WO2014171434A1 - アミロイドβ蛋白質により誘発される認知障害の治療剤およびアルツハイマー病治療薬、ならびにこれらに関連する治療方法および病態解析方法 - Google Patents

アミロイドβ蛋白質により誘発される認知障害の治療剤およびアルツハイマー病治療薬、ならびにこれらに関連する治療方法および病態解析方法 Download PDF

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acid sequence
peptide
seq
amyloid
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井上　剛
鈴木　利治
沙緒里 伴
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国立大学法人岡山大学
国立大学法人北海道大学
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    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a peptide having a therapeutic effect on cognitive impairment induced by amyloid ⁇ protein, which is a symptom of Alzheimer's disease, and a use thereof.
  • Alzheimer's disease is a neurological disease whose main symptom is cognitive decline (such as memory impairment). Although it is particularly common among elderly people, there is no effective therapeutic drug, which is a big problem in developed countries that are facing an aging society. Senile plaques are observed in the postmortem brain of Alzheimer's disease patients, which are known to be aggregates of “amyloid ⁇ protein”. And it is widely accepted by many studies that this amyloid ⁇ protein is the main cause of Alzheimer's disease.
  • Amyloid ⁇ protein is produced from its precursor “amyloid precursor protein”.
  • An amyloid precursor protein is a membrane protein present on the nerve cell membrane.
  • the extracellular domain is cleaved with ⁇ -secretase and then the intracellular membrane domain is cleaved with ⁇ -secretase, so that a peptide called p3 is produced and released outside the cell. This is known as a “non-amyloid production pathway”, and amyloid ⁇ protein is not produced (Non-patent Document 1).
  • the extracellular domain is only a few percent, it is cleaved by ⁇ -secretase, and amyloid ⁇ protein is secreted extracellularly.
  • amyloid ⁇ protein increases or amyloid ⁇ protein molecular species with higher aggregation properties are generated.
  • This aggregation property of the amyloid ⁇ protein finally forms senile plaques (amyloid aggregates) of Alzheimer's disease patients and is observed as deposition in the brain.
  • Non-patent Documents 2 and 3 The cut out amyloid ⁇ protein gradually aggregates, and finally senile plaques (amyloid aggregates) are formed, but the “oligomer (aggregates of several amyloid ⁇ proteins)” in the aggregation process, It is known to have strong neurotoxicity. It has been reported in both in vitro and in vivo that this amyloid ⁇ protein oligomeric body inhibits synaptic plasticity, which is a neurological phenomenon essential for memory and learning (Non-patent Documents 2 and 3). It has also been reported that memory / learning ability is lost when this oligomer is administered into the mouse brain (Non-patent Documents 4 and 5). Recent studies have reported that neuronal cell death and the like occur when exposed to this oligomer for a long period of time (Non-Patent Document 6), and have attracted attention as a causative substance of the onset of Alzheimer's disease.
  • Alzheimer's disease therapeutic agents currently used clinically are not designed to act on this amyloid ⁇ protein. More specifically, donepezil (Patent Document 1) and memantine (Patent Document 2) used as therapeutic agents for Alzheimer's disease act as acetylcholinesterase inhibitors and NMDA receptor inhibitors, respectively, and interact with amyloid ⁇ protein. is not. Since it is a so-called coping therapy, there is currently no dramatic improvement for Alzheimer's disease.
  • Non-patent Document 1 Non-patent Document 1
  • Semagacestat Patent Document 3
  • Begacestat Patent Document 4
  • Another therapeutic method that is attracting attention is antibody therapy in which the antibody recognizes and removes amyloid ⁇ protein in the brain.
  • Bapineuzumab Patent Document 5
  • solanezumab that have been clinically developed so far.
  • Non-patent Document 7 the substrate of ⁇ -secretase is not only amyloid precursor protein but nearly 100.
  • Non-patent Document 8 Notch receptor important for cell differentiation is also included (Non-patent Document 8), and there are concerns about side effects.
  • Semagacestat a potential candidate for a ⁇ -secretase inhibitor, was discontinued in a phase III clinical trial in 2010.
  • antibody therapy with anti-amyloid ⁇ antibody vasculitis and vascular cerebral edema may occur.
  • Bapineuzumab which was promising as an antibody therapeutic, was discontinued in 2012.
  • Non-patent Documents 9 and 10 Some of the ⁇ -secretase substrates are known to release the excised extracellular domain like an amyloid peptide. Since these peptides serve as indicators of ⁇ -secretase activity, there are several inventions that attempt to use the cut fragments as biomarkers for Alzheimer's disease (Patent Documents 6 and 7). It is also known that a peptide consisting of 37 amino acids (VLSSQQFLHRGHQPPPEMAGHSLASSHRNSMIPSAAT) is produced when a membrane protein in vivo called Alcadein- ⁇ is cleaved by ⁇ -secretase and further cleaved by ⁇ -secretase ( Non-patent document 11).
