml过夜培养的菌液接种到50ml含氯霉素，卡那霉素，安普霉素各50mg/ml的培养基中，37℃培养到OD值达到0.5-0.8；
(3)用等体积的不含抗生素的LB培养基清洗2次，重悬于0.1体积的LB培养基中；
(4)在洗大肠杆菌的同时，加大概108个链霉菌的孢子于500μl的2×YT培养基中，50℃下热击10分钟，然后37℃活化2小时；
(5)加500μl大肠杆菌细胞于0.5ml的热击过的孢子或菌丝体中，快速混合，离心。扔掉大部分上清液，重悬细胞；
(6)将混合细胞涂布于含0.01mol/LMgCl2的MS琼脂培养基上，30℃培养16-20h，在涂布之前将MS板于超净风中吹1h，有利于吸掉下一步涂布的水；
(7)用含0.5mg的萘啶酮酸和1mg安普霉素的水覆盖；
(8)挑选转化子于选择性高氏一号培养基上(含有50μg/ml安普霉素和25μg/ml的萘啶酮酸)。
(9)结合转移菌株的筛选：结合转移LB平板上生长2天后，得到了结合转化子，接菌到含50ug/ml的安普霉素和萘啶酮酸的高氏一号选择培养基上，基本确认为接合转移株，但尚需进一步验证，准备接种到液体培养基上培养，提取基因组，利用与载体pIB139多克隆位点两侧序列互补的引物进行PCR验证。
所用的测序引物序列：上引：TTGCGCCCGATGCTAGTCG；下引：GCACGACAGGTTTCCCGACTG
最后将筛选获得的zwf2过表达基因工程菌命名为HP-2。
发酵应用：
在室温下取过表达zwf2基因的玫瑰孢链霉菌基因工程菌HP-2的斜面孢子，用无菌水制成孢子悬液；然后取0.5毫升孢子悬液接种到装有30毫升种子培养基的250毫升的摇瓶中，30℃，180～220rpm摇床中培养48小时；然后以1％～4％的接种量，接种到7.5L自动发酵罐中；然后，30℃，在0～30h，控制pH 6.5，溶氧45％；30h～144h，控制pH 7.0，通气量控制0.8v/v/m，30h时以0.10mL/h的速度开始流加1∶1的癸酸和油酸甲酯溶液，并在96h开始补加甘油，流速为0.25mL/L·h，发酵144小时。通过HPLC监测发酵液中的达托霉素浓度。达托霉素发酵产量达到700mg/L，比出发菌株提高了18％。
Claims (8)
1.过表达zwf2基因提高达托霉素产量的方法及其应用，其特征是利用PCR扩增克隆磷酸戊糖途径第一个关键酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf2，将基因片段连接到过表达载体，然后利用结合转移的方法转化玫瑰孢链霉菌，通过抗生素抗性筛选获得目的基因工程菌。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征是所述表达载体为整合型质粒载体。
3.如权利要求1或2所述的构建方法，其特征是所述表达载体中启动子为ermE*；表述载体的出发载体为pIB139。
4.如权利要求1所述的构建方法，其特征是步骤如下：
(1)设计PCR引物6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf2；
(2)将克隆得到的目的基因插入pIB139的组成型强启动子ermE*下游多克隆位点；
(3)然后将重组质粒导入大肠杆菌ET12567中，以备结合转移之用；
(4)将大肠杆菌ET12567与玫瑰孢链霉菌在MS培养基上37℃共培养20小时，然后用含有萘啶酮酸(25μg/ml)和安普霉素(50μg/ml)的无菌水将平板覆盖，再在30℃培养48小时，筛选转化子；
(5)利用PCR进一步验证转化子，从而获得过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf2的基因工程菌HP-2。
5.达托霉素基因工程菌的应用，其特征是：
(1)在室温下取玫瑰孢链霉菌Streptomyces reseosporus基因工程菌HP-2的斜面孢子用无菌水制成孢子悬液；
(2)取0.5毫升孢子悬液接种到装有30毫升种子培养基的250毫升的摇瓶中，30℃，180～220rpm摇床中培养48小时，制备种子液；
(3)以1％～4％的接种量，接种到7.5L自动发酵罐中，在发酵培养中30℃培养，在0～30h，控制pH 6.5，溶氧45％；在30h～144h，控制pH 7.0，通气量控制0.8v/v/m，30h时以0.10mL/h的速度开始流加1∶1的癸酸和油酸甲酯溶液，并在96h开始补加甘油，流速为0.25mL/L·h，发酵144小时；
(4)通过HPLC检测发酵液中的达托霉素浓度。
6.如权利要求5所述的应用，其特征是所述的培养基组成及质量含量为：
种子液体培养基组成及质量含量为：糊精1g，葡萄糖0.5g，蛋白胨0.5g，酵母浸粉0.5g，K2HPO4·3H2O 0.05g，MgSO4·7H2O 0.05，CaCO3 0.02g，溶解到1L蒸馏水中，初始pH 7.0。
7.如权利要求5所述的应用，其特征是所述的发酵培养基组成及质量含量为：葡萄糖1.0g/L，糊精3g/L，干酪素1.0g/L，花生饼粉0.6g/L，L-天冬素0.12g/L，K2SO4 0.6g/L，初始pH 7.0。
8.达托霉素基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌为玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)HP-2，保藏于中国微生物菌种保藏管理中心，保藏编号分别为CGMCC No.4132。
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