CN102260631B - 一种培养用于生产柠檬酸的黑曲霉的方法 - Google Patents
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Abstract
一种培养用于生产柠檬酸的黑曲霉的方法，其中，该方法包括：将黑曲霉接种在黑曲霉培养液中进行培养，所述培养的条件使黑曲霉菌体的呼吸商为0.7-1.5，并在该呼吸商下保持2-8小时。本发明提供的方法通过呼吸商的数值来判断黑曲霉的生长状态是否适用于后续的发酵，并且通过在呼吸商为0.7-1.5的状态下保持2-8小时，从而使得到的黑曲霉在后续的发酵过程中具有较高的发酵效率，并且本发明提供的方法受人为因素的影响很小，能够保持批次之间黑曲霉培养的稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及一种培养用于生产柠檬酸的黑曲霉的方法。
背景技术
柠檬酸是广泛应用于饮料、食品及医药等行业的一种有机酸，我国是柠檬酸生产大国，有20余家生产厂，产量已超过80万吨。在进行发酵以制备柠檬酸之前，通常需要对用于生产柠檬酸的黑曲霉进行培养，以扩大黑曲霉的量并使其生长状态处于适于进行发酵的状态。
目前，在发酵之前对黑曲霉进行培养时，通常是通过观察来判断黑曲霉的生长是否符合用于生产柠檬酸的发酵应用，但现有的方法培养的黑曲霉的发酵效率较低，并且通过观察并不能够真实地反映黑曲霉的生长状态，同时受人为因素的影响较大，导致各批次培养的黑曲霉的生长状态差异较大，从而对后续的发酵产生不良的影响。
因此，迫切需要开发一种使黑曲霉在后续发酵过程中具有较高发酵效率并且能够准确地判断黑曲霉的生长状态的黑曲霉的培养方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有的方法培养的黑曲霉的发酵效率较低、并且不能够真实地反映黑曲霉的生长状态且受人为因素的影响较大的缺点，提供一种使黑曲霉在后续发酵过程中具有较高发酵效率并且能够准确地判断黑曲霉的生长状态的黑曲霉的培养方法。
本发明提供了一种培养用于生产柠檬酸的黑曲霉的方法，其中，该方法包括：将黑曲霉接种在黑曲霉培养液中进行培养，所述培养的条件使黑曲霉菌体的呼吸商为0.7-1.5，并在该呼吸商下保持2-8小时。
本发明提供的方法通过呼吸商的数值来判断黑曲霉的生长状态是否适用于后续的发酵，并且通过在呼吸商为0.7-1.5的状态下保持2-8小时，从而使得到的黑曲霉在后续的发酵过程中具有较高的发酵效率，并且本发明提供的方法受人为因素的影响很小，能够保持批次之间黑曲霉培养的稳定性。
具体实施方式
本发明提供了一种培养用于生产柠檬酸的黑曲霉的方法，其中，该方法包括：将黑曲霉接种在黑曲霉培养液中进行培养，所述培养的条件使黑曲霉菌体的呼吸商为0.7-1.5，并在该呼吸商下保持2-8小时。
术语“呼吸商”是指二氧化碳释放速率与氧消耗速率的比值。呼吸商是各种碳源在发酵过程中代谢状况的指示值，表征的是基质利用情况及其代谢途径状况。
所述呼吸商的检测方法可以为各种能够检测微生物呼吸商的方法，例如，利用质谱仪或尾气分析仪检测培养过程中的尾气成分，计算二氧化碳释放速率和氧消耗速率，然后计算得出呼吸商。
一方面，所述培养的条件使黑曲霉的呼吸商优选为0.85-1.0，在此范围内的呼吸商能够使培养的黑曲霉更适合于后续的发酵，使其发酵效率更为理想。
另一方面，所述保持的时间优选为3-5小时，本发明人惊奇地发现，在这样的保持时间范围内，能够进一步地提高黑曲霉在后续发酵中的效率，从而使其处于更适于发酵的状态。
根据本发明，所述黑曲霉培养液的制备方法没有特别的限制，只要得到的培养液能够适用于黑曲霉的培养即可，例如，所述黑曲霉培养液的制备方法可以包括：在淀粉浆液中加入淀粉酶，以20-150℃/每小时的速度升温至90-100℃并在该温度下进行一次喷射，5-30分钟之后进行闪蒸，待温度降至80-95℃时在该温度下酶解淀粉90-140分钟，得到液化液并稀释至总糖为5-20重量％，之后加入氮源并灭菌。术语总糖是指酶解液化液中所含糖的总含量。
根据本发明，所述淀粉浆液中，淀粉和水的含量以及浆液的pH可以在很大范围内改变，优选情况下，所述淀粉的含量为10-25重量％，水的含量为75-90重量％，所述淀粉浆液的pH值为5-7。
本发明中，所述淀粉酶的用量越多越好，出于成本考虑，优选情况下，相对于1000重量份的淀粉，所述淀粉酶的加入量可以为0.4-1.0重量份。