  • amyloid ⁇ protein is the mechanism of action, but an anti-Alzheimer agent different from the conventional mechanism of action is eagerly desired, and the present invention provides such an anti-Alzheimer agent. Let it be an issue.
  • ⁇ -secretase is known to cleave membrane proteins other than amyloid precursor protein.
  • the present inventors have made a bold hypothesis that peptide fragments other than “amyloid ⁇ protein” other than “amyloid ⁇ protein cleaved by ⁇ -secretase may exhibit an Alzheimer's disease improving action.
  • a peptide (p3-Alc ⁇ 37 peptide) consisting of 37 amino acids (VLSSQQFLHRGHQPPPEMAGHSLASSHRNSMIPSAAT) generated by cleaving the aforementioned Alcadein- ⁇ also by ⁇ -secretase and ⁇ -secretase is recognized by the amyloid ⁇ protein.
  • the present invention provides a therapeutic agent for cognitive impairment induced by amyloid ⁇ protein and a therapeutic agent for Alzheimer's disease.
  • the present invention provides a method for treating cognitive impairment induced by amyloid ⁇ protein and a method for treating Alzheimer's disease.
  • the present invention provides a pathological analysis method for cognitive impairment induced by amyloid ⁇ protein and a pathological analysis method for Alzheimer's disease.
  • the present invention includes the following inventions.
  • a therapeutic agent for cognitive impairment induced by amyloid ⁇ protein comprising as an active ingredient a peptide corresponding to any of the following (I) to (VI):
  • a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • VLSSQQFLHRGHQPPPEMAGHSLASHRNSMIPS AAT SEQ ID NO: 1
  • a peptide consisting of an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acids are altered by any one or more of deletion, addition, substitution and side chain modification to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • HRGHQPPPEMA SEQ ID NO: 2
  • One to two amino acids are deleted, added, substituted or modified in the side chain with respect to the partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 including the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • (VI) 1 to 2 amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 are deleted, added (excluding addition to the N-terminal and / or C-terminal), substitution, or side chain modification.
  • a peptide comprising an amino acid sequence modified by any one or more and having an amino acid sequence added with a total of 1 to 50 amino acids at the N-terminal and / or C-terminal of the modified amino acid sequence.
  • An amyloid ⁇ protein comprising the step of administering the therapeutic agent according to [1] to a mammal (excluding humans) that has developed cognitive impairment induced by amyloid ⁇ protein or a model animal thereof. For treating cognitive impairment induced by aging.
  • a method for treating Alzheimer's disease comprising the step of administering the therapeutic agent according to [2] to a mammal (excluding human) suffering from Alzheimer's disease or a model animal thereof.
  • a step of administering a peptide corresponding to any one of (I) to (VI) above to a mammal (excluding humans) or a model animal thereof that has developed cognitive impairment induced by amyloid ⁇ protein, or a model thereof A method for analyzing a pathological condition of cognitive impairment induced by amyloid ⁇ protein, comprising a step of adding to cultured neurons as cells or biomolecules expressed in neurons.
  • the invention as described above is expressed as the use of the specific peptide (in the production of these drugs) as an active ingredient of a therapeutic agent for cognitive impairment induced by amyloid ⁇ protein or a therapeutic drug for Alzheimer's disease. It is obvious to a person skilled in the art that it is possible to convert to the present invention.
  • Alzheimer's disease is a situation where there is no effective therapeutic agent at present and a new therapeutic agent is awaited.
  • new therapeutic agents based on amyloid ⁇ protein have been clinically developed, but have not yet been put on the market due to side effects.
  • the anti-Alzheimer agent provided by the present invention has a new mechanism of action different from that of the existing anti-Alzheimer agent, and is a peptide actually present in vivo (p3-Alc ⁇ 37) produced by cleaving with ⁇ -secretase or Since the partial peptide (p3-Alc ⁇ [9-19]) or a peptide having an amino acid sequence similar to them is used, it becomes an anti-Alzheimer agent that is expected to be highly safe with no side effects.
  • the graph represents the search time of a new object (Novel object) and a known object (Familiar object) measured in the example.
  • A (ACSF): artificial cerebrospinal fluid only (control).
  • B (A ⁇ oligomer): Artificial cerebrospinal fluid in which 1 ⁇ M amyloid ⁇ protein oligomer was dissolved.
  • C (A ⁇ oligomer + p3-Alc ⁇ 37): An artificial cerebrospinal fluid in which 1 ⁇ M amyloid ⁇ protein oligomer and 10 ⁇ M p3-Alc ⁇ 37 peptide are dissolved. **: P ⁇ 0.01.
  • the graph represents the search time of a new object (Novel object) and a known object (Familiar object) measured in the example.
