CN102269764A

CN102269764A - 扇贝颗粒细胞的酶联免疫检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN102269764A
Application number: CN2011101219953A
Authority: CN
Inventors: 邢婧; 林听听; 战文斌; 绳秀珍
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2011-05-12
Filing date: 2011-05-12
Publication date: 2011-12-07

Abstract

本发明公开了一种用于检测扇贝颗粒细胞的酶联免疫试剂盒及其应用，所述的扇贝包括栉孔扇贝、虾夷扇贝、海湾扇贝这三个物种；所述的酶联免疫试剂盒包括酶标板、封闭液、洗涤液、酶标记抗体、pNPP底物显色液、磷酸盐缓冲液、血细胞抗凝剂和抗扇贝颗粒细胞的单克隆抗体；所述的酶联免疫试剂盒的应用包括在栉孔扇贝经病毒感染后和海湾扇贝经饥饿胁迫后颗粒细胞数变化上的应用。本发明的酶联免疫试剂盒具特异性强，精确度高，重复性和稳定性好等优点，其检测结果可用扇贝健康状况的评估和颗粒细胞免疫功能的分析。

Description

扇贝颗粒细胞的酶联免疫检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种应用单克隆抗体（单抗）定量检测扇贝颗粒细胞的酶联免疫试剂盒及其应用，属于贝类细胞免疫学技术领域。

背景技术

栉孔扇贝（Chlamys farreri）、虾夷扇贝（Patinopecten yessoensis）、海湾扇贝（Argopecten irradians）是我国北方沿海贝类养殖的重要经济种类，近年来由于养殖环境的老化，病害的发生以及种质的衰退，扇贝的产量逐年下降。由于扇贝多采用海上筏式笼养的养殖方式，使得在广阔的水域中对扇贝病害的预防、环境的调控困难较大，因此对扇贝健康状况的监测尤为重要。

贝类缺乏特异性免疫系统，其免疫防御反应主要由血细胞和血淋巴中的体液因子完成。贝类血细胞主要分为两类：颗粒细胞和透明细胞。二者均参与贝类的营养运输、伤口修复、贝壳矿化、消化排泄等各项生理活动；并且通过吞噬、氧化杀伤、结节形成、细胞凝块、黑化等方式起到免疫防御作用。其中颗粒细胞比透明细胞具更强的吞噬、产活性氧、粘附、凝集及黑化能力[J Invertebr Pathol,2007,96:48–53；J Exp Mar Biol Ecol，2003，293:249–265]。研究表明贝类受到重金属[Fish Shellfish Immunol,1995,5:581–595]、低温[J Invertebr Pathol,2009, 102:30–35]、高温[Aquaculture，2007，271:479–487]、饥饿[J Shellfish Res,2008,27:1195–1200]等胁迫时，以及产卵耗能[Aquaculture，2007，264:73–81]和寄生虫侵染[J Invertebr Pathol，1998，72:304–312]时，贝类的颗粒细胞数会发生显著变化。因此，颗粒细胞数是反映贝类免疫防御功能和健康状况的重要指标之一。

目前用于检测颗粒细胞数的方法主要是血球计数板和流式细胞仪法。血球计数板法主观性强、重复性不高、误差大；流式细胞仪法需特定仪器，费用高；并且这两种方法均要求样品是新鲜抽取的血细胞，无法将不同采样时间点的样品大批量统一检测。

发明内容

针对上述检测方法的缺点，本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高、准确度和重复性好的扇贝颗粒细胞的酶联免疫检测试剂盒，适用于检测栉孔扇贝、虾夷扇贝和海湾扇贝的颗粒细胞。

本发明的另一目的在于提供上述扇贝颗粒细胞酶联免疫检测试剂盒的应用。

本发明的酶联免疫检测试剂盒包括：酶标板，封闭液，洗涤液，酶标记抗体，pNPP底物显色液，磷酸盐缓冲液（PBS），血细胞抗凝剂，其特征在于还包括抗扇贝颗粒细胞的单抗。

