CN102274002B - 一种在位无损检测肿瘤的试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医学、药学和分析检测技术领域，具体涉及一种在位无损检测肿瘤的试剂盒及其制备方法。其特征是本发明的无损检测肿瘤的试剂盒，由壳聚糖胶束磷酸缓冲溶液构成，所述壳聚糖胶束内部包埋有疏水性硫化铅量子点。本发明的试剂盒操作简单、光量子产率高、光稳定性强、生物相容性好，同时具有增加疏水性量子点的溶解度、肿瘤靶向、可以进行无损在位实时监测等特点，因此更适合用作肿瘤的在位成像与检测。

Description

一种在位无损检测肿瘤的试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及医学、药学和分析检测技术领域，具体涉及一种在位无损检测肿瘤的试剂盒及其制备方法，适用于无损在位肿瘤的荧光检测。

背景技术

肿瘤及相关疾病的诊断迄今所依赖的主要是一些离体检测方法以及超声波、X射线、CT、核磁共振成像和PET等影像学技术。癌症的确诊目前也主要以肿瘤组织或病变细胞的形态和其它宏观特征为依据，这往往是一个侵入性和耗时的过程，不适于癌症的早期诊断。因此，迄今癌症的早期诊断仍然是医学界面临的一个空前挑战。光学成像方法，特别是荧光成像方法具有对人体无害、非侵入、高灵敏和可进行在位多目标成像的优点，随着荧光指示物的不断拓展和检测方法的不断创新，有望实现无损在位癌症的检测。近红外荧光成像技术是近年来发展起来的一种新型荧光成像手段。该技术所应用的近红外波段(700-900nm)避开了很多内源性物质(有氧血红蛋白，去氧血红蛋白，水等)的主要吸收区，因而在生物组织中的穿透深度较大(可达10cm)，并且该波段荧光受生物组织本底的影响较少，其在位无损连续监测生物组织特性的潜力在生命科学的前沿领域得到充分地重视。

量子点(quantum dot，QDs)是近年来发展的一类新型的无机纳米荧光探针，其粒径约为1-50nm，具有激发光谱宽，发射波长可“调谐”且对称，光稳定性高，荧光寿命长等优点。这些优势使量子点在生命科学领域中显示出巨大的应用价值。目前合成高质量的量子点通常采用在有机相合成的方法，其表面一般都带有疏水基团，因此在水溶液中容易聚集，这就限制了量子点的生物应用尤其是生物体内的应用。为了解决该问题，科研工作者对量子点表面进行化学修饰使其能在水相中均匀分散(Smith AM，Duan H，Mohs AM，Nie S.Bioconjugatedquantum dots for in vivo molecular and cellular imaging.Adv Drug Deliv Rev.2008，60，1226-40.)。CN101629076A公开了一种二氧化硅包被荧光量子点纳米颗粒的制备方法，该方法可以有效地解决疏水性量子点在水相中分散性能差的问题，使之更适合于生物学上的应用。除了上述量子点的水溶性差的问题需要改善之外，量子点半导体材料通常都含有有毒的重金属，在应用过程中表现出一定的生物毒性效应；另外，有机溶剂包裹的量子点其光量子产率较低，而量子点在无有机溶剂保护的情况下容易被氧化、稳定性较差，因此如何提高量子点荧光探针的光稳定性和生物相容性是目前迫切需要解决的问题。CN101962450A公开了一种壳聚糖-量子点荧光探针的水相制备方法，主要通过电荷之间的相互作用、共价结合作用以及螯合作用制备壳聚糖量子点复合纳米粒，该发明提供了一种改善量子点稳定性和生物相容性的方法。但是该专利中公开的几种包裹量子点的方法操作步骤繁琐、实验难以控制、并且不完全适用于疏水性量子点的包裹。

发明内容

本发明的目的在于针对目前各类量子点荧光探针在应用上的缺陷，公开了一种在位无损检测肿瘤的试剂盒及其制备方法，本发明的制备方法简单，产物水溶性好，稳定时间长，荧光量子产率高，细胞相容性好，在肿瘤在位生物成像方面有广泛的用途。

本发明利用壳聚糖骨架上分布着大量的羟基和氨基等活性基团，容易进行化学修饰形成壳聚糖的各种衍生物的特点，使壳聚糖形成胶束。通过胶束疏水基团与量子点表面的疏水性配体的相互作用包埋发射近红外荧光的量子点，并将其制备成试剂盒，用于肿瘤的在位检测。该制备方法简便易行，可以达到改善量子点的溶解性、增加量子点的光稳定性和生物相容性的效果，并实现肿瘤组织的无损在位检测。