  • B (MK-801 + p3-Alc ⁇ 37): An artificial cerebrospinal fluid in which 10 ⁇ M p3-Alc ⁇ 37 peptide was dissolved was administered into the ventricles, and MK-801 was administered intraperitoneally. Effect of partial peptide of p3-Alc ⁇ 37 on memory impairment induced by amyloid ⁇ protein oligomer.
  • A Comparison of amino acid sequences of partial peptides p3-Alc ⁇ [1-19], p3-Alc ⁇ [20-37], p3-Alc ⁇ [1-11] and p3-Alc ⁇ [9-19] used in the experiment.
  • B (A ⁇ oligomer + p3-Alc ⁇ [1-19]): an artificial cerebrospinal fluid in which 1 ⁇ M amyloid ⁇ protein oligomer and 10 ⁇ M3-p3-Alc ⁇ [1-19] peptide are dissolved. **: P ⁇ 0.01.
  • C (A ⁇ oligomer + p3-Alc ⁇ [20-37]): artificial cerebrospinal fluid in which 1 ⁇ M amyloid ⁇ protein oligomer and 10 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ p3-Alc ⁇ [20-37] peptide are dissolved.
  • D (A ⁇ oligomer + p3-Alc ⁇ [1-11]): Artificial cerebrospinal fluid in which 1 ⁇ M amyloid ⁇ protein oligomer and 10 ⁇ M p3-Alc ⁇ [1-11] peptide are dissolved.
  • E (A ⁇ oligomer + p3-Alc ⁇ [9-19]): Artificial cerebrospinal fluid in which 1 ⁇ M amyloid ⁇ protein oligomer and 10 M p3-Alc ⁇ [9-19] peptide are dissolved. **: P ⁇ 0.01.
  • the therapeutic agent for cognitive impairment induced by amyloid ⁇ protein includes the following first to sixth embodiments.
  • amyloid ⁇ protein is a polypeptide generally known to accumulate in the brain with the progress of Alzheimer's disease, and is a monomer type consisting of a single polypeptide chain. Even an oligomer type composed of a plurality of (usually 2 to 6) polypeptide chains or an aggregate formed by aggregating a plurality of such oligomers may be used.
  • “Cognitive impairment induced by amyloid ⁇ protein” includes memory impairment, disorientation, learning impairment, attention impairment, spatial cognitive function and problem solving ability, which are generally known as symptoms of Alzheimer's disease. Obstacles are included.
  • a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is used as an active ingredient of the therapeutic agent of the present invention.
  • VLSSQQFLHRGHQPPPEMAGHSLASHRNSMIPS AAT (SEQ ID NO: 1)
  • 1 to 3 amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 are deleted, added, substituted, or modified in the side chain (corresponding to unnatural amino acid, post-translationally modified amino acid, etc.)
  • a peptide having an amino acid sequence modified by any one or more of the above is used as an active ingredient of the therapeutic agent of the present invention.
  • the deletion includes not only a deletion at the N-terminus and / or C-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, but also a deletion within the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the addition includes not only addition to the N-terminus and / or C-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, but also addition to the inside of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, ie, insertion.
  • the number of amino acids to be modified is usually 1 to 3, but preferably 1 or 2, more preferably 1. When the amino acid sequence is altered by a combination of two or more of deletion, addition, substitution or side chain modification, the number represents the total number of them.
  • Such a deletion, addition (insertion), substitution, or side chain modification in the second embodiment is performed in SEQ ID NO: 2 included in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 unless the effect of the present invention is inhibited. It may be made in a portion of the amino acid sequence represented (HRGHQPPPEMA) or may be made in a portion other than the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • a peptide comprising a partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, particularly a peptide comprising a partial sequence comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is used as an active ingredient of the therapeutic agent of the present invention.
  • HRGHQPPPEMA SEQ ID NO: 2
  • the partial sequence is a partial amino acid sequence that is continuous among the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (that is, the entire amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is defined as “partial sequence”).
  • Partial sequence can be prepared by excising at least one amino acid from the N-terminal and / or C-terminal side of the peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the peptide consisting of such a partial sequence may be a peptide consisting only of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or a sequence at the N-terminus and / or C-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the peptide which consists of an amino acid sequence to which the same amino acid sequence as No. 1 was added may be sufficient.
  • the peptide used in the third embodiment may overlap (synonymous with) the peptide used in the second embodiment.
  • an amino acid sequence (length 34) in which a total of 1 to 3 amino acids at the N-terminus and / or C-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (length: 37 amino acids) used in the second embodiment are deleted.
  • To 36 amino acids is an amino acid sequence (34 to 36 amino acids long) in which a total of 23 to 25 amino acids are added to the N-terminal and / or C-terminal of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (11 amino acids long) And may overlap.
  • the peptide used in the third embodiment can be defined as excluding the peptide used in the second embodiment. The same applies to the peptides used in the subsequent fourth embodiment.
