CN102286384A - 能产酸性β-甘露聚糖酶的费希新萨托菌及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种能产酸性β-甘露聚糖酶的费希新萨托菌及应用，一株能产酸性β-甘露聚糖酶的费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)G5，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.4921。本发明提供的能产酸性β-甘露聚糖酶的费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)G5，是一株耐高温，耐酸产酶性能良好的野生菌株，酸性β-甘露聚糖酶的产量为25-40U/ml。在温度60-80℃，最适pH为3.0～4.0，其稳定的性能适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一株产酸性β-甘露聚糖酶的菌株，属于微生物和微生物发酵工程领域。特别是涉及一种费希新萨托菌及该菌在生产酸性β-甘露聚糖酶中的应用。
背景技术
甘露聚糖酶(E.C.3.2.1.78)，属于半纤维素酶，能够随机的催化断裂β-甘露糖苷键，从而对甘露聚糖以及半乳甘露聚糖进行降解。近年来甘露聚糖酶被广泛的应用在各种生产领域中，如作为饲料添加剂应用在饲料工业中，能够起到降解植物种子和细胞壁的作用，从而使营养物质更容易与消化酶进行接触，进而促进动物生长、提高饲料的转化率；在石油开采中，作为压裂液和增黏剂的瓜尔凝胶，使用后需要用甘露聚糖酶降解去除，从而使石油开采连续进行。此外，甘露聚糖酶在造纸工业中可以作为生物漂白剂来漂白纸浆，在食品工业中可以作为甜味剂以及咖啡提取中起降低粘度的作用。另外，通过甘露聚糖酶转化植物多糖产生的寡糖也有很多的益生功能，比如甘露聚糖酶降解甘露聚糖产生的甘露寡糖具有促进肠道内双歧杆菌的增殖，提高机体的抗氧化能力，降低糖尿病人的血糖水平，降低血脂和保护肝脏以及增强机体免疫力等多种生理功能。
到目前为止甘露聚糖酶共有四种来源，植物、真菌、细菌、软体动物。到目前为止有很多关于真菌产甘露聚糖酶的报道，如草酸青霉(Penicillium oxalicum)、黑曲霉(Aspergillusniger)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)。真菌来源的甘露聚糖酶一般为酸性甘露聚糖酶，即最适pH值处在酸性条件下，细菌来源的甘露聚糖酶则为碱性。国内研究产酸性β-甘露聚糖酶最多的菌株是黑曲霉，而费希新萨托菌生产酸性β-甘露聚糖酶的研究还未见报道。
发明内容
本发明的目的提供一株能产酸性β-甘露聚糖酶的费希新萨托菌。
本发明的第二个目的是提供费希新萨托菌在生产酸性β-甘露聚糖酶中的应用。
本发明的技术方案概述如下：
一株能产酸性β-甘露聚糖酶的费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)G5，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.4921，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2011年6月1日。
保藏号为CGMCC No.4921的能产酸性β-甘露聚糖酶的费希新萨托菌(Neosartoryafischeri)G5在生产酸性β-甘露聚糖酶中的应用。
能产酸性β-甘露聚糖酶的费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)G5在生产酸性β-甘露聚糖酶中的应用，其培养条件为：温度为60-80℃，培养基组成为：NaCl 0.4-0.7g/L，CaCl20.4-0.7g/L，瓜尔胶10-15g/L，蛋白胨8-12g/L，酵母粉4-6g/L，MgSO40.5-1.0g/L，KH2PO40.5-1.0g/L，pH 3.0-5.0。
本发明的优点：
本发明提供的能产酸性β-甘露聚糖酶的费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)G5，是一株耐高温，耐酸产酶性能良好的野生菌株，酸性β-甘露聚糖酶的产量为25-40U/ml。在温度60-80℃，最适pH为3.0～4.0，其稳定的性能适合工业化生产。
附图说明
图1为本发明的一株能生产酸性β-甘露聚糖酶的费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)G5CGMCC No.4921在瓜尔胶培养基上的菌体形态图。
图2为G5发酵液粘度和pH随时间的变化。