其中所述的抗扇贝颗粒细胞的单抗是通过收集抗栉孔扇贝颗粒细胞的杂交瘤细胞株6H7的培养上清液（单抗6H7），其能与虾夷扇贝、海湾扇贝的颗粒细胞交叉反应。

所述的封闭液为含3.0%（w/v）牛血清白蛋白的PBS。

所述的洗涤液为含0.1%（v/v）Tween-20的PBS。

所述的酶标记抗体为碱性磷酸酶（AP）标记的羊抗小鼠IgG抗体。

所述的血细胞抗凝剂为含0.02 M EDTA的PBS。

本发明的扇贝颗粒细胞酶联免疫试剂盒的制备方法如下：

1. 分析抗栉孔扇贝颗粒细胞的单抗6H7与虾夷扇贝、海湾扇贝血细胞的交叉反应：抽取虾夷扇贝、海湾扇贝的血淋巴，离心后，所得血细胞沉淀用血细胞抗凝剂重悬，制得血细胞悬液；将血细胞悬液作为抗原，单抗6H7作为第一抗体，间接免疫荧光法证明单抗6H7能与虾夷扇贝、海湾扇贝的颗粒细胞交叉反应；

2. 收集单抗6H7：将小鼠杂交瘤细胞株6H7扩大培养，收集其培养上清液，混匀，离心，所得上清液分装，冻存；

3. 确定抗原与抗体的最佳使用比例：制备栉孔扇贝、虾夷扇贝、海湾扇贝的血细胞悬液，并超声波破碎；分别用PBS将各破碎液和单抗6H7梯度稀释，通过ELISA棋盘滴定法获得抗原抗体的最佳使用比例；

4. 确定试剂盒的最低检测限：制备栉孔扇贝、虾夷扇贝和海湾扇贝的血细胞破碎液，并用考马斯亮蓝法测定其蛋白浓度；分别用PBS将各破碎液梯度稀释作为抗原，不经稀释的单抗6H7作为第一抗体，ELISA法测定各稀释度的OD值，从而确定试剂盒的最低检测限。

本发明的扇贝颗粒细胞酶联免疫试剂盒用于检测栉孔扇贝经病毒感染后和海湾扇贝经饥饿胁迫后颗粒细胞数的变化。

其中所述的应用试剂盒检测栉孔扇贝经病毒感染后颗粒细胞数的变化，其步骤如下：

1. 将暂养的栉孔扇贝分成两组，感染组注射栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒（AVNV），对照组注射灭菌生理盐水，注射后24 h，每天采集各组的栉孔扇贝，共采集9天；

2. 定量抽取采集扇贝的血淋巴，离心，所得血细胞沉淀用等量血细胞抗凝剂重悬，超声波破碎制得血细胞破碎液样品；

3. 将各天的血细胞破碎液样品于酶标板孔中包被，应用上述扇贝颗粒细胞酶联免疫试剂盒检测栉孔扇贝颗粒细胞数的变化。

所述的应用试剂盒检测海湾扇贝经饥饿胁迫后颗粒细胞数的变化，其应用步骤如下：

1. 将暂养的海湾扇贝分成两组，对照组每天持续投喂螺旋藻粉，饥饿组不实施投喂，每周采集各组的海湾扇贝，共采集5周；

3. 将各周的血细胞破碎液样品于酶标板孔中包被，应用上述扇贝颗粒细胞酶联免疫试剂盒检测海湾扇贝颗粒细胞数的变化。

本发明应用抗颗粒细胞单抗通过高效的酶标记抗体显色的方法将待检样品的颗粒细胞数直观表达出来，具有特异性强，精确度高，灵敏度高的优点，可用于少量、多个样品的同时检测，重复性、稳定性好。检测结果可用于扇贝健康状况的评估和颗粒细胞免疫功能的分析。