  • a partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, particularly a partial sequence including the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (that is, a partial sequence defined in the third embodiment)
  • a peptide having an amino acid sequence in which 1 to 2 amino acids are altered by any one or more of deletion, addition, substitution and side chain modification is used as an active ingredient of the therapeutic agent of the present invention.
  • the deletion includes not only a deletion at the N-terminal and / or C-terminal of a partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, but also a deletion within the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the addition includes not only addition to the N-terminal and / or C-terminal of the partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, but also addition to the inside of the partial sequence, that is, insertion.
  • the number of amino acids to be modified is usually 1 to 2, but preferably 1.
  • the amino acid sequence is altered by a combination of two or more of deletion, addition, substitution or side chain modification, the number represents the total number of them.
  • Such deletion, addition (insertion), substitution, or side chain modification in the fourth embodiment is performed in a portion of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (HRGHQPPPEMA) as long as the effect of the present invention is not inhibited. It may be made in a part other than the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • a peptide comprising an amino acid sequence comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having a total of 1 to 50 amino acids added to the N-terminal and / or C-terminal of the amino acid sequence is Used as an active ingredient of the therapeutic agent of the invention.
  • the number of amino acids to be added is usually 1 to 50, preferably 1 to 26 (the maximum total peptide length after addition is about 37 as with p3-Alc ⁇ 37), more The number is preferably 1 to 8 (the total length of the peptide after addition is the maximum, about 19 as with p3-Alc ⁇ [1-19]).
  • the peptide used in the fifth embodiment may overlap (synonymous with) the peptide used in the first to fourth embodiments.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (length 37 amino acids) used in the first embodiment is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (length 11 amino acids: 9th to 19th positions of SEQ ID NO: 1.
  • Amino acid sequence in which 9 amino acids (the 1st to 8th amino acids of SEQ ID NO: 1) and 18 amino acids (the 20th to 37th amino acids of SEQ ID NO: 1) are added to the C terminus I can say that.
  • the peptide used in the fifth embodiment can be defined as excluding the peptide used in the first to fourth embodiments. The same applies to the peptides used in the subsequent sixth embodiment.
  • a peptide comprising an amino acid sequence containing a total of 1 to 50 amino acids added to the N-terminal and / or C-terminal of the modified amino acid sequence is used as an active ingredient of the therapeutic agent of the present invention.
  • the deletion includes not only a deletion at the N-terminus and / or C-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, but also a deletion within the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the addition is to the N-terminal and / or C-terminal of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (in this case, the addition of “1 to 2” amino acids described in the first half of the definition of the sixth embodiment)
  • the addition of “1 to 50 amino acids” described later in this specification may be further made.
  • addition to the inside of the partial sequence that is, insertion is also included.
  • the number of amino acids further added to the N-terminal and / or C-terminal of the modified amino acid sequence is usually 1 to 50, preferably 1 to 26 (the total length of the peptide after the addition is The maximum number is 37, which is the same as p3-Alc ⁇ 37.
  • a person skilled in the art will select a peptide having the effect of treating cognitive impairment induced by amyloid ⁇ protein from among the peptides consisting of the amino acid sequences defined in the second to sixth embodiments and use it in the present invention. This can be done without undue trial and error.
  • the peptides used in the first to sixth embodiments can be produced by a known method, and the production method is not particularly limited.
  • a peptide having a desired amino acid sequence can be prepared by sequentially binding amino acids using the Fmoc-peptide solid phase synthesis method commonly used as a peptide synthesis method.
  • the therapeutic agent according to the present invention as described above or the predetermined peptide contained therein is preferably used as an active ingredient of the therapeutic agent for Alzheimer's disease according to the present invention as described below.
  • embodiments of the therapeutic agent according to the present invention or the predetermined peptide contained therein are not limited to use in such a therapeutic agent (pharmaceutical), for example, treatment for cognitive impairment induced by amyloid ⁇ protein
  • a therapeutic agent pharmaceutical
  • the human or non-human mammal that developed the cognitive impairment, or a model animal thereof eg, mouse, rat, guinea pig, rabbit, goat, cat, dog, pig, monkey
  • a model animal eg, mouse, rat, guinea pig, rabbit, goat, cat, dog, pig, monkey
  • the therapeutic agent according to the present invention is prepared as consisting of only a predetermined peptide as its active ingredient, and is administered or dissolved in an appropriate solvent (for example, artificial cerebrospinal fluid) alone or in a state where the peptide is dissolved. It may be added, or it may be administered or added after preparing a dosage form according to the therapeutic agent described below.
