CN102260349A - 用于治疗和预防阿尔茨海默病的抗Aβ31-35抗体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于治疗和预防阿尔茨海默病(AD)的抗Aβ31-35抗体,制备方法:采用有机固相合成法合成氨基酸序列为Ile-Ile-Gly-Leu-Met的Aβ31-35片段,纯化,分析,与血蓝蛋白偶联,偶联物对大白兔进行基础免疫和加强免疫后获得抗Aβ31-35抗体。将该抗体用于在体AD动物实验或临床AD患者治疗,可有效避开APP上处于跨膜部分的结合位点,选择性清除细胞外的Aβ。与传统的针对AβN-末端的抗体相比,抗Aβ31-35抗体在预防和治疗AD中将具有副作用更小、特异性更强的特点。
Description
技术领域
本发明涉及抗Aβ抗体,具体属于一种用于治疗和预防阿尔茨海默病的抗Aβ31-35抗体及其制备方法。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD),又名老年性痴呆,是一种中枢神经系统原发性退行性疾病,主要表现为进行性认知功能障碍、学习和记忆能力丧失、个性改变,晚期出现严重痴呆。AD最典型的病理特征是脑内出现大量、高密度的老年斑,其主要成分是淀粉样β蛋白(Amyloid β protein,Aβ)。Aβ的神经毒性作用已被广泛报道。如图1所示,Aβ来自于跨膜的淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein,APP),但APP本身具有神经营养作用。传统的AD免疫疗法多使用针对AβN-末端的抗体,其虽然具有一定疗效,但副作用较大,能与APP位于细胞外的结构域结合从而伤害正常的APP。因此,目前临床实验已经暂停。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于治疗和预防阿尔茨海默病的抗Aβ31-35抗体及其制备方法,抗Aβ31-35抗体在预防和治疗AD中应具有副作用小、特异性强的特点。
本发明提供的一种用于治疗和预防阿尔茨海默病的抗Aβ31-35抗体,通过包括如下步骤的方法制得:
(1)采用有机固相合成法合成氨基酸序列为Ile-Ile-Gly-Leu-Met的Aβ31-35片段,固相载体用HMP树脂,保护氨基酸采用Fmoc(9-fluorenylmethyloxycarbony),从多肽羧基端向氨基端合成,用TFA法裂解肽树脂,经减压蒸馏和乙醚萃取方法处理后得到粗品Aβ31-35片段;再用高效液相反相色谱法(high-performance liquid chromatography,HPLC)进行纯化,分析;取纯化后的Aβ31-35片段与血蓝蛋白偶联,偶联方法是用碳化二亚胺法[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide,EDC]进行缩合反应,得到Aβ31-35片段-血蓝蛋白偶联物(抗原);
(2)用该偶联物对大白兔进行基础免疫和加强免疫后获得抗Aβ31-35抗体。
我们已经研究了抗Aβ31-35抗体对脑室注射Aβ或神经细胞培养中加入Aβ所致脑功能或细胞伤害的保护效应,效果明显。这种抗体可以在制备治疗和预防阿尔茨海默病药物中应用。
与现有技术相比本发明设计并制备针对Aβ31-35序列的抗Aβ31-35抗体,不仅能特异性封闭或阻断内源性Aβ发挥神经毒性作用的活性中心,而且更重要的是,由于抗Aβ31-35抗 体只能与细胞外的Aβ特异结合,不能与跨膜结构中APP分子上处于膜结构内相应的31-35序列接触,因而抗Aβ31-35抗体在结合、清除Aβ的同时,可避免与跨膜蛋白APP的结合,从而不会影响APP发挥正常的促神经元生长、发育的作用。因此,与传统的针对AβN-末端的抗体相比,抗Aβ31-35抗体在预防和治疗AD中将具有副作用更小、特异性更强的特点。
附图说明
图1人Aβ淀粉样前体蛋白(APP695)结构示意图。
图2抗Aβ31-35抗体预处理对Aβ1-42引起的大鼠空间学习记忆行为伤害的影响。其中:A,各组大鼠在第1-4训练日的寻台潜伏期变化;B,第3训练日典型的大鼠游泳轨迹。
图3抗Aβ31-35抗体预处理对Aβ1-42引起的大鼠海马LTP抑制的影响。其中:A,连续记录的海马CA1区场电位幅度变化,显示0.5nmol抗Aβ31-35抗体对Aβ1-42引起的LTP压抑具有部分恢复效应;B,不同处理组在高频刺激后三个时间点的幅度变化比较,显示抗Aβ31-35抗体对LTP的剂量依赖性保护效应。
图4Aβ1-42对培养神经元的伤害作用和抗Aβ31-35抗体的预处理效应。
图5Aβ31-35(A)和Aβ25-35(B)对海马培养细胞细胞内钙水平的剂量依赖性升高效应。
具体实施方式
实施例1
用于治疗和预防阿尔茨海默病的抗Aβ31-35抗体的制备步骤:
(1)抗原制备