淀粉酶是指能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，所述淀粉酶可以为α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶中的一种或多种。本发明所述酶包括淀粉酶。
α-淀粉酶又称淀粉1，4-糊精酶，它能够任意地、不规则地切开淀粉链内部的α-1，4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖。生产此酶的微生物主要有枯草杆菌、黑曲霉、米曲霉和根霉。
β-淀粉酶又称淀粉1，4-麦芽糖苷酶，能够从淀粉分子非还原性末端切开1，4-糖苷键，生成麦芽糖。此酶作用于淀粉的产物是麦芽糖与极限糊精。此酶主要由曲霉、根霉和内孢霉产生。
糖化酶又称淀粉α-1，4-葡萄糖苷酶，此酶作用于淀粉分子的非还原性末端，以葡萄糖为单位，依次作用于淀粉分子中的α-1，4-糖苷键，生成葡萄糖。糖化酶作用于支链淀粉后的产物有葡萄糖和带有α-1，6-糖苷键的寡糖；作用于直链淀粉后的产物几乎全部是葡萄糖。此酶产生菌主要是黑曲霉(左美曲霉、泡盛曲霉)、根霉(雪白根酶、德氏根霉)、拟内孢霉、红曲霉。
异淀粉酶又称淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于枝链淀粉分子分枝点处的α-1，6-糖苷键，将枝链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。此酶产生菌主要是嫌气杆菌、芽孢杆菌及某些假单孢杆菌等细菌。
根据本发明，所述氮源的种类为本领域技术人员所公知，例如，所述氮源可以为尿素、硫酸铵和硝酸铵中的一种或几种，所述氮源的加入量可以在很大范围内改变，优选情况下，以所述黑曲霉培养液的总重量为基准，所述氮源的加入量为0.05-0.5重量％。
本发明中，所述黑曲霉的接种量可以在很大范围内改变，优选情况下，以每克黑曲霉培养液为基准，黑曲霉的接种量为0.5-5×105个菌落形成单位。所述菌落形成单位的定义为将稀释后的一定量的菌液通过浇注或涂布的方法，让其内的微生物单细胞一一分散在培养基平板上，待培养后，每一活细胞就形成一个菌落。即每毫升菌液中含有的单细胞的数目。所述菌落形成单位可以通过本领域公知的方法测定，例如，通过血球计数板计数法测定。
所述黑曲霉可以为商购的黑曲霉固体制剂或黑曲霉菌种，例如，黑曲霉Co827(上海新立工业微生物科技有限公司)、黑曲霉T01(天津工业微生物所)和黑曲霉菌株(中科院微生物所)。
根据本发明，所述培养的条件可以在很大范围内改变，例如所述培养的条件可以包括：培养的温度可以为25-45℃，pH值可以为2-7，通气量可以为0.1-1体积：体积·分钟，培养的时间可以为45-65小时；更优选的情况下，所述培养的条件可以包括：培养的温度可以为30-40℃，pH值可以为2.5-6.5，通氧量可以为1∶0.2-0.8，所述培养的时间可以为50-60小时。
术语“通气量”一般以通气比来表示，通常以每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比来表示(V/V·min)，例如通气比为1∶0.1-1，简称通气量为0.01-1体积：体积·分钟。
所述培养的设备为本领域技术人员所公知，例如，可以使用发酵罐进行培养。
下面通过实施例对本发明进行更加详细的说明。
实施例1
(1)将干玉米粉和水调浆，干玉米粉和水的比例使得到的浆液中，淀粉的含量为15重量％，水的含量为85重量％，并用氢氧化钠控制浆液的pH值为6.2，相对于1000重量份的淀粉，加入0.6重量份的淀粉酶(诺维信公司，α-淀粉酶)，并以40℃/小时的速度升温至96℃，并在该温度下进行一次喷射液化，10分钟后进行闪蒸，待温度降至90℃时，在该温度下酶解淀粉100分钟，得到液化液。
(2)取7.5重量％的步骤(1)中得到的液化液，加水稀释至总糖浓度为10重量％后投入种子罐，加入尿素，尿素的加入量为种子罐培养液总重量的0.35％，加热到120℃消毒，维持20分钟后快速降温至36℃，接入黑曲霉菌种(黑曲霉T01，天津工业微生物所)，在36℃振荡，并在通气量为0.4的条件下进行菌种培养；在培养过程中将培养尾气接入质谱仪，在线记录二氧化碳释放速率和氧消耗速率，并在线计算呼吸商，在呼吸商在0.75下维持7小时。
