CN102274690A - 一种毛细管电泳缓冲液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种毛细管电泳缓冲液及其制备方法。本发明提供的电泳缓冲液，pH为7.5-8.5，溶剂是水，溶质包括一种阴离子和金属螯合剂；所述阴离子与所述金属螯合剂的配比为(12.164-48.656)g∶(0.8-1.2)mmol；所述阴离子为N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸和/或N-三(羟甲基)甲氨基-2-氨基丙磺酸。实验证明，用本发明的缓冲液进行毛细管电泳基本能够获得理想的分型图谱(均如图1所示)，并且本发明的缓冲液的效果好，即降低电渗作用、稳定性、重复性都优于其他缓冲液。

Description

一种毛细管电泳缓冲液及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种毛细管电泳缓冲液及其制备方法。

背景技术

毛细管电泳作为一种重要分子生物学技术，已被广泛的用于不同生物分子(DNA、RNA、蛋白质等)的分离。

DNA测序及DNA片段分析等都基于电泳这种技术。在碱基测序过程中，需将DNA产物变性形成DNA样本的单链结构，继而通过毛细管电泳使不同片段长度的单链DNA分子分离以实现DNA序列的测定及特定DNA片段分离及检测。

在STR遗传标记分析过程中，同样需将DNA特定位点的荧光标记产物变性成DNA样本的单链结构，继而通过毛细管电泳将不同长度且不同荧光的DNA片段分离，通过后续软件分析以实现遗传鉴定。

目前，在DNA片段分离及检测最常见的检测设备主要是美国ABI公司的

310、3100、3100-Avant、3130和3130xl型遗传分析仪等。上述仪器均属于毛细管电泳仪，该类仪器在电泳时其正负电极需要放置电泳缓冲液。缓冲液的缓冲能力及维持电流稳定的能力决定着全部电泳过程的稳定性及电泳结果的可靠性与重复性。

缓冲溶液就是具有缓冲能力的溶液，提供稳定的pH值，使电渗流稳定，如果样品带电，那么样品所带电荷也是稳定的，从而使得结果可重复性增强。

发明内容

本发明的目的在于提供一种毛细管电泳缓冲液。

本发明提供的电泳缓冲液，pH为7.5-8.5，溶剂是水，溶质包括一种阴离子和金属螯合剂；所述阴离子与所述金属螯合剂的配比为(12.164-48.656)g∶(0.8-1.2)mmol；所述阴离子为N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸和/或N-三(羟甲基)甲氨基-2-氨基丙磺酸。

上述阴离子、所述金属螯合剂与水的配比为(20-30)g∶(0.8-1.2)mmol∶(90-110)ml，优选为(24.328-25.93)g∶1mmol∶100ml。

上述溶质是所述阴离子和金属螯合剂；所述金属螯合剂优选为EDTA。

上述溶质还包括一种阳离子；所述阳离子为双(三羟甲基)氨基甲烷；所述阳离子与所述阴离子的摩尔比为1∶1。

上述溶质是所述阴离子、所述阳离子和金属螯合剂；所述金属螯合剂优选为EDTA。

本发明的另一目的在于提供一种溶胶缓冲液。

本发明提供的溶胶缓冲液是用上述电泳缓冲液制备得到的。

上述溶胶缓冲液是将上述电泳缓冲液与尿素、2-吡咯烷酮混合制备得到；所述电泳缓冲液与尿素、2-吡咯烷酮的配比是：(8-12)ml∶(45-52)g∶(3-8)ml；优选配比是：10ml∶48g∶5ml。

本发明的又一目的在于提供一种电泳溶胶。

本发明的电泳溶胶是用有机聚合物与上述溶胶缓冲液混合制备得到。

上述有机聚合物与上述溶胶缓冲液的配比是(2-5)g∶100ml，优选是4g∶100ml；所述电泳溶胶的pH为7.5-8.5；所述有机聚合物优选为聚N，N-二甲基丙烯酰胺、聚丙烯酰胺和/或聚N，N-二甲基丙烯酰胺。

