CN102286382B - 一种降解叶绿素的菌株及降解方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种降解叶绿素的菌株及降解方法。中国典型培养物保藏中心确定的名称为：曲霉GLHZB319(Aspergillus GLHZB319)，保藏号CCTCC NO：M 2011101，通过微生物发酵的方法来降解植物上的残留叶绿素。本发明在菌株发酵降解叶绿素的过程中不需要添加额外的碳源和氮源以及无机钠盐，菌株在生长发育过程中可以利用叶绿素为底物降解叶绿素，它对叶绿素具有降解速度快、降解率高、成本低、无残留、无污染、安全环保的特点，可以部分代替目前天然产物提取工艺中的脱色树脂。
Description
技术领域
本发明涉及生命科学、生物技术、生物工程、生物化工领域，特别是一种降解叶绿素的菌株及降解方法。
背景技术
叶绿素存在于植物叶片叶绿体的膜上，是绿色植物进行光合作用的场所，包括叶绿素a和叶绿素b。叶绿素的分子结构由叶醇基和镁卟啉构成，镁卟啉由一个镁离子和四个吡咯环上的氮结合而成。此外植物叶绿素的镁卟啉化学结构和动物红血球的铁卟啉极为相似，适量补充叶绿素对意外失血者的造血功能恢复有很好的帮助。
在当代社会中有相当一部分的工业原料、食品、保健品及药物来自于绿色植物，由于传统的叶绿素降解方法存在着一定的难度和局限性，一定程度上直接增大了这些产品的生产成本。目前工业上脱除叶绿素的方法主要有：①物理吸附法：包括大孔树脂吸附法和活性炭吸附法；②化学氧化法：包括双氧水氧化脱色法和次氯酸钠氧化脱色法。两种降解叶绿素方法都有一定的局限性。如：①大孔树脂法吸附色素成本高，树脂不能多次重复利用，废弃的树脂对环境存在着污染；活性炭吸附法存在着吸附量少且使用局限性(对食品和药品不适用)，废弃活性炭难于处理等问题。物理吸附法在吸附叶绿素的同时，被提取的有效成分也部分的被吸附，有效成分不能完全解吸下来，因此两种方法都不可避免地造成有效成分提取率的下降。②双氧水或次氯酸钠脱色法原理是它们作为氧化剂将叶绿素氧化成非绿色产物。由于是氧化法，所以往往在叶绿素被氧化时，有效成分也不同程度地被氧化；另外双氧水或次氯酸钠在成品中都有残留，造成对产品的污染。
发明内容
本发明的目的是针对上述情况，提供一种降解叶绿素的菌株及降解方法。
本发明的菌株在土豆琼脂培养基(PDA)上菌落最初为白色绒毛状，后变为绿色、暗绿色，外观呈绒毛状。在显微镜下观察此菌株的孢子梗没有分支，孢子梗顶端膨大为近似圆状形，另外还发现它的无形繁殖不产生次生小柄，分生孢子主要集中在孢子梗的上半部并且呈串珠状散开，分生孢子呈圆形或卵圆形以扇形状生长。参照《真菌的形态和分类》(戴芳澜1987版)和《真菌鉴定手册》(魏景超1979版)将本发明菌株种属定在曲霉属。中国典型培养物保藏中心确定的分类命名为：曲霉GLHZB319(Aspergillus GLHZB319)，保藏编号为CCTCC NO：M2011101；保藏单位为：武汉大学中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址为：湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学；保藏日期为：2011年4月6日。
一、曲霉GLHZB319菌株的制备方法为：