  • an appropriate solvent for example, artificial cerebrospinal fluid
  • the therapeutic agent for Alzheimer's disease according to the present invention contains the therapeutic agent according to the present invention as described above, and optionally, a pharmaceutical preparation according to the active ingredient other than the therapeutic agent of the present invention (predetermined peptide) and the dosage form. May contain a pharmaceutically acceptable carrier, other pharmaceutical additives used in general pharmaceuticals, and the like. That is, the therapeutic agent for Alzheimer's disease according to the present invention can be prepared as a pharmaceutical composition containing such components.
  • the dosage forms of therapeutic agents include, for example, tablets, capsules, soft capsules, granules, powders, fine granules, (dry) syrups, solutions, suspensions and the like, as well as subcutaneous, It is possible to select from dosage forms for parenteral administration such as injections for intramuscular or intravenous administration, drops, suppositories, and nasal administration.
  • a pharmaceutical composition of such a dosage form can be produced by a general production method.
  • additives such as excipients, disintegrants, binders, lubricants, suspending agents, tonicity agents, emulsifiers, sweeteners, fragrances, coloring agents, etc. It can manufacture by mixing said active ingredient with a conventional method and shape
  • cellulose derivatives for example, crystalline cellulose, methylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, etc.
  • polyvinylpyrrolidone dextrin
  • starch lactose
  • mannitol sorbitol
  • vegetable oils for example, corn oil, cottonseed oil, coconut oil
  • Almond oil olive oil, peanut oil, etc.
  • oily esters such as medium chain fatty acid glyceride oil, mineral oil, glycerin esters such as tricaprylin and triacetin
  • alcohols such as ethanol, physiological saline, propylene glycol, polyethylene glycol, Animal fats and oils, petrolatum and the like can be mentioned.
  • ampules are prepared by dissolving the above active ingredients in an appropriate diluent (physiological saline, glucose injection, lactose injection, mannitol injection, etc.) and sterilizing by filtration sterilization.
  • an appropriate diluent physiological saline, glucose injection, lactose injection, mannitol injection, etc.
  • it can also be manufactured as a powder injection mixed with sodium chloride or an injection in a lyophilized form based on the Japanese Pharmacopoeia.
  • adjuvants such as polyethylene glycol and surfactants, and carriers such as ethanol, liposomes, and cyclodextrins can be used.
  • the content of the active ingredient in the pharmaceutical composition may be adjusted within an appropriate range, but is usually 0.05 to 99% by weight, preferably 0.1 to 70% by weight, based on the total weight of the pharmaceutical composition. More preferably, the amount is 0.1 to 50% by weight.
  • the therapeutic agents as described above can be used to treat cognitive impairment induced by amyloid ⁇ protein.
  • the therapeutic agents as described above can also be used to treat Alzheimer's disease.
  • the method for treating cognitive impairment induced by amyloid ⁇ protein according to the present invention is a mammal (human or non-human mammal) or a model animal (mammal other than human) that has developed cognitive impairment induced by amyloid ⁇ protein. ).
  • the method for treating Alzheimer's disease according to the present invention includes a step of administering to a mammal (excluding human) suffering from Alzheimer's disease or a model animal thereof.
  • the cognitive impairment induced by the amyloid ⁇ protein that is the target of the therapeutic agent according to the present invention typically refers to symptoms associated with Alzheimer's disease, but symptoms associated with diseases that have not been diagnosed as Alzheimer's disease or mild Symptoms may be in preclinical subjects, including cognitive impairment (MCI), or in model animals.
  • a model animal of cognitive impairment induced by amyloid ⁇ protein can be prepared using a known technique. For example, a transgenic mouse that excessively expresses amyloid ⁇ protein and a mouse administered with artificial cerebrospinal fluid in which amyloid ⁇ protein is dissolved can be used as such a model animal.
  • Treatment for therapeutic agents and therapeutic agents includes therapeutic treatments and prophylactic treatments.
  • the effects of treatment include prevention of disease onset or recurrence, alleviation of symptoms, suppression of disease progression, alleviation or alleviation of symptoms, recovery, and the like.
  • the degree of the effect is not particularly limited, and can be evaluated by a known technique related to cognitive impairment or Alzheimer's disease induced by amyloid ⁇ protein.
  • the administration method of the therapeutic agent or therapeutic agent according to the present invention is not particularly limited as long as a desired effect can be obtained.
  • an administration method capable of delivering a predetermined peptide as an active ingredient to the cerebral ventricle where the amyloid ⁇ protein accumulates is used.
  • an addition method in which a predetermined peptide is added to a cell culture solution and contacted with cultured nerve cells or the like is used.
  • a viral vector for example, recombinant adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) that can cross the blood brain barrier can be used. It is known to express genes in the central nervous system and glial cell line using AAV9 vectors administered in blood. Furthermore, if neuronal cell-specific expression of p3-Alc ⁇ 37 is required, it is possible to use AAV9 in which a promoter region of, for example, a synapsin I gene is incorporated into a viral vector.