上述电泳缓冲液、上述溶胶缓冲液或上述电泳溶胶在毛细管电泳中的应用均属于本发明的保护范围。

实验证明，实施例2，3中缓冲液在被用作毛细管电泳缓冲液之初时，在实验结果上与实施例1缓冲液无显著性差异，基本能够获得理想的分型图谱(均如图1所示)，且无优劣之分。但添加了双(三羟甲基)氨基甲烷的实施例1的缓冲液在电泳次数达到一定程度时候，会比实施例2，3中单纯由TAPS与EDTA组成的电泳缓冲液表现的更加稳定，能够具有较多的使用次数(图2-图7)。

将本发明的电泳缓冲液换成TAE缓冲液、TBE缓冲液或TPE缓冲液进行毛细管电泳得不到标准DNA样品9947A的正确DNA分型(图8-图10)，而实施例1中电泳缓冲液能得到标准DNA样品9947A的正确DNA分型(图11)，进一步说明本发明的缓冲液的效果好，即降低电渗作用、稳定性、重复性都优于其他缓冲液。

附图说明

图1为利用实施例1缓冲液的Typer^TM500分子量内标的STR分型图谱。

图2为用实施例2的电泳缓冲液进行电泳，阳极pH值实时监测结果。

图3为用实施例2的电泳缓冲液进行电泳，进行第48组样本检测时实时荧光监测结果。

图4为用实施例3的电泳缓冲液进行电泳，阳极pH值实时监测结果。

图5为用实施例3的电泳缓冲液进行电泳，进行第64组样本检测时实时荧光监测结果。

图6为用实施例1的电泳缓冲液进行电泳，阳极pH值实时监测结果。

图7为用实施例1的电泳缓冲液进行电泳，进行第80组样本检测时实时荧光监测结果。

图8为利用TAE作为电泳缓冲液的标准DNA样品9947A的STR分型图谱。

图9为利用TBE作为电泳缓冲液的标准DNA样品9947A的STR分型图谱。

图10为利用TPE作为电泳缓冲液的标准DNA样品9947A的STR分型图谱。

图11为利用实施例1电泳缓冲液的标准DNA样品9947A的STR分型图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、

一、10×电泳缓冲液配制

1、在含80mL去离子水的容器中加入20.924g双(三羟甲基)氨基甲烷和24.328gN-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸。

2、在磁力搅拌器上混匀。

3、再加入2mL 0.5M EDTA溶液。

4、用NaOH溶液(4M)调节pH到8，最后用去离子水定容至100mL。

5、用孔径0.2um膜过滤(除去样品中颗粒性杂质)，得到10×电泳缓冲液，分装后4℃保存。

二、溶胶配制

1、溶胶缓冲液配制

①取实施例1上述步骤制备得到的10×电泳缓冲液10ml，加入40ml去离子水；

②然后用天平称量48g尿素(8M)加入上述溶液中，搅拌溶解后；

③再加入5mL 2-吡咯烷酮(分析纯)，最后定容至100mL，得到溶胶缓冲液(pH值为8)，放入4℃冰箱冷藏。

2、溶胶(凝胶)获得

④称取4g制备的白色固体聚N，N-二甲基丙烯酰胺加入步骤③得到溶胶缓冲液中，然后再加入搅拌子，过夜搅拌使其充分溶解；

⑤然后用0.22μm的滤膜过滤，得到溶胶(pH值为8)，在4℃冰箱冷藏。

实施例2、

一、10×缓冲液配制

1、在含80mL去离子水的容器中加入24.43g N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸。

