CN102268055A

CN102268055A - 一种分离环磷腺苷的方法

Info

Publication number: CN102268055A
Application number: CN201010191525XA
Authority: CN
Inventors: 应汉杰; 钱文斌; 陈晓春; 柏建新; 陈勇; 熊健; 林晓清
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2010-06-04
Filing date: 2010-06-04
Publication date: 2011-12-07
Anticipated expiration: 2030-06-04
Also published as: CN102268055B

Abstract

本发明提供一种分离环磷腺苷的方法，该方法包括用阴离子交换柱吸附环磷腺苷溶液；将碱性溶液作为洗杂剂对吸附后的阴离子交换柱进行洗杂；然后将酸性溶液作为洗脱剂对该阴离子交换柱进行洗脱。本发明提供的方法使用新型阴离子交换剂分离3′，5′-环磷酸腺苷，与传统的使用阳离子交换树脂分离3′，5′-环磷酸腺苷的方法相比，本发明的方法吸附容量大，后续洗脱工艺简单，产品回收率高。对于3′，5′-环磷酸腺苷的工业化生产而言，本发明的方法分离纯化工艺简单，生产周期短，树脂使用量少。

Description

一种分离环磷腺苷的方法

技术领域

本发明涉及一种分离环磷腺苷的方法。

背景技术

环磷腺苷又名3′，5′-环磷酸腺苷(3′，5′-cyclic adenosine monophosphate，简称cAMP)，为蛋白激酶致活剂，是核苷酸的衍生物。它是在人体内广泛存在的一种具有生理活性的重要物质，由三磷酸腺苷在腺苷环化酶催化下生成，能调节细胞的多种功能活动。作为激素的第二信使，在细胞内发挥激素调节生理机能和物质代谢的作用，能改变细胞膜的功能，促使网织肌浆质内的钙离子进入肌纤维，从而增强心肌收缩，并可促进呼吸链氧化酶的活性，改善心肌缺氧，缓解冠心病症状及改善心电图。此外，对糖、脂肪代谢、核酸、蛋白质的合成调节等起着重要的作用。

关于cAMP的分离纯化，国内外报道的较少，传统的分离工艺普遍存在着工艺冗长、产量收率低，分离成本高，环境污染性大等缺点。如2000年出版的《最新生化药物制备技术》报道：在化学合成的环磷腺苷结晶工艺，分离段所使用的是阳离子交换剂，吸附能力较低，分离纯化效果不佳。

发明内容

因此，本发明的目的是克服现有技术中使用阳离子交换树脂分离环磷腺苷的方法吸附容量小、分离纯化效果不佳的问题，提供一种吸附容量大、分离纯化效果好的分离环磷腺苷的方法。

本发明提供了一种分离环磷腺苷的方法，该方法包括用阴离子交换柱吸附环磷腺苷溶液；将碱性溶液作为洗杂剂对吸附后的阴离子交换柱进行洗杂；然后将酸性溶液作为洗脱剂对该阴离子交换柱进行洗脱。

根据本发明提供的方法，其中，所述阴离子交换柱所填充的树脂是(C2-C4)羟烷化苯乙烯-二乙烯苯共聚得到的亲水性树脂，功能性基团可以为仲胺、叔胺或季铵基团，这些树脂的代表性的例子包括Amberlite IRA93(功能性基团为仲胺基团)、Amberlite IRA95(功能性基团为叔胺基团)和Amberlite IRA900RF Cl(功能性基团为季铵基团)；该功能性基团可以优选为叔胺基团，这类树脂的代表性的例子为Amberlite IRA95。

其中，所述阴离子交换树脂的比表面积可以为600-700m²/g，优选为620-680m²/g；所述阴离子交换柱的内部可交换基团容量可以为1.3-2mep/g湿树脂，优选为1.3-1.6mep/g湿树脂；所述阴离子交换柱的树脂填充量可以为每克湿离子交换树脂吸附0.08-0.15g环磷腺苷，优选为每克湿离子交换树脂吸附0.085-0.135g环磷腺苷。

所述功能性基团可以表示为-R-Z，其中R可以为C2-C4的烯烃链，且选择性地对其中一个碳原子进行羟基化；Z可以表示为-NH₂、-NR₁R₂或-NR₁R₂R₃ ⁺OH^-或其盐，其中R₁、R₂、R₃分别为C1-C4烷基链，且选择性对碳原子进行羟基化。因此所述功能性基团的结构式可以表示为-R-NH₂(例如Amberlite IRA93)，-R-NR₁R₂(例如Amberlite IRA95)或-R-NR₁R₂R₃ ⁺OH^-或其盐(例如Amberlite IRA900RF Cl)。