图3为G5发酵液还原糖含量和菌体干重随时间的变化。
图4为甘露聚糖酶降解瓜尔胶产物的薄层色谱图。
图5为温度和pH对β-甘露聚糖酶的影响。
图6为不同离子和不同氮源对β-甘露聚糖酶的影响。
图7为炭源和氮源浓度对β-甘露聚糖酶的影响。
图8为G5发酵生产β-甘露聚糖酶响应曲面。
具体实施方式
保藏号为CGMCC No.4921的费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)G5是从种植瓜尔豆的土壤中分离得到，培养基中瓜尔胶为唯一炭源。
本发明的提供的费希新萨托菌生产酸性β-甘露聚糖酶的最佳发酵条件，是利用中心组合试验的方法对费希新萨托菌G5发酵生产酸性β-甘露聚糖酶进行优化，结合Design-Expert7.16软件进行数据分析得到的，在优化的条件下本发明的费希新萨托菌G5产β-甘露聚糖酶能力提高一倍。
下面的实施例是为了使本领域的技术人员更好地理解本发明，但不对本发明作任何限制。
实施例1
产β-甘露聚糖酶菌株的分离与鉴定
1.菌株的分离
(1)称取10g土壤样品(从新疆种植瓜尔豆的土壤中取样)，放入装有90mL无菌水的250mL三角瓶中(带玻璃珠)，静置20min后置于200rpm振荡培养箱中充分振荡30min，使细胞充分分散，制成菌悬液；
(2)用5mL移液管吸取上述步骤(1)所得的菌悬液的上清液5mL于45mL无菌水中，混合均匀后进行10倍递减稀释；取10-4、10-5、10-6三个稀释度的菌悬液各100μL，涂布于瓜尔胶固体培养基(瓜尔胶5g，NH4Cl 5g，MgSO4·7H2O1g，KH2PO4，0.5g·L-1；K2HPO4 0.5g，NaCl 0.5g，琼脂20g，加蒸馏水定容至1000mL，pH为7.0)平板上，每个稀释度进行三次平行实验，于37℃恒温培养箱中倒置培养，直至长出菌落后，进行菌落计数；
(3)将上述步骤(2)瓜尔胶培养基平板上分离得到的能利用瓜尔胶为炭源的菌，通过平板划线的方法分离纯化，逐日观察各菌株在瓜尔胶固体培养基平板上生长的情况，挑选生长较好的菌株，然后转接至瓜尔胶固体培养基，于4℃冰箱保藏；
(4)将上述步骤(3)所得的初筛菌株接种至瓜尔胶液体培养基(瓜尔胶5g，NH4Cl 5g，MgSO4·7H2O 1g，KH2PO4，0.5g·L-1；K2HPO4 0.5g，NaCl 0.5g，加蒸馏水定容至1000mL，pH为7.0)，37℃下200rpm振荡培养24h后，发酵液离心得到粗酶液，用DNS法测得粗酶液降解瓜尔胶底物的还原糖含量，将筛选出的高产菌株(还原糖含量高)发酵液用20％(V/V)甘油保存，将其命名为G5；
(5)将上述步骤(4)筛选得到的菌株G5接种至瓜尔胶液体培养基中，37℃下200rpm振荡培养，观察其发酵特性。
实验证明，瓜尔胶固体培养基或瓜尔胶液体培养基的pH也可以采用7.1或7.2。
2.菌株的鉴定
(1)在显微镜下分别通过革兰氏染色法和水浸片法观察细胞形态、大小以及细胞的繁殖分裂方式等情况。并取稀释后菌液以平板涂布法接种至瓜尔胶固体培养基上，置于37℃培养。观察和记录菌落性状、大小、边缘结构、光泽、透明度、颜色和产色素等情况，G5在瓜尔胶培养基上的菌体形态为絮状，淡绿色，产生大量乳白色至淡黄色的闭囊壳，子囊近球形。结果见图1。
(2)取处于对数生长期的液体发酵培养物1.5ml于灭菌后的离心管中，5000r/min离心5min，弃上清。液氮研磨后5000r/min离心5min，与-20℃冷冻，冻实，融化后挑取少量镜检。用试剂盒提取基因组DNA。对提取DNA进行PCR，委托北京三博远志生物技术有限公司进行测序。
(3)应用BLASTN程序与GenBank、EMBL、DDBJ和PDB等数据库中已知的D1/D2区基因保守区序列进行相似性比较分析得知，本发明的G5菌与新萨托菌属亲缘关系较近。菌株G5与费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)亲缘关系最近，分支置信度达到96％，结合菌体形态观察结果可认为G5为一株费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)。
分析其性质后命名为费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)菌株G5，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.4921，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2011年6月1日。
下面将本发明的费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)菌株G5CGMCC No.4921简称菌株G5。