(3)取85重量％的步骤(1)中得到的液化液，采取固液分离方法进行分离，并将分离得到的液化清液投入到发酵罐中；并将未经过固液分离的剩余的7.5重量％的步骤(1)得到的液化液也投入到发酵罐中，并检测发酵液中的总糖，然后加入尿素，尿素的加入量为发酵罐培养液总重量的0.1％，加热到85℃消毒，维持8分钟后降温至37℃；
(4)将步骤(2)中培养的黑曲霉移入到步骤(4)中的发酵罐中，在37℃、0.4体积：体积·分钟的通气的条件下培养60小时，发酵结束，采用固液分离的方法得到柠檬酸发酵液。
对比例1
根据与实施例1相同的方法进行发酵，不同在于，步骤(2)中的黑曲霉培养方法为：取7.5重量％的步骤(1)中得到的液化液，加水稀释至总糖10％投入种子罐，加入尿素，尿素的加入量为种子罐培养液总重量的0.35％，加热到120℃消毒，维持20分钟后快速降温至36℃，接入黑曲霉菌种(黑曲霉T01，天津工业微生物所)，在37℃、0.4体积：体积·分钟的通气条件下进行菌种培养；通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，当pH在2.5、酸度1.0％、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时，停止培养并将步骤(3)中的发酵罐中进行发酵。
实施例2
(1)将干玉米粉和水调浆，干玉米粉和水的比例使得到的浆液中，淀粉的含量为25重量％，水的含量为75重量％，并控制浆液的pH值为5.5，相对于1000重量份的淀粉，加入0.5重量份的淀粉酶(诺维信公司，a-淀粉酶)，并以80℃/小时的速度升温至100℃，并在该温度下进行一次喷射液化，15分钟后进行过闪蒸，待温度降至80℃时，在该温度下酶解淀粉120分钟，得到液化液。
(2)取7.5重量％的步骤(1)中得到的液化液，加水稀释至总糖10％投入种子罐，加入硝酸铵，硝酸铵的加入量为种子罐培养液总重量的0.1％，加热到120℃消毒，维持20分钟后快速降温至36℃，接入黑曲霉菌种(黑曲霉T01，天津工业微生物所)，在30℃、0.8体积：体积·分钟的通气条件下进行菌种培养；在培养过程中将培养尾气接入质谱仪，在线记录二氧化碳释放速率和氧消耗速率，并在线计算呼吸商，在呼吸商在1.3下维持2小时。
(3)取85重量％的步骤(1)中得到的液化液，采取固液分离方法进行分离，并将分离得到的液化清液投入到发酵罐中；并将未经过固液分离的剩余的7.5重量％的步骤(1)得到的液化液也投入到发酵罐中，并检测发酵液中的总糖，然后加入尿素，尿素的加入量为发酵罐培养液总重量的0.1％，加热到85℃消毒，维持8分钟后降温至37℃；
(4)将步骤(2)中培养的黑曲霉移入到步骤(3)中的发酵罐中，在37℃、0.4体积：体积·分钟的条件下培养60小时，发酵结束，采用固液分离的方法得到柠檬酸发酵液。
实施例3
(1)将干玉米粉和水调浆，干玉米粉和水的比例使得到的浆液中，淀粉的含量为20重量％，水的含量为80重量％，并控制浆液的pH值为6.5，相对于1000重量份的淀粉，加入0.6重量份的淀粉酶(诺维信公司，a-淀粉酶)，并以40℃/小时的速度升温至96℃，并在该温度下进行一次喷射液化，10分钟后进行过闪蒸，待温度降至90℃时，在该温度下酶解淀粉100分钟，得到液化液。
(2)取7.5重量％的步骤(1)中得到的液化液，加水稀释至总糖10％投入种子罐，加入尿素，尿素的加入量为种子罐培养液总重量的0.35％，加热到120℃消毒，维持20分钟后快速降温至36℃，接入黑曲霉菌种(黑曲霉T01，天津工业微生物所)，在37℃、0.4体积：体积·分钟的通气条件下进行菌种培养；在培养过程中将培养尾气接入质谱仪，在线记录二氧化碳释放速率和氧消耗速率，并在线计算呼吸商，在呼吸商在0.9下维持3小时。
(3)取85重量％的步骤(1)中得到的液化液，采取固液分离方法进行分离，并将分离得到的液化清液投入到发酵罐中；并将未经过固液分离的剩余的7.5重量％的步骤(1)得到的液化液也投入到发酵罐中，并检测发酵液中的总糖，然后加入尿素，尿素的加入量为发酵罐培养液总重量的0.1％，加热到85℃消毒，维持8分钟后降温至37℃；
(4)将步骤(2)中培养的黑曲霉移入到步骤(3)中的发酵罐中，在37℃、0.4体积：体积·分钟的通气的条件下培养60小时，发酵结束，采用固液分离的方法得到柠檬酸发酵液。
实施例4
(1)将干玉米粉和水调浆，干玉米粉和水的比例使得到的浆液中，淀粉的含量为12重量％，水的含量为88重量％，并控制浆液的pH值为6.0，相对于1000重量份的淀粉，加入0.8重量份的淀粉酶(诺维信公司，a-淀粉酶)，并以60℃/小时的速度升温至85℃，并在该温度下进行一次喷射液化，20分钟后进行过闪蒸，待温度降至80℃时，在该温度下酶解淀粉110分钟，得到液化液。