本发明的无损检测肿瘤的试剂盒，由壳聚糖胶束磷酸缓冲溶液构成，所述壳聚糖胶束内部包埋有疏水性硫化铅量子点。

其中壳聚糖胶束浓度优选1～20mg/ml，疏水性硫化铅量子点的浓度优选1～20mM。

疏水性硫化铅量子点荧光发射波长优选600～950nm；粒径优选5～30nm。

壳聚糖的分子量优选2～30KDa。

磷酸缓冲液浓度为0.01mol/L，pH7.4。

本发明的试剂盒的制备方法，包括：由壳聚糖、疏水基团、亲水基团聚合得到壳聚糖胶束，两相法制备疏水性硫化铅量子点，将疏水性硫化铅量子点溶于有机溶剂中，壳聚糖胶束溶于磷酸缓冲盐溶液中，然后将两溶液混合搅拌，形成壳聚糖胶束包埋疏水性量子点的荧光探针，即得，所述的亲水基团是硫酸酯、羧甲基或丁二酸酐；疏水基团是软酯酰基、月桂基或正辛基；有机溶剂是丙酮、二氯甲烷或三氯甲烷。

亲水基团与壳聚糖分子中的N-乙酰氨基葡萄糖的摩尔比优选2∶1～8∶1。更优选5∶1。疏水基团与壳聚糖分子中的N-乙酰氨基葡萄糖的摩尔比优选2∶1～8∶1。更优选2∶1。

其中两相法制备疏水性硫化铅量子点包括：先在有机相中制备含铅的前体溶液，然后缓慢逐滴滴加硫化钠水相溶液，在有机相界面上的Pb离子和水相中释放的硫离子形成PbS核，再在有机相中慢慢长成PbS量子点.。疏水性量子点表面的疏水性配体优选油酸、三正辛基氧膦或磷酸三辛酯。

其中壳聚糖胶束的制备方法包括：将壳聚糖溶于酸性水溶液中，加入甲醇搅拌稀释，之后在搅拌下逐滴加入含亲水基团的溶液，持续搅拌，用氢氧化钠调节pH至5～7后取沉淀，加水溶解，透析；将亲水修饰的壳聚糖溶于乙酸溶液中，滴加入含疏水基团的溶液，继续搅拌；逐滴加入硼氢化钠，继续搅拌；反应结束后用氢氧化钠调节溶液至中性后，取沉淀，加水溶解，透析，冷冻干燥；将制得的两亲性修饰的壳聚糖溶于磷酸缓冲溶液中，探头超声数次，通过自组装作用形成胶束。

上述亲水基团优选丁二酸酐；疏水基团优选正辛基；量子点的疏水配体优选油酸；有机溶剂优选三氯甲烷。

制备壳聚糖胶束包裹量子点的方法中的探头超声时间优选5-30分钟。

为了包装贮存方便，本发明的试剂盒也可以制备成A液和B液，A液由磷酸缓冲液(PBS，pH7.4)配制而成，内含优选浓度为1～20mg/mL壳聚糖胶束；B液可以是丙酮，二氯甲烷、三氯甲烷中的一种，内含优选1～20mM疏水性硫化铅(PbS)量子点。使用时将A液和B液混合搅拌即可，混合后得到壳聚糖胶束包裹的疏水性硫化铅量子点荧光纳米探针即可用于在位无损检测肿瘤。本发明的试剂盒可以通过静脉注射的方法注入动物体内，采用近红外成像系统实时动态观测该荧光探针检测肿瘤的情况。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

两相法合成的近红外荧光PbS量子点具有荧光量子产率高、生物毒性低、可用于在位近红外荧光成像等优点。通过化学修饰制备得到的壳聚糖胶束具有生物相容性好、生物可降解、亲水性好、可增加疏水性量子点的溶解性等特点，并且对肿瘤组织具有被动靶向效应。因此可以结合两者的特点制备壳聚糖胶束包裹的近红外荧光量子点探针，用于肿瘤组织在位检测。相对CT、核磁、PET等常规检测手段本发明具有检测方便、费用低、对机体无伤害等优点。CN101629076A公开的一种二氧化硅包被荧光量子点纳米颗粒的制备方法仅仅能改善量子点的水溶性，CN101962450A公开的一种壳聚糖-量子点荧光探针的水相制备方法可以改善量子点稳定性和生物相容性等问题，但是并不能增加疏水性量子点的溶解性，而且制备方法复杂、实验难以控制。而本发明设计的试剂盒操作简单、光量子产率高、光稳定性强、生物相容性好，同时具有增加疏水性量子点的溶解度、肿瘤靶向、可以进行无损在位实时监测等特点，因此更适合用作肿瘤的在位成像与检测。