实施例2
菌株G5发酵生产酸性β-甘露聚糖酶的发酵液参数
对菌株G5发酵液从pH、粘度、菌体干重、还原糖含量、发酵产物几个方面分析。
(1)用接种环将菌株G5接种到装有50ml瓜尔胶液体培养基的250ml摇瓶中在37℃，转速200r/min的条件下恒温培养，然后取1ml培养液接种到100ml新的瓜尔胶液体培养基的250ml摇瓶中在37℃，转速200r/min的条件下恒温培养，做两组平行实验，每组接种8瓶，两组平行实验的时间间隔为12小时。
(2)每隔6小时取样(整瓶)分析发酵液的粘性，pH值，和还原糖浓度，菌体干重并绘制曲线。
(3)用乌氏粘度计测发酵上清液的相对粘度，结果见图2。前6小时即发现发酵液粘度已下降85％，随后发酵液粘度继续下降，24小时发酵液粘度已和纯水粘度相差无几。发酵液在前12小时迅速下降，并在24小时达到最低，几乎与水相近，24小时后发酵液粘度略有波动。G5菌在24小时内即可将100ml含0.5％瓜尔胶的发酵液完全降解。
(4)用pHS-2C型pH计测定pH值，结果见图2。发酵液的pH在0～24小时内不断下降，24小时后基本稳定在2.6左右，其中18～24小时下降迅速。
(5)用DNS法还原糖含量。取发酵上清液0.5ml，用蒸馏水稀释至1ml，再加入1ml的DNS试剂，沸水浴15min显色，显色后迅速冷却，用蒸馏水定容至10ml，以空白液作对照，在540nm处测量吸光度。根据标准曲线计算还原糖含量，结果见图3。发酵液还原糖含量随时间不断上升，在27小时达到最大值后又迅速下降，在36小时后基本降到0。
(6)菌体干重。将整瓶发酵液9000r/min离心5分钟，沉淀用蒸馏水冲洗3次，置于40℃恒温箱中烘干至两次称量不超过0.02g，得菌体干重，结果见图3。发酵液中菌体含量随时间不断增长，菌体繁殖旺盛，36小时后基本保持不变，菌体维持生长，50小时后略有下降，菌体开始出现衰老死亡。
(7)用薄层色谱分析法，对发酵产物进行分析。TLC展开剂：V正丁醇∶V异丙醇∶V乙酸∶V水＝7∶5∶2∶4。显色剂：4ml苯胺与4g二苯胺溶于20ml丙酮，再加入20ml浓磷酸。对菌株G5的发酵12h、18h、24h、30h的上清液，以甘露糖、半乳糖为对照进行薄层层析，结果如图4。三条清晰的横向色谱带，且随时间的增加，各条色谱带越来越清晰，颜色越来越深。由各条色谱带的位置可以推断，发酵产物中有单糖和寡糖；由色谱带的颜色可以推断，糖含量随时间增加。
实施例3、温度、pH值、金属离子对酸性β-甘露聚糖酶的影响
(1)DNS法测定酶活。在0.5ml含有0.5％瓜尔胶溶液(用0.05mol/L Na2HPO4-0.025mol/L柠檬酸缓冲液配制)中加入0.5ml粗酶液(水浴在不同的反应温度下)，反应10min后，再加入DNS试剂1ml，沸水浴15min，显色，然后迅速冷却，用蒸馏水定容至10ml，以空白液为对照，在540nm处测定吸光度，计算还原糖量。根据单位时间还原糖的增加量及酶活力单位的定义计算出酶的活性。
酶活力定义：在本实验条件下，一每分钟水解底物产生1μmol相当于D-甘露糖的还原糖的酶量定义为一个β-甘露聚糖酶单位(U/m1)。
(2)β-甘露聚糖酶的pH稳定性实验。将不同pH值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)的柠檬酸缓冲液配制的酶液与相应pH的底物在37℃恒温水浴条件下反应10分钟，测其酶活，结果见图5。结果表明pH在3～4之间时，酶活能维持在较高水平，而且，当pH＝4时酶活达到最大，在碱性条件下G5β-甘露聚糖酶活力极低。
(3)在最佳的pH条件下，将反应体系至于不同的水浴温度(20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、)下反应10分钟，测其酶活，结果见图5。最适反应温度为70℃，40-80℃酶活力稳定。
(4)配制0.1mol/L的MgSO4、KCl、NaCl、CaCl2、MnSO4、FeCl2、ZnCl2溶液。各取1ml，与最佳pH下的酶液0.5ml，最佳pH下的底物0.5ml混合，在最佳温度下反应10min，DNS法测生成的还原糖量，计算酶活。结果见图6，Mg2+，Mn2+，Zn2+可以强烈抑制酶活；K+，Na+可以轻微抑制酶活；而Ca2+可以轻微激活β-甘露聚糖酶。
实施例4、菌株G5生产酸性β-甘露聚糖酶最优条件
(1)首先考察氮源种类，炭源浓度和氮源浓度对酶产量的影响，结果见图7。最佳氮源选为蛋白胨，最适浓度为1％～2％；最佳炭源选为瓜尔胶，最适浓度为1.3％。
(2)选取可能影响甘露聚糖酶产量的八个因素，CaCl2、NaCl、MgSO4、瓜尔胶、KH2PO4、蛋白胨、酵母粉、pH。用Design-expert 7.0进行PB设计，设计结果见表1