(2)取7.5重量％的步骤(1)中得到的液化液，加水稀释至总糖10％投入种子罐，加入尿素，尿素的加入量为种子罐培养液总重量的0.35％，加热到120℃消毒，维持20分钟后快速降温至36℃，接入黑曲霉菌种(黑曲霉T01，天津工业微生物所)，在37℃、0.4体积：体积·分钟的通气条件下进行菌种培养；在培养过程中将培养尾气接入质谱仪，在线记录二氧化碳释放速率和氧消耗速率，并在线计算呼吸商，在呼吸商在1.0下维持5小时。
(3)取85重量％的步骤(1)中得到的液化液，采取固液分离方法进行分离，并将分离得到的液化清液投入到发酵罐中；并将未经过固液分离的剩余的7.5重量％的步骤(1)得到的液化液也投入到发酵罐中并检测发酵液中的总糖，然后加入尿素，尿素的加入量为发酵罐培养液总重量的0.1％，加热到85℃消毒，维持8分钟后降温至37℃；
(4)将步骤(2)中培养的黑曲霉移入到步骤(3)中的发酵罐中，在37℃、0.4体积：体积·分钟的通气的条件下培养60小时，发酵结束，采用固液分离的方法得到柠檬酸发酵液。
实施例5-8
根据GB GB 1987-2007标准检测实施例1-4中发酵后发酵液的浓度(简称酸度)，并计算柠檬酸的转化率，转化率(％)＝发酵液的浓度(简称酸度)×发酵液的体积/总糖的重量×100％，结果如表1所示。
对比例2
根据与实施例5-8中相同的方法计算对比例1中发酵的酸度和转化率，结果如表1所示。
表1
| 编号 | 实施例5 | 对比例2 | 实施例6 | 实施例7 | 实施例8 |
| 浓度(简称酸度) | 15.7％ | 13.8％ | 15.8％ | 16.6％ | 16.8％ |
| 转化率(％) | 94.7％ | 89.5％ | 94.2％ | 95.7％ | 96.1％ |
从上表1中的数据可以看出，本发明提供的培养用于生产柠檬酸的黑曲霉的方法，使得到的黑曲霉在后续的发酵过程中具有较高的发酵效率(酸度和转化率)，并且本发明提供的方法受人为因素的影响很小，能够保持批次之间黑曲霉培养的稳定性。
此外，相对于实施例1和2，当所述培养的条件使黑曲霉菌体的呼吸商为8.5-1.0并在该呼吸商下保持3-5小时的条件下(实施例3和4)，能够进一步地提高黑曲霉在后续发酵中的效率，从而使其处于更适于发酵的状态。
Claims (8)
1.一种培养用于生产柠檬酸的黑曲霉的方法，其中，该方法包括：将黑曲霉接种在黑曲霉培养液中进行培养，所述培养的条件使黑曲霉菌体的呼吸商到0.7-1.5，并在该呼吸商下保持2-8小时，所述黑曲霉培养液含有淀粉酶解液化液和氮源，所述淀粉酶解液化液中的总糖含量为5-20重量%，以所述黑曲霉培养液的总重量为基准，所述氮源的加入量为0.05-0.5重量%。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述呼吸商为0.85-1.0。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述保持的时间为3-5小时。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述黑曲霉培养液的制备方法包括：在淀粉浆液中加入淀粉酶，以20-150℃/每小时的速度升温至90-100℃并在该温度下进行一次喷射，5-30分钟之后进行闪蒸，待温度降至80-95℃时在该温度下酶解淀粉90-140分钟，得到液化液并稀释至总糖为5-20重量%，之后加入氮源并灭菌。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述淀粉浆液中，淀粉的含量为10-25重量%，水的含量为75-90重量%，所述淀粉浆液的pH值为5-7。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，相对于1000重量份的淀粉，所述淀粉酶的加入量为0.4-1.0重量份。
7.根据权利要求1或4所述的方法，其中，所述氮源选自尿素、硝酸铵和硫酸铵中的一种或几种。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，以每克黑曲霉培养液为基准，黑曲霉的接种量为0.5-5×105个菌落形成单位。
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