附图说明

图1为本发明制备的壳聚糖胶束-量子点荧光探针的紫外-可见吸收光谱；

图2为本发明制备的壳聚糖胶束-量子点荧光探针的荧光发射光谱；

图3为本发明制备的壳聚糖胶束-量子点荧光探针的粒径分布图；

图4为本发明制备的壳聚糖胶束-量子点荧光探针的透射电镜示意图；

图5为本发明制备的壳聚糖胶束-量子点荧光探针与有机染料、量子点光稳定性的比较；

图6为本发明制备的壳聚糖胶束-量子点荧光探针的生物相容性实验；

图7为本发明制备的壳聚糖胶束-量子点荧光探针无损在位检测肿瘤的成像图

具体实施方式

实施例1

制备壳聚糖胶束包埋疏水性量子点荧光探针

1.制备N-丁二酰-N′-辛基壳聚糖胶束：

(1).N-丁二酰壳聚糖胶束(SC)的制备

壳聚糖1g溶于4.8％丁二酸(20ml)溶液中，逐滴加入甲醇(80ml)溶液稀释，室温下机械搅拌，逐滴加入丁二酸酐溶液(丁二酸酐∶2-氨基-β-1，4-葡聚糖摩尔为5∶1，室温下继续搅拌48小时，5％氢氧化钠溶液调节体系pH为7，离心取沉淀，透析后冷冻干燥。

(2).N-丁二酰-N′-辛基壳聚糖(SOC)的制备

1g N-琥珀酰壳聚糖溶于1％乙酸(50ml)溶液中，在搅拌条件下逐滴加入辛醛(辛醛∶2-氨基-β-1，4-葡聚糖摩尔为2∶1)，继续搅拌4小时后，用少量氢氧化钠调节pH为4，逐滴加入硼氢化钠溶液继续搅拌12小时。过滤，氢氧化钠调节pH为7，透析，冷冻干燥，即得N-丁二酰-N′-辛基壳聚糖。

(3).N-丁二酰-N′-辛基壳聚糖(SOC)胶束的制备

1g N-丁二酰-N′-辛基壳聚糖溶于50ml PBS溶液中，搅拌，探头超声10分钟(工作时间2秒，间歇时间3秒，功率200W)，SOC通过自组装作用形成胶束。此为试剂盒中的A液。

2.两相法制备高质量油溶性的近红外荧光发射的PbS量子点：

(1).Pb-OA前体溶液(有机相)的制备：称取0.038g(0.1mmol)Pb(Ac)₂溶于10mL有机溶剂正癸烷中，再加入0.4mmol油酸，然后升高温度至130℃，搅拌下继续反应20min。

(2).PbS量子点的合成：将上述溶液冷却至室温，向溶液中缓慢逐滴滴加Na₂S水溶液(水相)，40℃反应，反应5min取样，取上清油相溶液，测试光学性质。PbS量子点形成过程如下：首先有机相界面上的Pb离子和水相中释放的S离子形成PbS核，然后再在有机相中慢慢长成PbS量子点。此为试剂盒中的B液。

3.N-丁二酰-N′-辛基壳聚糖(SOC)胶束包埋PbS量子点：

取1ml PBS溶液(内含20mg SOC)，10mMPbS量子点溶解到0.2ml氯仿中，并将其逐滴加入到SOC胶束溶液中，室温下磁力搅拌至氯仿完全挥发。得到的产品即为N-丁二酰-N′-辛基壳聚糖胶束包埋PbS量子点的荧光探针，该纳米荧光探针的粒径在80～400nm之间，其粒径分布图及电镜图分别见图3和图4。其荧光吸收和发射光谱分别见图1和图2，从图中可以看出壳聚糖胶束包裹的PbS量子点近红外荧光探针的吸收光谱和荧光发射光谱与PbS量子点相比有少许红移，光量子产率基本不变。光稳定性实验也证实了本发明的壳聚糖胶束包裹的PbS量子点荧光探针与PbS量子点及有机近红外染料Cypate相比具有更好的稳定性，见图5。细胞毒性实验显示本发明制备的荧光探针具有较好的生物相容性，见图6。