取有落叶的土壤0.50-2.00g，加入盛有25mL无菌水的三角瓶中，振荡1-3min，使土壤均匀分散后得到土壤悬浮液；吸取土壤悬浮液3-5滴，滴于用80％丙酮提取的单一叶绿素和琼脂平板培养基上，用涂布环涂布均匀，30℃恒温培养2-4d后检查平板培养结果；能在平板上生长并产生透明圈的菌株，将通过它在80％丙酮提取的单一叶绿素水溶液中的发酵效果来进一步确认，发酵条件：温度30℃、自然pH、转速100r/min，发酵效果最好的为曲霉GLHZB319菌株。
二、用曲霉GLHZB319菌株降解叶绿素的具体步骤为：
(1)制备培养基
称取去皮土豆200.00g，并将土豆切成1-3cm的方块，加水1L后加热煮沸30min，之后冷却至室温；用三层纱布过滤，定容滤液至1L；
(2)取出步骤(1)的滤液0.1L于250ml的三角瓶中，向瓶内加入1.50-2.00g的琼脂粉，用牛皮纸包扎瓶口，在1.103MPa、121℃下灭菌20min，取出后迅速倒入玻璃培养皿内，加盖；待琼脂凝固后为固体培养基，然后在无菌条件下接入曲霉GLHZB319菌株，在30℃的生化培养箱中培养一周后放置在4℃冰箱保藏；
(3)将步骤(1)剩余的0.9L滤液转移至1.5L锥形瓶内，用牛皮纸包扎瓶口，在灭菌锅中灭菌20min，得到发酵培养基；
(4)曲霉GLHZB319菌株发酵培养
在无菌条件下，用打孔器在步骤(2)的产物上打孔一个，接种到从步骤(3)制得发酵培养基中，在30℃下摇床振荡发酵培养2-3天后为发酵液；曲霉GLHZB319菌株小饼：直径0.6cm，厚度0.3-0.6cm，摇床振荡速度100r/min；
(5)取附有叶绿素的植物8-10.00g，于250mL的三角瓶内，将步骤(4)得到的发酵液取出0.1L倒入瓶内，用牛皮纸包扎瓶口；在振荡速度为100r/min的摇床上振荡培养1天，植物上的叶绿素即被完全降解。
本发明在菌株发酵降解叶绿素的过程中不需要添加额外的碳源和氮源以及无机钠盐，菌株在生长发育过程中可以利用叶绿素为底物生长繁殖，它对叶绿素具有降解速度快、降解率高、成本低、无残留、无污染、安全环保等特点，可以部分代替目前天然产物提取工艺中的脱色树脂。
附图说明
图1为本发明曲霉GLHZB319菌株的菌落形态图。
图2为本发明曲霉GLHZB319菌株在显微镜下孢子梗形态图(10×40倍)。
图3为本发明曲霉GLHZB319菌株在显微镜下菌丝形态图(10×10倍)。
图4为本发明曲霉GLHZB319菌株在显微镜下菌丝形态图(10×4倍)。
图5为本发明曲霉GLHZB319菌株对叶绿素水溶液的降解前后对照图，图中左边为降解前。
图6为本发明曲霉GLHZB319菌株对被叶绿素污染的剑麻纤维降解前后剑麻纤维表面对照图(10×4倍)，图中左边为降解前。
具体实施方式
实施例：
一、曲霉GLHZB319菌株的制备方法为：
取有落叶的土壤1.00g，加入盛有25mL无菌水的三角瓶中，振荡1min，使土壤均匀分散后得到土壤悬浮液；吸取土壤悬浮液4滴，滴于用80％丙酮提取的单一叶绿素和琼脂配制的平板培养基上，用涂布环涂布均匀，30℃恒温培养3d后检查平板培养结果；能在平板上生长并产生透明圈的菌株，将通过它在80％丙酮提取的单一叶绿素水溶液中的发酵效果来进一步确认，发酵条件：温度30℃、自然pH、转速100r/min，发酵效果最好的为曲霉GLHZB319菌株。