  • AAV9 recombinant adeno-associated virus serotype 9
  • p3-Alc ⁇ 37 In order to express and secrete p3-Alc ⁇ 37 in cells, for example, a precursor peptide sequence cleaved at the ⁇ -cleavage site of Alcadein ⁇ linked to the 19 peptide peptide sequence of Alcadein ⁇ is expressed. After expression in cells, this precursor peptide is cleaved by signal peptidase, cleaved by gamma secretase proceeds from ⁇ site to ⁇ site, and p3-Alc ⁇ 37 consisting of 37 amino acids is secreted (Piao et al, PLoS One 8, e62431, 2013).
  • a method for expressing and secreting the peptide known methods other than this method such as a method using a gene encoding 37 amino acids cleaved at the ⁇ site from the beginning can be used, and the efficiency of expression and secretion can be increased.
  • p3-Alc ⁇ 37 By using a method of introducing a viral vector into blood, p3-Alc ⁇ 37 can be introduced noninvasively into the central nervous system, and the therapeutic effect can be assayed by a known method.
  • the dose of the therapeutic agent that is, the amount of active ingredient per administration and the frequency (frequency) of administration are appropriate, taking into account the purpose, age of the subject, body weight, severity of the disease, route of administration, pharmacokinetics, etc. It is sufficient to adjust within this range.
  • the predetermined peptide in the present invention can also be used in the pathological analysis method for cognitive impairment or Alzheimer's disease induced by amyloid ⁇ protein. That is, the pathological condition analysis method for cognitive impairment induced by amyloid ⁇ protein according to the present invention uses a predetermined peptide used in the present invention for a mammal (human or other than human) that has developed cognitive impairment induced by amyloid ⁇ protein. A mammal) or a model animal thereof (a mammal other than a human), or a step of adding to a cultured nerve cell or a biomolecule expressed in the nerve cell as the model cell.
  • the predetermined peptide used in the present invention is administered to a mammal (human or non-human mammal) suffering from Alzheimer's disease or a model animal thereof (mammal other than human). Or adding to a cultured nerve cell as a model cell or a biomolecule expressed in the nerve cell.
  • biomolecules expressed in nerve cells include proteins such as receptors expressed on the cell surface and proteins related to signal transduction expressed in the cytoplasm.
  • the model cell reproduces a pathological condition such as cognitive impairment induced by amyloid ⁇ protein or degeneration that occurs in nerve cells (neurons, etc.) due to Alzheimer's disease. It can be prepared from cultured nerve cells derived from mammals.
  • ICR mice (6-7 weeks old) were anesthetized with ketamine (100 mg / kg) and xylazine (40 mg / kg) and placed on a stereotaxic apparatus. After removing the scalp, a small hole was made in the skull on the lateral ventricle, and a guide cannula (23 gage) ⁇ ⁇ was implanted bilaterally at a position of ⁇ 1.0 mm laterally from the bregma and 0.65 mm. The guide cannula was fixed with a dental resin. After a period of 4-5 days as a recovery period from the operation, the habituation was allowed to move freely for 10 minutes in order to get used to the environment of the test cage (39 cm x 22 cm). This was continued for 3 days.
  • artificial cerebrospinal fluid control
  • artificial cerebrospinal fluid in which 1 ⁇ M amyloid ⁇ protein oligomer was dissolved 1 ⁇ M amyloid ⁇ protein oligomer and 10 ⁇ M via the guide cannula embedded in the head
  • One of the artificial cerebrospinal fluid mixed with p3-Alc ⁇ 37 peptide or a partial peptide thereof was administered bilaterally into the lateral ventricle (3.5 ⁇ l / side) with an injection cannula (30 gage, 1.7 mm from the camphor surface).
  • mice in each group were identified using an identification index.
  • the identification index [discrimination index] is set as ([search time for new object] ⁇ [search time for known object]) / ([search time for new object] + [search time for known object]). If the new object and the known object cannot be distinguished from each other, the identification index is 0. If the time for searching for a new object is longer than the known object, the identification index is positive. When the mouse showed a new object, it showed no interest over time (no search action for the new object was shown), so the search time and identification index were calculated from the action for 5 minutes after entering the test cage.
  • the experimental method was the same as described above except for the following two points. (1) Either artificial cerebrospinal fluid (control) or artificial cerebrospinal fluid in which 10 ⁇ M p3-Alc ⁇ 37 peptide was dissolved was administered to the camphor chamber. (2) One and a half hours after administration of camphoric chamber (ie, 30 minutes before entering the test cage), (+)-MK-801 maleate (2 mg / kg) was administered intraperitoneally, and NMDA receptor-dependent Induced memory impairment.
  • the composition of the artificial cerebrospinal fluid is NaCl 137 mM, KCl 3 mM, MgCl 2 1 mM, CaCl 2 1.2 mM, glucose 2.5 mM, sodium phosphate buffer 2 mM (pH 7.4).
