CN102260665A - 一种马来酰化壳聚糖微球固定化脲酶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种马来酰化壳聚糖聚合物微球固定化脲酶的方法，该方法属于生物工程技术领域，其方法是：向烧瓶中加入油相溶剂、少量乳化剂和单体，调节转速，升温至65℃，0.5h后，加入马来酰化壳聚糖水溶液、脲酶-磷酸盐缓冲溶液、过硫酸铵引发剂，并升温至75℃搅拌均匀后，再加入水溶性交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺，反应1～6h。将产物冷却至室温后，先用油相溶剂洗涤3次，除去未反应的反应物及副产物，再用梯度洗脱的方法用无水乙醇或丙酮洗3次，得到固定化脲酶的聚合物微球。本发明制备固定化脲酶聚合物微球的方法，无需去除模板，操作简便，可最大限度地保留包埋物的活性，具有广泛的应用前景和实用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种聚合物微球用于固定化脲酶的方法，尤其是一种马来酰化壳聚糖聚合物微球用于固定化脲酶的方法。
背景技术
脲酶是一种具有绝对专一性的氨基水解酶，可以催化尿素水解产生氨和二氧化碳，广泛应用于农学、分析化学、临床医学、医学检验和环保监控等领域。脲酶价格昂贵，溶液中的脲酶不稳定，容易变性和失活，反应后脲酶难以分离回收，无法重复利用，限制了脲酶的应用。为了提高脲酶在溶液中的稳定性，重复使用性和贮存稳定性，可采用适当的方法将脲酶固定化，从而很好的克服游离态脲酶的缺点。固定化脲酶的载体主要分为无机材料和有机材料，其中有机材料包括聚合物（如改性聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇）、藻朊酸盐和壳聚糖及其衍生物等。固定化脲酶的方法主要有物理吸附法、化学交联法、包埋法和共价结合法等。固定化脲酶的应用主要包括：电极的研制及应用、废水处理和生物医学等方面。
发明内容
鉴于上述技术的状况，本发明采用了反相悬浮聚合法，以马来酰化壳聚糖和单体为原料，提供了一步制备马来酰化壳聚糖微球固定化脲酶的方法，克服了现有微球固定化脲酶制备方法步骤繁琐的缺陷，且在制备过程中无有害物质生成。使其固定化脲酶的热稳定性和贮存稳定性都显著增强。
本发明是通过以下步骤完成的：
（1）在玻璃容器中加入一定配比的乳化剂、油相溶剂和单体，室温搅拌，使单体充分溶解，组成油相；
（2）将一定配比的脲酶、引发剂和马来酰化壳聚糖溶解到水中组成水相；
（3）在65℃下将水相缓慢滴加至油相，并升温到75℃，最后加入一定配比的水溶性交联剂N, N-亚甲基双丙烯酰胺水溶液，恒温反应1～6h；
（4）反应完毕后，降至室温，先用油相溶剂洗涤3次，除去未反应的反应物及副产物，再采用梯度洗脱的方法用无水乙醇或丙酮洗3次，得到固定化脲酶的聚合物微球。
本发明中的油相溶剂为乙酸乙酯、醋酸异戊酯中的一种或一种以上的混合物。
本发明中的乳化剂是选自Span80、Span20、Tween80、Tween20中的一种或一种以上的混合物。
本发明中的乳化剂含量是单体质量的1～25%。
本发明中的单体选自丙烯酸酯类、甲基丙烯酸酯类、苯乙烯、甲基苯乙烯、丙烯腈、甲基丙烯腈中的一种或一种以上的混合物。
本发明中的马来酰化壳聚糖水溶液质量分数是0.5%～3%。
本发明中的脲酶水溶液浓度是0.1～15mg/mL。
本发明中的过氧类引发剂选自过硫酸铵、过硫酸钾中的一种或一种以上的混合物。
本发明中的引发剂含量是单体质量的0.01～1%。
本发明中的交联剂含量是单体质量的0.1～2%。
本发明提及的梯度洗脱法是又称为梯度淋洗或程序洗脱，按一定程度不断改变流动相的浓度配比，指将产物冷却至室温后，先用乙酸乙酯洗涤3次，除去未反应的反应物及副产物，再采用无水乙醇或丙酮洗3次，所得的样品即为马来酰化壳聚糖聚合物微球。
本发明的积极效果是：本发明采用反相悬浮聚合法，以马来酰化壳聚糖和单体为原料，无需去除模板，操作简便，可最大限度地保留包埋物的活性，一步制备马来酰化壳聚糖微球固定化脲酶，使得脲酶的性质更加稳定，具有广泛的应用前景和实用价值。