4.壳聚糖胶束包埋PbS量子点的荧光探针用于肿瘤的无损在位检测

(1)用含有10％胎牛血清，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基，在37℃、5％CO₂的环境下培养人乳腺癌细胞系MCF-7细胞，并用0.1mL PBS溶液(含有3×10⁶个肿瘤细胞)悬浮后，皮下接种于裸鼠腋下，制备荷瘤鼠模型；

(2)取上述试剂盒中A液和B液两种试剂混合后得到的荧光探针溶液0.2mL，通过尾静脉注射的方法缓慢注入荷瘤鼠体内。然后在近红外成像系统下观察肿瘤组织的荧光成像，见图7。

实施例2

制备壳聚糖胶束包埋疏水性量子点荧光探针

1.制备N-辛基-O-硫酸酯壳聚糖(OSC)胶束：

(1).N-辛基壳聚糖胶束(OC)的制备

1g壳聚糖溶于1％乙酸(50ml)溶液中，在搅拌条件下逐滴加入辛醛(辛醛∶2-氨基-β-1，4-葡聚糖摩尔为2∶1)，继续搅拌4小时后，用少量氢氧化钠调节pH4，逐滴加入硼氢化钠溶液继续搅拌12小时。过滤，氢氧化钠调节pH为7，出现大量沉淀。离心取沉淀，用水溶解，透析，冷冻干燥。

(2).N-辛基-O-硫酸酯壳聚糖(OSC)的制备

1g OC溶于DMF(40ml)溶液中，搅拌过夜。硫酸酯逐滴加入到DMF(40ml)溶液中，0℃、N₂保护下搅拌1h，然后将该溶液加入OC溶液中，10℃、N₂保护下反应24h(硫酸酯∶2-氨基-β-1，4-葡聚糖摩尔为4∶1)。氢氧化钠调节pH为7，透析，冷冻干燥，即得N-辛基-O-硫酸酯壳聚糖。

(3).N-辛基-O-硫酸酯壳聚糖胶束的制备

1g N-辛基-O-硫酸酯壳聚糖溶于50ml PBS溶液中，搅拌，探头超声10分钟(工作时间2秒，间歇时间3秒，功率200W)，N-辛基-O-硫酸酯壳聚糖通过自组装作用形成胶束。此为试剂盒中的A液。

2.两相法制备高质量油溶性的近红外荧光发射的PbS量子点：

(1).Pb-TOPO前体溶液(有机相)的制备：称取0.038g(0.1mmol)Pb(Ac)₂溶于10mL有机溶剂正癸烷中，再加入0.4mmol TOPO，然后升高温度至270℃，搅拌下继续反应20分钟。(2).PbS量子点的合成：将上述溶液冷却至室温，向溶液中缓慢逐滴滴加Na₂S水溶液(水相)，40℃反应，在反应5min后取样，取上清油相溶液，并测试光学性质。PbS量子点形成过程如下：首先有机相界面上Pb离子和水相中释放的S离子形成PbS核，然后再在有机相中慢慢长成PbS量子点。此为试剂盒中的B液。

3.N-辛基-O-硫酸酯壳聚糖胶束包埋PbS量子点：

取1ml PBS溶液(内含20mg N-辛基-O-硫酸酯壳聚糖胶束)，10mM PbS量子点溶解到0.2ml氯仿中，并将其逐滴加入到N-辛基-O-硫酸酯壳聚糖胶束溶液中，室温下磁力搅拌至氯仿完全挥发。

实施例3

制备壳聚糖胶束包埋疏水性量子点荧光探针

1.制备N-丁二酰-N′-软酯酰基壳聚糖(SPC)胶束：

(1).N-丁二酰壳聚糖胶束(SC)的制备

壳聚糖1g溶于4.8％丁二酸(20ml)溶液中，逐滴加入甲醇(80ml)溶液稀释，室温下机械搅拌，逐滴加入丁二酸酐溶液(丁二酸酐∶2-氨基-β-1，4-葡聚糖摩尔为5∶1)，室温下继续搅拌48小时，5％氢氧化钠溶液调节体系pH为7，离心取沉淀，透析后冷冻干燥。