附图说明

图1为本发明的单抗6H7与虾夷扇贝、海湾扇贝血细胞反应的间接免疫荧光检测结果。

图2为本发明用于检测栉孔扇贝经病毒感染后颗粒细胞数变化的结果。

图3为本发明用于检测海湾扇贝经饥饿胁迫后颗粒细胞数变化的结果。

图1所示：(A)，(a) 分别为虾夷扇贝血细胞与单抗反应的免疫荧光检测结果和原视野下微分干涉检测结果；(B)，(b) 分别为海湾扇贝血细胞与单抗反应的免疫荧光检测结果和原视野下微分干涉检测结果；H：透明细胞；G：颗粒细胞；标尺=10 μm。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：抗栉孔扇贝颗粒细胞的单抗6H7与虾夷扇贝、海湾扇贝血细胞的交叉反应

1. 虾夷扇贝、海湾扇贝血细胞悬液的制备：分别取健康的虾夷扇贝、海湾扇贝，用灭过菌的注射器从扇贝闭壳肌抽取血淋巴，按体积比为1：1与预冷的血细胞抗凝剂（0.02 M EDTA，0.14 M NaCl，3 mM KCl，8 mM Na₂HPO₄，1.5 mM KH₂PO₄，pH 7.4）混匀。混匀液经3000 r/min，4℃离心10 min，所得血细胞沉淀再经抗凝剂重悬，调节血细胞悬液浓度为10⁷cells/ml；

2. 间接免疫荧光法分析单抗6H7的交叉反应：分别取1 ml虾夷扇贝、海湾扇贝的血细胞悬液，加于24孔细胞培养板孔中。滴加抗栉孔扇贝颗粒细胞的单抗6H7为第一抗体（该单抗的特性及其制备方法已于专利“抗栉孔扇贝颗粒血细胞的单克隆抗体及其制备方法PCT/CN2011/070125”加以描述)，每孔1 ml，37℃孵育45 min。3000 r/min离心洗涤3次，5 min/次，PBS重悬，将异硫氰荧光素（FITC）标记的羊抗鼠抗体加于细胞培养板孔中，每孔500 μl，37℃避光孵育45 min。离心洗涤3次，PBS重悬，取一滴血细胞悬液加于载玻片上，甘油封片，在荧光显微镜和微分干涉相差显微镜下观察。结果发现单抗6H7能与虾夷扇贝、海湾扇贝的颗粒细胞特异性结合，但不与透明细胞反应（图1）。

实施例2：单抗6H7的收集

将小鼠杂交瘤细胞株6H7扩大化培养，收集其培养上清液500 ml。收集的上清液混匀，2000 r/min离心10 min，离心所得的上清液分装于1.5 ml微量离心管，每管1 ml，-20℃冻存。

实施例3：抗原与抗体的最佳使用比例

1. 分别将栉孔扇贝、虾夷扇贝和海湾扇贝的血细胞悬液超声波破碎，分装，-20℃冻存；

2. 将三种扇贝血细胞破碎液（抗原）用PBS按2⁰，2^-1，2^-2，2^-3和2^-4的梯度稀释包被于酶标板孔内，每孔100 μl，4℃过夜；

3. 弃去孔内液体，含Tween-20的PBS（PBS-T）洗涤3次；加3%牛血清白蛋白（BSA）到相应抗原孔内，每孔200 μl，37℃封闭1 h；

4. 弃去孔内液体，PBS-T洗涤3次；将单抗6H7用PBS按2⁰，2^-1，2^-2和2^-3的梯度稀释，加入到相应的抗原孔内，每孔100 μl，37℃孵育1.5 h；

5. 弃去孔内液体，PBS-T洗涤3次；加碱性磷酸酶（AP）标记的羊抗鼠抗体应用液到相应的抗原孔内，每孔100 μl，37℃孵育1 h；

6. 弃去孔内液体，PBS-T洗涤3次；每孔加100 μl pNPP底物显色液，37℃孵育30 min；

7. 于酶标仪的405 nm处读数，分析数据，选出最佳的抗原抗体使用比例。

各稀释度的抗原抗体组合其OD_405nm值结果如表1所示：无论是栉孔扇贝，还是虾夷扇贝和海湾扇贝，其2⁰2⁰组合（即抗原和抗体均不经稀释）的OD_405nm值显著高于其他各种组合，为抗原抗体的最佳反应、使用比例。