具体实施方式
实施例1
向100mL四口烧瓶中加入30ml乙酸乙酯、1mLSpan-80、7ml丙烯酸甲酯，转速为800R/min，调温至65℃。0.5h后，加入6ml，质量分数为1%马来酰化壳聚糖水溶液、1mL 5%过硫酸铵引发剂和3mL 1mg/mL脲酶，并升温至75℃搅拌均匀后，再加入3mL 4%水溶性交联剂N, N-亚甲基双丙烯酰胺，反应1h。将产物冷却至室温后，先用乙酸乙酯洗涤3次，除去未反应的反应物及副产物，再采用梯度洗脱的方法用无水乙醇或丙酮洗3次，得到固定化脲酶的聚合物微球。
实施例2
向100mL四口烧瓶中加入30ml乙酸乙酯、1mLSpan-80、7ml甲基丙烯酸正丁酯，转速为800R/min，调温至65℃。0.5h后，加入6ml，质量分数为2%马来酰化壳聚糖水溶液、1mL 5%过硫酸铵引发剂和3mL 1mg/mL脲酶，并升温至75℃搅拌均匀后，再加入3mL 4%水溶性交联剂N, N-亚甲基双丙烯酰胺，反应3h。将产物冷却至室温后，先用乙酸乙酯洗涤3次，除去未反应的反应物及副产物，再采用梯度洗脱的方法用无水乙醇或丙酮洗3次，得到固定化脲酶的聚合物微球。
实施例3
向100mL四口烧瓶中加入30ml乙酸乙酯、1mLSpan-80、7ml甲基丙烯酸甲酯，转速为800R/min，调温至65℃。0.5h后，加入6ml，质量分数为2%马来酰化壳聚糖水溶液、1mL 5%过硫酸铵引发剂和3mL 1mg/mL脲酶，并升温至75℃搅拌均匀后，再加入3mL 4%水溶性交联剂N, N-亚甲基双丙烯酰胺，反应6h。将产物冷却至室温后，先用乙酸乙酯洗涤3次，除去未反应的反应物及副产物，再采用梯度洗脱的方法用无水乙醇或丙酮洗3次，得到固定化脲酶的聚合物微球。
Claims (10)
1.一种马来酰化壳聚糖微球固定化脲酶的制备方法，其方法步骤是：
（1）向烧瓶容器中加入一定配比的乳化剂、油相溶剂和单体，室温搅拌，使单体充分溶解，组成油相；
（2）将一定配比的脲酶、引发剂和马来酰化壳聚糖溶解到水中组成水相；
（3）在65℃下将水相缓慢滴加至油相中，并升温到75℃，最后加入一定配比的水溶性交联剂N, N-亚甲基双丙烯酰胺，恒温反应1～6h；
（4）反应完毕后，降至室温，先用油相溶剂洗涤3次，除去未反应的反应物及副产物，再用梯度洗脱法用无水乙醇或丙酮洗3次，得到微球。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的油相溶剂为乙酸乙酯、醋酸异戊酯中的一种或一种以上的混合物。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的乳化剂选自Span80、Span20、Tween80、Tween20中的一种或一种以上的混合物。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的乳化剂含量是单体质量的1～25%。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单体选自丙烯酸酯类、甲基丙烯酸酯类、苯乙烯、甲基苯乙烯、丙烯腈、甲基丙烯腈中的一种或一种以上的混合物。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的马来酰化壳聚糖水溶液质量分数是0.5~3%。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的脲酶水溶液浓度是0.1～15mg/mL。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的引发剂选自过硫酸铵、过硫酸钾中的一种或一种以上的混合物。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的引发剂含量是单体质量的0.01～1%。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的交联剂含量是单体质量的0.1～2%。
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