采用有机固相合成法合成Aβ31-35片段,固相载体用HMP树脂,保护氨基酸采用Fmoc(9-fluorenylmethyloxycarbony)保护的氨基酸,从多肽羧基端向氨基端合成,用TFA法裂解肽树脂,经减压蒸馏和乙醚萃取方法处理后得到粗品Aβ31-35片段。再用高效液相反相色谱法(high-performance liquid chromatography,HPLC)进行纯化,纯化后的样品再用HPLC分析,纯度为95%,将纯化后的Aβ31-35片段冷冻抽干。
取纯化后的Aβ31-35片段与血蓝蛋白偶联,偶联方法是用碳化二亚胺法[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide,EDC]进行缩合反应,得到Aβ31-35片段-血蓝蛋白偶联物(抗原)。
(2)抗体制备
新西兰大白兔2只,雄性,经过检疫无病原菌的一级动物,体重为1.5kg,免疫前行耳静脉采血分离血清,冻存作为阴性对照血清。
基础免疫:取Aβ31-35片段-血蓝蛋白偶联物2mg/ml与等量CFA充分乳化后于两只兔背部皮下多点注射,每次免疫的抗原量为1000μg/只。
加强免疫:第一次免疫后间隔2周,再以1mg/1ml抗原加等体积的IFA充分乳化后注入兔背部皮下多点加强免疫。而后每隔2周按第二次免疫法重复加强免疫6次。每次免疫后的第12天,行颈动脉插管取血,分离血清得到抗Aβ31-35抗体,效价为1∶16000。
实施例2
我们观察了抗Aβ31-35抗体对脑室注射Aβ或神经细胞培养中加入Aβ所致脑功能或细胞伤害的保护效应。主要结果如下:
(1)Morris水迷宫实验图2显示了各组大鼠寻找水下平台的平均潜伏期(A)和典型的游泳轨迹(B)。与正常大鼠比较,脑室内注射5nmol Aβ1-42可导致寻台潜伏期明显延长;不同浓度的抗Aβ31-35抗体处理后,潜伏期和游泳距离缩短,特别是0.5和5nmol的抗Aβ31-35抗体预处理组在各训练日均明显小于单独使用Aβ1-42组(P<0.01),表明Aβ引起的行为学伤害可被抗Aβ31-35抗体所逆转。
(2)在体海马LTP预实验如图3所示,急性给予Aβ1-42不影响高频刺激前测试刺激引起的fEPSP,但HFS诱导的LTP受到Aβ1-42片段的显著压抑。联合给予不同浓度的抗Aβ31-35抗体后,Aβ1-42引起的LTP压抑效应被明显逆转。图3A显示了0.5nmol的抗Aβ31-35抗体对Aβ1-42引起的LTP压抑的恢复效应。较高浓度(5nmol)抗Aβ31-35抗体几乎完全逆转了Aβ1-42引起的LTP损害(图3B)。
(3)细胞生存和细胞毒性预实验图4显示了Aβ1-42对培养神经元的损害作用和抗Aβ31-35抗体的预处理效应。发现:20μM Aβ1-42预处理24小时后细胞存活率较对照组明显下降(绿色细胞为Calcein-AM染色标记活细胞,红色细胞为PI染色标记的死亡细胞);给予20μM抗Aβ31-35抗体预处理后可以明显抑制Aβ1-42诱导的细胞损伤。
(4)细胞内钙成像预实验初步结果显示,Aβ31-35(图5A)的效应类似于Aβ25-35(图5B),两者均能升高[Ca2+]i,且都具有一定程度的剂量依赖性。其中,给予10μM和20μM的Aβ31-35时,荧光比值R(F340/F380)可分别增加21.1%和70.7%(P值均<0.05)。提示:小片段的Aβ31-35具有类似于Aβ25-35以及内源性大分子Aβ的效应,可以剂量依赖性引起海马细胞内Ca2+水平升高,这可能与Aβ产生的细胞毒性有关。目前,抗Aβ31-35抗体对细胞钙超载的研究正在进行中。
SEQUENCE LISTING
<110>山西医科大学
<120>用于治疗和预防阿尔茨海默病的抗Aβ31-35抗体及其制备方法
<130>0
<160>1
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>5
<212>PRT
<213>人工合成
<400>1
Ile Ile Gly Leu Met
1 5。
Claims (2)
1.一种用于治疗和预防阿尔茨海默病的抗Aβ31-35抗体,其特征在于,通过包括如下步骤的方法制得:
(1)采用有机固相合成法合成氨基酸序列为Ile-Ile-Gly-Leu-Met的Aβ31-35片段,其中固相载体用HMP树脂,保护氨基酸采用9-fluorenylmethyloxycarbony,从多肽羧基端向氨基端合成,用TFA法裂解肽树脂,经减压蒸馏和乙醚萃取方法处理后得到粗品Aβ31-35片段;再用高效液相反相色谱法进行纯化;取纯化后的Aβ31-35片段与血蓝蛋白偶联,偶联方法是用碳化二亚胺法进行缩合反应,得到Aβ31-35片段-血蓝蛋白偶联物;
(2)用该偶联物对大白兔进行基础免疫和加强免疫后获得抗Aβ31-35抗体。
2.如权利要求1所述的抗Aβ31-35抗体在制备治疗和预防阿尔茨海默病药物中的应用。
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