2、在磁力搅拌器上混匀。

3、再加入2mL 0.5M EDTA溶液。

4、用NaOH溶液(4M)调节pH到8，最后去离子水定容100mL。

5、用孔径0.2um膜过滤，得到10×电泳缓冲液，分装后4℃保存。

二、溶胶配制

1、溶胶缓冲液配制

①取实施例2上述步骤制备得到的10×电泳缓冲液10ml，加入40ml去离子水

②然后用天平称量48g尿素(8M)加入上述溶液中，搅拌溶解后；

③再加入5mL 2-吡咯烷酮(分析纯)，最后定容至100mL，得到溶胶缓冲液(pH值为8)，放入4℃冰箱冷藏。

2、溶胶获得

④称取4g制备的白色固体聚N，N-二甲基丙烯酰胺加入步骤③得到溶胶缓冲液中，然后再加入搅拌子，过夜搅拌使其充分溶解。

⑤然后用0.22μm的滤膜过滤，得到溶胶(pH值为8)，在4℃冰箱冷藏

实施例3、缓冲液的配制方法如下

一、10×缓冲液配制

1、在含80mL去离子水的容器中加入25.93g N-三(羟甲基)甲氨基-2-氨基丙磺酸。

2、在磁力搅拌器上混匀。

3、混匀过程中再加入2mL 0.5M EDTA溶液。

4、用NaOH溶液(4M)调节pH到8，最后去离子水定容100mL。

5、用孔径0.2um膜过滤，得到电泳缓冲液，分装后4℃保存。

二、溶胶配制

1、溶胶缓冲液配制

①取实施例3上述步骤制备得到的电泳缓冲液10ml，加入40ml去离子水；

②然后用天平称量48g尿素(8M)加入上述溶液中，搅拌溶解后；

③再加入5mL 2-吡咯烷酮(分析纯)，最后定容至100mL，得到溶胶缓冲液(pH值为8)，放入4℃冰箱冷藏。

2、溶胶获得

④称取4g制备的白色固体聚N，N-二甲基丙烯酰胺加入步骤③得到溶胶缓冲液中，然后再加入搅拌子，过夜搅拌使其充分溶解。

⑤然后用0.22μm的滤膜过滤，得到溶胶(pH值为8)，在4℃冰箱冷藏

实施例4、缓冲液的应用

一、实施例1缓冲液的应用

1.分别取实施例1中配制的10×电泳缓冲液10ml，加入90ml去离子水稀释至100ml，形成电泳缓冲液；

2.将ABI公司3130xl遗传分析仪阳极杯取下，加入步骤1的电泳缓冲液至刻度线；

3.将阴极缓冲液池中加入步骤1的电泳缓冲液至刻度线；

4.取20μl Typer^TM500分子量内标(购自公安部物证鉴定中心)与1ml去离子甲酰胺均匀混合，取10μl分装至96孔进样板；

5.将实施例1制备的凝胶装入胶瓶中，并将注胶管置于胶瓶中，固定好，启动自动换胶系统。

6.设定进样电压为15kv，进样时间为10s；

7.其余按照操作说明书进行操作。

其电泳结果如图1所示，采用本发明的缓冲液不同时间对Typer15内标Typer500的电泳，结果表明实施例1制备的缓冲液能够在电泳过程中显著改善DNA片段分析的稳定性和重复性。

二、实施例2或实施例3缓冲液的应用

本步骤与上述步骤一的区别在于：将实施例1的电泳缓冲液和凝胶换成实施例2或3的电泳缓冲液和凝胶，其余步骤相同。

结果显示，实施例2，3中缓冲液在被用作毛细管电泳缓冲液之初时，在实验结果上与实施例1缓冲液无显著性差异，基本能够获得理想的分型图谱(均如图1所示)，且无优劣之分。

但添加了双(三羟甲基)氨基甲烷的实施例1的缓冲液在电泳次数达到一定程度时候，会比实施例2，3中单纯由TAPS与EDTA组成的电泳缓冲液表现的更加稳定，能够具有较多的使用次数。

实施例2，3中电泳缓冲液大约能够进行40-70组样本的检验(约合640-1120个样本，每组16个样本)的检验，因为缓冲液在使用的过程中会出现，阳极pH变酸，阴极pH变碱的现象，大量研究结果表明，与阴极pH变化相比，阳极的pH变化跨度较大一般由8降至4.5左右。同时，研究发现阳极pH的变化与缓冲液使用次数呈现极高的相关性。因此，对阳极pH的实时监测是十分必要的。其中，用实施例2的电泳缓冲液进行电泳，阳极pH值实时监测结果如图2所示，进行第48组样本检测时实时荧光监测结果如图3所示，其中近半数的电泳孔道出现条带拖尾现象；用实施例3的电泳缓冲液进行电泳，阳极pH值实时监测结果如图4所示，进行第64组样本检测时实时荧光监测结果如图5所示，实施例3其使用次数已明显超过实施例2缓冲液，表明缓冲中TAPS的浓度的升高能够在一定程度上维持更稳定的阳极Ph，或者可以说是阻碍阳极的变酸趋势。