(2).N-丁二酰-N′-软酯酰基壳聚糖(SPC)的制备

1g N-琥珀酰壳聚糖溶于100mL DMSO溶液中，在搅拌条件下逐滴加入软酯酸酐(软酯酸酐∶2-氨基-β-1，4-葡聚糖摩尔为3∶1)，60℃搅拌6-10小时后，反应产物用丙酮沉淀，出现大量沉淀，然后用水溶解，透析，冷冻干燥，即得N-丁二酰-N′-软酯酰基壳聚糖(SPC)。

(3).N-丁二酰-N′-软酯酰基壳聚糖(SPC)的制备

1g N-丁二酰-N′-辛基壳聚糖溶于50m PBS溶液中，搅拌，探头超声15分钟(工作时间2秒，间歇时间3秒，功率200W)，N-丁二酰-N′-软酯酰基壳聚糖通过自组装作用形成胶束。

2.两相法制备高质量油溶性的近红外荧光发射的PbS量子点：

(1).Pb-TOP前体溶液(有机相)的制备：称取0.038g(0.1mmol)Pb(Ac)₂溶于10mL有机溶剂正癸烷中，再加入0.4mmol TOP，然后升高温度至270℃，搅拌下继续反应20min。

(2).PbS量子点的合成：将上述溶液冷却至室温，向溶液中缓慢逐滴滴加Na₂S水溶液(水相)，40℃反应，在反应10min后取样，取上清油相溶液，并测试光学性质。PbS量子点形成过程如下：首先有机相界面上的Pb离子和水相中释放的S离子形成PbS核，然后再在有机相中慢慢长成PbS量子点。

3.N-丁二酰-N′-软酯酰基壳聚糖(SPC)胶束包埋PbS量子点：

取1ml PBS溶液(内含20mg SPC)，10mM PbS量子点溶解到0.2ml三氯甲烷中，并将其逐滴加入到SPC胶束溶液中，室温下磁力搅拌至三氯甲烷完全挥发。

Claims (3)

1.一种检测肿瘤的试剂盒的制备方法，其特征在于，

所述试剂盒由壳聚糖胶束磷酸缓冲溶液构成，所述壳聚糖胶束内部包埋有疏水性硫化铅量子点，其中壳聚糖胶束浓度为1～20mg/ml，疏水性硫化铅量子点的浓度为1～20mM，疏水性硫化铅量子点荧光发射波长为600～950nm，粒径为5～30nm，壳聚糖的分子量为2～30KDa，疏水性量子点表面的疏水性配体是油酸、三正辛基氧膦或磷酸三辛酯；

所述制备方法包括：由壳聚糖、疏水基团、亲水基团聚合得到壳聚糖胶束，两相法制备疏水性硫化铅量子点，将疏水性硫化铅量子点溶于有机溶剂中，壳聚糖胶束溶于磷酸缓冲盐溶液中，然后将两溶液混合搅拌，形成壳聚糖胶束包埋疏水性量子点的荧光探针，即得，所述的亲水基团是硫酸酯、羧甲基或丁二酸酐，疏水基团是软酯酰基、月桂基或正辛基，有机溶剂是丙酮、二氯甲烷或三氯甲烷；

其中两相法制备疏水性硫化铅量子点包括：先在有机相中制备含铅的前体溶液，然后缓慢逐滴滴加硫化钠水相溶液，在有机相界面上的Pb离子和水相中释放的硫离子形成PbS核，再在有机相中慢慢长成PbS量子点，所述有机溶剂是丙酮、二氯甲烷或三氯甲烷；

其中壳聚糖胶束的制备方法包括：将壳聚糖溶于酸性水溶液中，加入甲醇搅拌稀释，之后在搅拌下逐滴加入含亲水基团的溶液，持续搅拌，用氢氧化钠调节pH至5～7后取沉淀，加水溶解，透析，将亲水修饰的壳聚糖溶于乙酸溶液中，滴加入含疏水基团的溶液，继续搅拌，逐滴加入硼氢化钠，继续搅拌，反应结束后用氢氧化钠调节溶液至中性后，取沉淀，加水溶解，透析，冷冻干燥，将制得的两亲性修饰的壳聚糖溶于磷酸缓冲溶液中，探头超声数次，通过自组装作用形成胶束。

2.权利要求1的制备方法，其中亲水基团是丁二酸酐，疏水基团是正辛基，有机溶剂是三氯甲烷。

3.权利要求1的制备方法，其中亲水基团与壳聚糖分子中的N-乙酰氨基葡萄糖的摩尔比为2：1～8：1，其中疏水基团与壳聚糖分子中的N-乙酰氨基葡萄糖的摩尔比为2：1～8：1。

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