表1 不同稀释度的抗原和抗体结合后ELISA的OD_405nm值。粗体为2⁰2⁰组合显著高于其他组合。

实施例4：扇贝颗粒细胞酶联免疫检测试剂盒的最低检测限

1. 分别取栉孔扇贝、虾夷扇贝和海湾扇贝的血细胞破碎液，用考马斯亮蓝法测定、并调整到一致的蛋白浓度4 mg/ml；

2. 将蛋白浓度调整后的三种扇贝的血细胞破碎液用PBS按5⁰，5^-1，5^-2，5^-3，5^-4和5^-5的梯度稀释包被于酶标板孔内，每孔100 μl，4℃过夜；

3. 弃去孔内液体， PBS-T洗涤3次；每孔加200 μl 3% BSA，37℃封闭1 h；

4. 弃去孔内液体，PBS-T洗涤3次；每孔加100 μl单抗6H7（不经稀释），37℃孵育1.5 h；阴性对照为骨髓瘤细胞培养上清液代替单抗6H7；

5. 弃去孔内液体，PBS-T洗涤3次；每孔加100 μl AP标记的羊抗鼠抗体，37℃孵育1 h；

6. 弃去孔内液体，PBS-T洗涤3次；每孔加100 μl pNPP底物显色液， 37℃孵育30 min；

7. 于酶标仪405 nm处读数，数据分析。

检测结果如表2所示：当栉孔扇贝、虾夷扇贝和海湾扇贝的血细胞破碎液稀释到5^-4时，OD_405nm/阴性对照≥2，仍为阳性；而当血细胞破碎液稀释到5^-5时，其OD_405nm基本与阴性对照无异；表明5^-4稀释度为抗原最低稀释浓度，即试剂盒的最低检测限约为6 μg/ml。

表2 不同抗原稀释度经ELISA检测后的OD_405nm值。

实施例5：扇贝颗粒细胞酶联免疫检测试剂盒的使用方法

1. 待检样品：用灭菌注射器从闭壳肌中定量抽取扇贝血淋巴，立即与预冷血细胞抗凝剂按体积比为1：1混匀。混匀液于3000 r/min，4℃离心10 min，所得血细胞沉淀用与血淋巴等量的抗凝剂重悬，经超声波破碎后，即为待检样品；

2. 包被抗原：将上述待检样品加到96孔酶标板孔中，每孔100 μl，4℃包被过夜；

3. 封闭：弃去孔内液体，每孔中加200μl洗涤液（PBST），轻轻摇晃5 min，倒掉洗涤液，反复3次。洗完后，在每孔中加入200 μl封闭液，37℃孵育1 h；

4. 一抗孵育：弃去孔内液体，每孔中加200 μl洗涤液，5 min/次，洗3次。每孔中再加入100 μl抗扇贝颗粒细胞的单抗，37℃孵育1.5 h；

5. 二抗孵育：弃去孔内液体，每孔中加200 μl洗涤液，5 min/次，洗3次。每孔中再加入100 μl 酶标记抗体，37℃孵育1 h；

6. 显色读数：弃去孔内液体，每孔中加200 μl洗涤液，5min/次，洗3次。每孔中再加入100 μl pNPP底物显色液，37℃孵育30 min，于酶标仪的405 nm处读数，即可分析待检样品中颗粒细胞的含量。

实施例6：应用试剂盒检测栉孔扇贝经病毒感染后颗粒细胞数的变化

1. 病毒感染：将暂养的栉孔扇贝分成两组，每组100只。感染组以5^-4AVNV粗提液为病毒感染液，注射扇贝闭壳肌每只100 μl，对照组则注射2%的灭菌生理盐水每只100 μl。注射后24 h，每天分别在感染组和对照组随机采集扇贝5~6只，共采集9天；

2. 待检样品的制备：将采集的栉孔扇贝用灭菌注射器从闭壳肌中定量抽取扇贝血淋巴，立即与预冷血细胞抗凝剂按体积比为1：1混匀。混合液于3000 r/min，4℃离心10 min，所得血细胞沉淀用与血淋巴等量的抗凝剂重悬，超声波破碎，分装，-80℃冻存；