  • the amyloid ⁇ protein oligomer was produced according to the past literature (Balducci et al, Proc Natl Acad Sci USA 107, 2295-2300, 2010).
  • the amyloid ⁇ protein stock solution (300 ⁇ M) was dissolved in 0.02% aqueous trifluoroacetic acid, stored at ⁇ 25 ° C., and used within one month.
  • the mixed solution of oligomer and p3-Alc ⁇ 37 peptide or its partial peptide is prepared according to the above procedure, but when diluting the incubated 100 ⁇ M amyloid ⁇ protein oligomer to 1 ⁇ M, p3-Alc ⁇ 37 peptide Alternatively, the partial peptide was also added to make the final concentration 10 ⁇ M.
  • amyloid- ⁇ 42 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA p3-Alc ⁇ 37: VLSSQQFLHRGHQPPPEMAGHSLASSHRNSMIPSAAT p3-Alc ⁇ [1-19]: VLSSQQFLHRGHQPPPEMA p3-Alc ⁇ [20-37]: GHSLASSHRNSMIPSAAT p3-Alc ⁇ [1-11]: VLSSQQFLHRG p3-Alc ⁇ [9-19]: HRGHQPPPEMA
  • the peptides used were obtained from: amyloid- ⁇ 42 (Keck Biotechnology Resource Laboratory, Yale University), p3-Alc ⁇ 37 (Keck Biotechnology Resource Laboratory, Yale University), p3-Alc ⁇ [1-19] (Genemed Synthesis , and Peptide Institute), p3-Alc ⁇ [20-37] (Genemed Synthesis , and Peptide Institute), p3-
  • FIG. 2 the memory acquisition capability of each group is represented using an identification index.
  • a significant decrease in the identification index was observed in the oligomer administration group (Fig. 2, P ⁇ 0.01, Tukey test).
  • a significant increase in the identification index was observed in the oligomer / p3-Alc ⁇ 37 mixed solution administration group compared to the oligomer administration group (FIG. 2, P ⁇ 0.01, Tukey test).
  • NMDA receptors are essential for memory and learning.
  • NMDA receptor gene knockout (Rampon et al, Nat Neurosci 3, 238-244, 2000) and NMDA receptor inhibitor MK-801 were administered.
  • de Lima et al Behav Brain Res 156, 139-143, 2005
  • the p3-Alc ⁇ 37 peptide improves memory impairment due to amyloid ⁇ protein oligomers, but cannot improve memory impairment due to NMDA receptor inhibition. This indicates that this p3-Alc ⁇ 37 peptide acts relatively selectively on amyloid ⁇ protein and improves memory impairment.
  • mice P> 0.05, paired t-test). Therefore, the p3-Alc ⁇ 37 [1-19] peptide was further fragmented, and the 1-11th partial peptide (p3-Alc ⁇ 37 [1-11], FIG. 4A) and the 9th-19th partial peptide (p3-Alc ⁇ 37) [9-19], Fig. 4A). As a result, the memory capacity of the oligomer / p3-Alc ⁇ 37 [1-11] remains impaired (FIG.
  • SEQ ID NO: 1 p3-Alc ⁇ 37
  • Sequence number 2 p3-Alc ⁇ [9-19] / a part of p3-Alc beta 37 (position 9-19)
  • Sequence number 3 p3-Alc ⁇ [1-11] / a part of p3-Alc beta 37 (position 1-11)
  • SEQ ID NO: 4 p3-Alc ⁇ [1-19] / a part of p3-Alc beta 37 (position 1-19)