当采用实施例1中配置的缓冲液时，阳极pH值实时监测结果如图6所示，进行第80组样本检测时实时荧光监测结果如图7所示。监测结果表明实施例1缓冲液能够更稳定的维持阳极的pH值，当电泳次数达到80时，仅出现2-3道拖尾现象产生。表明，buffer的性能更优于实施例2和3的缓冲液。

三、现有技术中常用的缓冲液的对照

将实施例4步骤一步骤1-3中的电泳缓冲液换成TAE缓冲液、TBE缓冲液或TPE缓冲液，相应配制成3种对照缓冲液，然后将Typer^TM500分子量内标换成标准DNA样品9947A(购自ABI公司)的扩增产物，分别重复上述实验。结果如图8-图10所示，分型结果显示TAE、TBE和TPE作为电泳缓冲液时，得不到标准DNA样品9947A的正确DNA分型(图8-图10)。而实施例1中电泳缓冲液能得到标准DNA样品9947A的正确DNA分型(图11)，进一步说明本发明的缓冲液的效果好，即降低电渗作用、稳定性、重复性都优于其他缓冲液。

Claims (10)

1.电泳缓冲液，pH为7.5-8.5，溶剂是水，溶质包括一种阴离子和金属螯合剂；

所述阴离子与所述金属螯合剂的配比为(12.164-48.656)g∶(0.8-1.2)mmol；

所述阴离子为N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸和/或N-三(羟甲基)甲氨基-2-氨基丙磺酸。

2.如权利要求1所述的电泳缓冲液，其特征在于：所述阴离子、所述金属螯合剂与水的配比为(20-30)g∶(0.8-1.2)mmol∶(90-110)ml，优选为(24.328-25.93)g∶1mmol∶100ml。

3.如权利要求1或2所述的电泳缓冲液，其特征在于：所述溶质是所述阴离子和金属螯合剂；所述金属螯合剂优选为EDTA。

4.如权利要求1或2所述的电泳缓冲液，其特征在于：所述溶质还包括一种阳离子；所述阳离子为双(三羟甲基)氨基甲烷；所述阳离子与所述阴离子的摩尔比为1∶1。

5.如权利要求4所述的电泳缓冲液，其特征在于：所述溶质是所述阴离子、所述阳离子和金属螯合剂；所述金属螯合剂优选为EDTA。

6.一种溶胶缓冲液，是用权利要求1-5中任一所述电泳缓冲液制备得到的。

7.如权利要求7所述的溶胶缓冲液，其特征在于：所述溶胶缓冲液是将权利要求1-5中任一所述电泳缓冲液与尿素、2-吡咯烷酮混合制备得到；所述权利要求1-5中任一所述电泳缓冲液与尿素、2-吡咯烷酮的配比是：(8-12)ml∶(45-52)g∶(3-8)ml；优选配比是：10ml∶48g∶5ml。

8.一种电泳溶胶，是用有机聚合物与权利要求6或7所述溶胶缓冲液混合制备得到。

9.如权利要求8所述的电泳溶胶，其特征在于：所述有机聚合物与权利要求6或7所述溶胶缓冲液的配比是(2-5)g∶100ml，优选是4g∶100ml；所述电泳溶胶的pH为7.5-8.5；所述有机聚合物优选为聚N，N-二甲基丙烯酰胺、聚丙烯酰胺和/或聚N，N-二甲基丙烯酰胺。

10.权利要求1-5中任一所述电泳缓冲液、权利要求6或7所述溶胶缓冲液或权利要求8或9所述电泳溶胶在毛细管电泳中的应用。

Images