根据本发明提供的分离环磷腺苷的方法，其中，所述碱性溶液可以优选为0.001-2摩/升(更优选为0.01-1.2摩/升)的氨水、氢氧化钠溶液和氢氧化钾水溶液中的一种或多种；所述酸性溶液可以优选为0.001-2摩/升(更优选为0.01-1.2摩/升)的盐酸、硫酸和磷酸水溶液中的一种或多种。

由于本发明的可以将环磷腺苷与某些理化特性与其相似的化合物分离开，因此本发明的方法对所述环磷腺苷溶液中含有的环磷腺苷的浓度没有特别的限定，一般地，使用本发明的方法分离的环磷腺苷溶液中含有的环磷腺苷的浓度可以为5-20克/升，优选为5-15克/升，更优选为优选5-10克/升；该环磷腺苷溶液的pH值可以为6-11，优选为7-9。

根据本发明提供的分离环磷腺苷的方法，在一种优选的实施方式中，该方法还可以包括在洗脱之后对阴离子交换树脂进行再生。所述再生的方法可以为用0.001-2摩/升(优选为0.01-1.2摩/升)的盐酸或硫酸溶液将洗脱后的离子交换柱浸泡3-24小时，然后用去离子水淋洗到中性。

根据本发明提供的分离环磷腺苷的方法，在某些实施方式中，该方法还可以包括将洗脱液脱盐、结晶、干燥得到环磷腺苷。其中，将洗脱区流出的洗脱液脱盐的方法可以为本领域公知的各种方法，优选为将洗脱区流出的洗脱液经纳滤同步浓缩脱盐，在该方法中使用的纳滤膜截留分子量可以为150-300道尔顿。

本发明提供的方法使用新型阴离子交换树脂分离3′，5′-环磷酸腺苷，与传统的使用阳离子交换树脂分离3′，5′-环磷酸腺苷的方法相比，本发明的方法吸附容量大，后续洗脱工艺简单，产品回收率高。对于3′，5′-环磷酸腺苷的工业化生产而言，本发明的方法分离纯化工艺简单，生产周期短，树脂使用量少。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为实施例5测定的吸附容量的变化情况图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

环磷腺苷清液的制备

以下实施例所用的环磷腺苷清液按如下方法制备得到：

用发酵法制备：发酵培养基为在普通培养基(基于培养基的重量百分比计，包含葡萄糖5％，K₂HPO₄ 1％，KH₂PO₄ 1％，MgSO₄ 1％，尿素0.5％，蛋白胨0.5％)的基础上每升培养基添加0.1g NaF、0.1g VB1和5g次黄嘌呤。培养方法：将节杆菌A302(Arthrobacter sp.，于2010年1月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，保藏编号为CGMCC No.3584)接入种子培养基(基于培养基的重量百分比计，包含葡萄糖1％，蛋白胨1％，酵母膏0.5％，牛肉膏1％，NaCl 0.3％)中，初始pH为7.0，在30℃、240rpm下培养18小时。10％的接种量接入5L发酵罐中的发酵培养基中，以NaOH控制pH为7.0，溶氧控制为30％，400rpm、30℃下发酵72小时。放罐时，环磷酸腺苷的产量是5-10g/L。然后将发酵液通过离心机离心去除菌体，再将离心清液透过截留分子量为6000道尔顿的超滤膜去除大部分蛋白质，可得到浓度范围在5-10g/L的环磷腺苷清液。

环磷腺苷的纯度是通过高效液相色谱检测到的3’，5’-环腺苷单磷酸峰面积除以所有峰的总面积，再乘以100％计算得到。

用高效液相色谱检测环磷腺苷的条件为：汉邦Lichrospher-5-C18色谱柱 (250mm×4.6mm i.d.，5μm)；流动相：甲醇-6‰(体积分数)磷酸水溶液(用三乙胺调节pH值至6.6)(体积比为25∶75)；流速0.8mL/min；检测波长255nm；柱温为室温；进样体积20μL。采用外标一点法定量。

实施例1

本实施例用于说明本发明提供的分离环磷腺苷的方法。

用30g阴离子交换树脂(Amberlite IRA95)填充固定床，平衡后将浓度为5g/L的环磷腺苷清液上柱，500mL后吸附饱和，然后用1mol/L的氨水进行洗杂(用HPLC检测确定无杂质流出)，洗杂完毕后，再用0.05mol/L的HCl进行洗脱，洗脱液的体积为898mL，浓度为2.71g/L，纯度为95.1％，收率为97.4％。