3. 试剂盒检测：将病毒感染组和对照组9天的待检样品，统一检测。检测步骤参见实施例2中所提供的本试剂盒的具体使用方法。

应用本发明的试剂盒检测结果表明：栉孔扇贝经病毒感染后，第1天的颗粒细胞数较对照值显著升高；之后的第2，3，4天急剧下降，并于第3天达到最低值；从第5天开始有所回升，并于第6，7天又显著高于对照值；最后恢复到对照值；而对照组的颗粒细胞数9天内基本保持不变（图2）。

实施例7：应用试剂盒检测海湾扇贝经饥饿胁迫后颗粒细胞数的变化

1. 饥饿胁迫：将暂养的海湾扇贝分成两组，每组70只。饥饿组不实施投喂；对照组每天持续投喂螺旋藻粉（5 g/L）。每周分别在饥饿组和对照组随机采集扇贝5~6只，共采集5周；

2. 待检样品的制备：将采集的海湾扇贝用灭菌注射器从闭壳肌中定量抽取扇贝血淋巴，立即与预冷血细胞抗凝剂按体积比为1：1混匀。混合液于3000 r/min，4℃离心10 min，所得血细胞沉淀用与血淋巴等量的抗凝剂重悬，经超声波破碎后，分装，-80℃冻存；

3. 试剂盒检测：将对照组和饥饿组各周的待检样品统一检测。检测步骤参见实施例2中所提供的本试剂盒的具体使用方法。

应用本发明的试剂盒检测结果表明：海湾扇贝饥饿1，2，3周后，其颗粒细胞数呈现依次显著下降的趋势；3周后不再下降；而对照组的颗粒细胞数5周内基本保持不变（图3）。

本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改、添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。

Claims

1.一种扇贝颗粒细胞的酶联免疫检测试剂盒，包括酶标板、封闭液、洗涤液、酶标记抗体、pNPP底物显色液、磷酸盐缓冲液、血细胞抗凝剂，其特征在于所述的试剂盒还包括抗扇贝颗粒细胞的单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的封闭液是含质量体积比为3.0%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的洗涤液是含质量体积比为0.1% Tween-20的磷酸盐缓冲液。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的酶标记抗体是碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠IgG抗体。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的血细胞抗凝剂是含0.02 M EDTA的磷酸盐缓冲液。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的抗扇贝颗粒细胞的单克隆抗体是由杂交瘤细胞株6H7所分泌的抗栉孔扇贝颗粒细胞的单克隆抗体。

7.根据权利要求6所述的单克隆抗体，其特征在于所述的抗体能与虾夷扇贝、海湾扇贝的颗粒细胞交叉反应。

8.一种如权利要求1所述试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）抽取虾夷扇贝、海湾扇贝的血淋巴，离心后，所得血细胞沉淀用血细胞抗凝剂重悬，制得血细胞悬液；将血细胞悬液作为抗原，单抗6H7作为第一抗体，间接免疫荧光法证明单抗6H7能与虾夷扇贝、海湾扇贝的颗粒细胞交叉反应；

（2）收集单抗6H7：将小鼠杂交瘤细胞株6H7扩大培养，收集其培养上清液，混匀，离心，所得上清液分装，冻存；

（3）制备栉孔扇贝、虾夷扇贝、海湾扇贝的血细胞悬液，并超声波破碎；分别用PBS将各破碎液和单抗6H7梯度稀释，通过ELISA棋盘滴定法获得抗原抗体的最佳使用比例；

（4）制备栉孔扇贝、虾夷扇贝和海湾扇贝的血细胞破碎液，并用考马斯亮蓝法测定其蛋白浓度；分别用PBS将各破碎液梯度稀释作为抗原，不经稀释的单抗6H7作为第一抗体，ELISA法测定各稀释度的OD值，从而确定试剂盒的最低检测限。

9.一种如权利要求1所述试剂盒用于检测栉孔扇贝经病毒感染后和海湾扇贝经饥饿胁迫后颗粒细胞数变化。