表1PB设计和实验结果
实验获得的数据用Design-expert 7.0进行分析得到两个影响酶产量的显著因素，NaCl和CaCl2，置信度95％。软件分析得到的线性回归方程为：
Y＝16.92+0.14X1-9.34X2+0.18X3+0.006X4-0.56X5+17.18X6-0.82X7+1.06X8决定系数为96.76％。
(3)根据步骤(2)中获得的两个显著因素设计中心组合实验来进一步优化培养条件。通过最速上升实验确定中心点，NaCl 0.6g/L、CaCl20.5g/L见表2。
表2最速上升实验设计和结果
中心点确定后用Design-expert 7.0设计13组中心组合实验，按照设计的培养基配方制备培养基进行发酵实验，测得酶活力结果见表3。
表3中心组合实验设计和结果
实验结果用Design-expert 7.0进行分析得到二次回归方程：
Y＝30.651-0.696x1+5.291x2-1.578x1 2-0.49x2 2+0.756x1x2数据拟合度为96.05％。该模型的响应曲面图见图8，由该模型获得优化最佳结果为NaCl 0.6g/L，CaCl20.6g/L，最大酶活力为35.453U/mL。
在五种不同的培养条件下测定酶活力的范围
(1)取对数期的G5菌种子培养液1ml接种到含有50ml发酵培养基1(NaCl 0.4g/L，CaCl20.7g/L，瓜尔胶10g/L，蛋白胨12g/L，酵母粉4g/L，MgSO40.5g/L，KH2PO41.0g/L，加蒸馏水定容至1000ml，pH 3.0)的250ml摇瓶中，做两组平行60℃培养24小时，测得平均酶活力为30.281U/ml。
(2)取对数期的G5菌种子培养液1ml接种到含有50ml发酵培养基2(NaCl 0.5g/L，CaCl20.6g/L，瓜尔胶11g/L，蛋白胨11g/L，酵母粉4.5g/L，MgSO40.6g/L，KH2PO40.9g/L，加蒸馏水定容至1000ml，pH 3.5)的250ml摇瓶中，做两组平行65℃培养24小时，测得平均酶活力为33.239U/ml。
(3)取对数期的G5菌种子培养液1ml接种到含有50ml发酵培养基3(NaCl 0.6g/L，CaCl20.6g/L，瓜尔胶13g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，MgSO40.8g/L，KH2PO40.8g/L，加蒸馏水定容至1000ml，pH 4.0)的250ml摇瓶中，做两组平行70℃培养24小时，测得平均酶活力为35.545U/ml。
(4)取对数期的G5菌种子培养液1ml接种到含有50ml发酵培养基4(NaCl 0.6g/L，CaCl20.5g/L，瓜尔胶14g/L，蛋白胨9g/L，酵母粉5.5g/L，MgSO40.9g/L，KH2PO40.6g/L，加蒸馏水定容至1000ml，pH 4.5)的250ml摇瓶中，做两组平行75℃培养24小时，测得平均酶活力为32.015U/ml。
(5)取对数期的G5菌种子培养液1ml接种到含有50ml发酵培养基5(NaCl 0.7g/L，CaCl20.4g/L，瓜尔胶15g/L，蛋白胨8g/L，酵母粉6g/L，MgSO41.0g/L，KH2PO40.5g/L，加蒸馏水定容至1000ml，pH 5.0)的250ml摇瓶中，做两组平行80℃培养24小时，测得酶平均活力为27.297U/ml。
费希新萨托菌G5能分泌酸性β-甘露聚糖酶。酸性β-甘露聚糖酶耐热性能良好，最适温度70℃；最适pH为3.0-4.0；Mg2+，Mn2+，Zn2+可以强烈抑制酶活；K+，Na+可以轻微抑制酶活；而Ca2+可以轻微激活β-甘露聚糖酶。
Claims (3)
1.一株能产酸性β-甘露聚糖酶的费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)G5，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.4921。
2.能产酸性β-甘露聚糖酶的费希新萨托菌CGMCC No.4921在生产酸性β-甘露聚糖酶中的应用。
3.根据权利要求2所述能产酸性β-甘露聚糖酶的费希新萨托菌CGMCC No.4921在生产酸性β-甘露聚糖酶中的应用，其特征是培养条件为：温度为60-80℃，培养基组成为：NaCl0.4-0.7g/L，CaCl20.4-0.7g/L，瓜尔胶10-15g/L，蛋白胨8-12g/L，酵母粉4-6g/L，MgSO40.5-1.0g/L，KH2PO40.5-1.0g/L，pH 3.0-5.0。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20111221 |