实施例2

本实施例用于说明本发明提供的分离环磷腺苷的方法。

用50g阴离子交换树脂(Amberlite IRA93)填充固定床，平衡后将浓度为5.5g/L的环磷腺苷清液上柱，791mL后吸附饱和，然后用0.004mol/L的氨水进行洗杂(用HPLC检测确定无杂质流出)，洗杂完毕后，再用0.2mol/L的HCl进行洗脱，洗脱液的体积为1.563L，浓度为2.71g/L，纯度为94.3％，收率为97.4％。

实施例3

本实施例用于说明本发明提供的分离环磷腺苷的方法。

用100g阴离子交换树脂(Amberlite IRA95)填充固定床，平衡后将浓度为4.89g/L的环磷腺苷清液上柱，1.820L后吸附饱和，然后用0.001mol/L的氢氧化钠水溶液进行洗杂，洗杂完毕后，再用0.05mol/L的HCl进行洗脱，洗脱液的体积为3.249L。洗脱液用截留分子量为150道尔顿的纳滤膜同步浓缩脱盐后结晶、干燥，得到纯度为95.2％的环磷腺苷，收率为96.6％。

实施例4

本实施例用于说明本发明提供的分离环磷腺苷的方法。

用500g阴离子交换树脂(Amberlite IRA900RF Cl)填充固定床，平衡后将浓度为5.31g/L的环磷腺苷清液上柱，8.098L后吸附饱和，然后用 0.25mol/L的氨水进行洗杂，洗杂完毕后，再用0.3mol/L的HCl进行洗脱16h，洗脱液的体积为14.048L，浓度为2.96g/L，纯度为95.0％，收率为96.7％。

对比例1

本对比例用于说明现有的分离环磷腺苷的方法。

用500g国产001×7强酸性苯乙烯系阳树脂填充固定床分离化学合成环磷腺苷，树脂吸附量约为每克湿离子交换树脂吸附0.075-0.100g环磷腺苷，用0.06mol/L的HCl进行洗脱25-30h，纯度为75-80％，收率为80-85％。

通过实施例1-4与对比例1的比较可以看出，与使用阳离子交换树脂的现有分离方法相比，本发明的采用阴离子交换树脂吸附分离环磷腺苷的方法不仅产品纯度高，收率高，分离周期也较短。

实施例5

本实施例用于说明本发明提供的分离环磷腺苷的方法。

分四次实验，固定床阴离子交换树脂(Amberlite IRA95)填充量为50g，上柱环磷腺苷清液浓度为4.82g/L，吸附饱和后计算吸附量，然后对阴离子交换剂进行再生，先用1.5mol/L氨水浸泡6h，用纯水淋洗至pH值为6至8后，再用1.5mol/L盐酸浸泡6h，用纯水淋洗至pH值为6至7备用。以上述相同条件进行阴离子交换剂吸附，吸附之后再进行再生，如此循环四次，比较吸附容量的变化情况，结果如图1所示，阴离子交换剂再生效果很好，吸附容量基本不变。

Claims

1.一种分离环磷腺苷的方法，该方法包括用阴离子交换柱吸附环磷腺苷溶液；将碱性溶液作为洗杂剂对吸附后的阴离子交换柱进行洗杂；然后将酸性溶液作为洗脱剂对该阴离子交换柱进行洗脱。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述阴离子交换柱的树脂是C2-C4羟烷化苯乙烯-二乙烯苯共聚得到的亲水性树脂，功能性基团为仲胺、叔胺或季铵基团。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述功能性基团为-R-Z，其中R为C2-C4的烯烃链，且选择性地对其中一个碳原子进行羟基化；Z表示-NH₂、-NR₁R₂或-NR₁R₂R₃ ⁺OH^-或其盐，其中R₁、R₂、R₃分别为C1-C4烷基链，且选择性对碳原子进行羟基化。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述阴离子交换柱的内部可交换基团容量为1.3-2mep/g湿树脂。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述阴离子交换柱的树脂的比表面积为600-700m²/g。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述阴离子交换柱的树脂填充量为每克湿离子交换树脂吸附0.08-0.15g环磷腺苷。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述碱性溶液为0.001-2摩/升的氨水、氢氧化钠溶液和氢氧化钾水溶液中的一种或多种；所述酸性溶液为0.001-2摩/升的盐酸、硫酸和磷酸水溶液中的一种或多种。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述环磷腺苷溶液中含有的环磷腺苷的浓度为5-20克/升，优选为5g/L-10g/L；pH值为6-11，优选为7-9。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，该方法还包括在洗脱之后进行再生，用0.001mol/L-2mol/L的盐酸或硫酸溶液将该离子交换柱浸泡3-24小时，然后用去离子水淋洗到中性。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，该方法还包括将洗脱液脱盐、结晶、干燥得到环磷腺苷。