曲霉GLHZB319菌株特征：在土豆琼脂培养基(PDA)上菌落最初为白色绒毛状，后变为绿色、暗绿色，外观呈绒毛状。在显微镜下观察此菌株的孢子梗没有分支，孢子梗顶端膨大为近似圆状形，另外还能发现它的无形繁殖不产生次生小柄，分生孢子主要集中在孢子梗的上半部并且成串珠状散开，分生孢子呈圆形或卵圆形以扇形状生长。
二、用曲霉GLHZB319菌株降解叶绿素的具体步骤为：
(1)制备培养基
称取去皮土豆200.00g，并将土豆切成约2cm左右的方块，加水1L后加热煮沸30min，之后冷却至室温；用三层纱布过滤，定容滤液至1L；
(2)取出步骤(1)的滤液0.1L于250ml的三角瓶中，向瓶内加入1.50g的琼脂粉，用牛皮纸包扎瓶口，在1.103MPa、121℃下灭菌20min，取出后迅速倒入玻璃培养皿内，加盖；待琼脂凝固后为固体培养基，然后在无菌条件下接入曲霉GLHZB319菌株，在30℃的生化培养箱中培养一周后放入4℃冰箱保存；
(3)将步骤(1)剩余的0.9L滤液转移至1.5L锥形瓶内，用牛皮纸包扎瓶口，在灭菌锅中灭菌20min，得到发酵培养基；
(4)曲霉GLHZB319菌株的发酵培养
在无菌条件下，用打孔器在步骤(2)的产物上打孔一个，接种到步骤(3)得到的发酵培养基中，在30℃下摇床振荡发酵培养3天，为发酵液；曲霉GLHZB319菌株小饼：直径0.6cm，厚度0.5cm，摇床振荡速度100r/min；
(5)取附有叶绿素的剑麻纤维10.00g，剑麻纤维长度为10-15cm，放于250mL的三角瓶内，将步骤(4)制得的发酵液取出0.1L倒入瓶内，用牛皮纸包扎瓶口。在振荡速度为100r/min的摇床上振荡培养1天，图6为本发明曲霉GLHZB319菌株对被叶绿素污染的剑麻降解前后剑麻表面对照图，处理后的剑麻纤维变白、变软、无麻糠和叶绿素附着。
Claims (2)
1.一种能够降解叶绿素的曲霉菌株(Aspergillus)，其特征在于中国典型培养物保藏中心将该菌株确定的名称为：曲霉GLHZB319即AspergillusGLHZB319，该菌株已经保藏在中国典型培养物保藏中心，地点武汉，保藏编号：CCTCC NO：M2011101。
2.一种用权利要求1所述的曲霉菌株降解叶绿素的方法，其特征在于具体步骤为：
(1)称取去皮土豆200.00g，并将土豆切成1-3cm的方块，加水1L后加热煮沸30min，之后冷却至室温；用三层纱布过滤，定容滤液至1L；
(2)取出步骤(1)的滤液0.1L于250ml的三角瓶中，向瓶内加入1.50-2.00g的琼脂粉，用牛皮纸包扎瓶口，在1.103MPa、121℃下灭菌20min，取出后迅速倒入玻璃培养皿内，加盖；待琼脂凝固为固体培养基后，在无菌条件下接入GLHZB319曲霉菌株，在30℃的生化培养箱中培养一周，之后放置于4℃冰箱保藏；
(3)将步骤(1)剩余的0.9L滤液转移至1.5L锥形瓶内，用牛皮纸包扎瓶口，在灭菌锅中灭菌20min，得到发酵培养基；
(4)在无菌条件下，用打孔器在步骤(2)上打孔，制备菌株小饼，每个小饼直径0.6cm，厚度0.3-0.6cm；接种到步骤(3)制得发酵培养基中，在30℃下摇床振荡发酵培养2-3天，摇床振荡速度100r/min，为发酵液；
(5)取附有叶绿素的植物材料8.00-10.00g，于250mL的三角瓶内，将步骤(4)得到的发酵液0.1L倒入瓶内，用牛皮纸包扎瓶口；在振荡速度为100r/min的摇床上振荡培养1天，材料上的叶绿素即被完全降解。
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