  • SEQ ID NO: 5 p3-Alc ⁇ [20-37] / a part of p3-Alc beta 37 (position 20-37)
  • SEQ ID NO: 6 amyloid- ⁇ 42

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Abstract

　本発明は、アミロイドβ蛋白質を作用機序とするが、従来の作用機序とは異なる抗アルツハイマー剤を提供することを課題とする。本発明に係るアルツハイマー病治療薬は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはこれに類するペプチド、特に配列番号１の部分配列である配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むペプチドを含有するアミロイドβ蛋白質により誘発される認知障害の治療剤、および当該治療剤を含有することを特徴とする。 ＶＬＳＳＱＱＦＬＨＲＧＨＱＰＰＰＥＭＡＧＨＳＬＡＳＳＨＲＮＳＭＩＰＳＡＡＴ　（配列番号１） ＨＲＧＨＱＰＰＰＥＭＡ　（配列番号２）

Description

アミロイドβ蛋白質により誘発される認知障害の治療剤およびアルツハイマー病治療薬、ならびにこれらに関連する治療方法および病態解析方法
　本発明は、アルツハイマー病の症状である、アミロイドβ蛋白質により誘発される認知障害に対する治療効果を有するペプチドおよびその用途に関する。
　アルツハイマー病は、認知機能低下（記憶障害など）を主症状とする神経疾患である。特に高齢者で好発するにも関わらず、有効な治療薬が存在せず、高齢化社会を迎えている先進国では大きな問題となっている。アルツハイマー病患者の死後脳では老人斑が観察され、これは「アミロイドβ蛋白質」の凝集体であることが知られている。そして、このアミロイドβ蛋白質がアルツハイマー病の主原因であることは、数多くの研究により広く受け入れられている。
　アミロイドβ蛋白質は、その前駆体である「アミロイド前駆体蛋白質」から生成される。アミロイド前駆体蛋白質とは、神経細胞膜上に存在する膜蛋白質である。通常の脳では、その細胞外ドメインをαセクレターゼ、次に細胞膜内ドメインをγセクレターゼで切断されることにより、細胞外にp3と呼ばれるペプチドが産生・遊離される。これは「非アミロイド生成経路」として知られ、アミロイドβ蛋白質は生成されない（非特許文献１）。通常の脳でも、細胞外ドメインは数％ではあるがβセクレターゼによる切断を受け、細胞外にアミロイドβ蛋白質が分泌されている。しかし、アルツハイマー病になる脳では、このアミロイドβ蛋白質の産生量が増加するか、より凝集性の高いアミロイドβ蛋白質分子種が生成されるようになると考えられている。このアミロイドβ蛋白質の凝集する性質が、最終的にアルツハイマー病患者の老人斑（アミロイド凝集体）を形成し、脳内沈着として観察される。
　切りだされたアミロイドβ蛋白質は、次第に凝集し、最終的に老人斑（アミロイド凝集体）が形成されるが、その凝集過程の「オリゴマー体（アミロイドβ蛋白質が数個会合したもの）」に、強い神経毒性があることが分かっている。このアミロイドβ蛋白質オリゴマー体は、記憶・学習に必須の神経現象であるシナプス可塑性を阻害することが、in vitro, in vivo 両方で報告されている（非特許文献２，３）。また、このオリゴマー体をマウス脳内に投与すると、記憶・学習能力が失われることも報告されている（非特許文献４，５）。最近の研究により、このオリゴマー体に長期間暴露されると、神経細胞死などが起きることも報告されており（非特許文献６）、アルツハイマー病発症の原因物質として注目されている。
　このように、アルツハイマー病の原因としてアミロイドβ蛋白質が広く認識されているにも関わらず、現在臨床的に使われているアルツハイマー病治療薬は、このアミロイドβ蛋白質に作用するようデザインされていない。詳しく述べると、アルツハイマー病治療薬として使われているドネペジル（特許文献１）やメマンチン（特許文献２）は、それぞれアセチルコリンエステラーゼ阻害剤とＮＭＤＡ受容体阻害剤として働き、アミロイドβ蛋白質と相互作用するわけではない。いわゆる対処療法薬であるため、アルツハイマー病に対する劇的な改善作用がないのが現状である。
　このような背景を受け、作用機序（アミロイド蛋白質）に基づいた新たなアルツハイマー治療薬の開発が進められている。１つは、アミロイド前駆体蛋白質からアミロイドβ蛋白質の産生を抑えようとする試みであり、セクレターゼ制御剤の開発である（非特許文献１）。その中で、γセクレターゼ阻害剤の開発が最も進んでおり、Semagacestat（特許文献３）や Begacestat（特許文献４）など、臨床開発が続々と進められてきた。もう一つの治療法として注目されているのは、脳内のアミロイドβ蛋白質を抗体に認識させ除去させる、抗体療法である。実際、Bapineuzumab（特許文献５）やsolanezumabなど、これまで臨床開発が進められてきた経緯がある。
　しかしながら、現在開発の中心となっているアミロイド蛋白質を作用機序とするアルツハイマー治療薬には問題点があることが分かっている。γセクレターゼ阻害剤に関しては、そもそもγセクレターゼの基質はアミロイド前駆体蛋白質だけでなく、約１００近くあることが知られている（非特許文献７）。その中には、細胞分化に重要な Notch受容体も含まれており（非特許文献８）、副作用が懸念されている。実際、γセクレターゼ阻害剤として有力候補であった Semagacestat は、2010年に第三相臨床試験で開発が中止されている。また抗アミロイドβ抗体による抗体療法に関しては、血管炎や血管性脳浮腫などが起こる可能性があり、実際、抗体治療剤として有望であった Bapineuzumab も、2012年に開発を中止している。
　なお、γセクレターゼの基質の中には、切り取られた細胞外ドメインがアミロイドペプチドのように放出されるのも幾つか知られている（非特許文献９，１０）。これらのペプチドはγセクレターゼ活性の指標となるので、切られた断片をアルツハイマー病のバイオマーカーにしようという発明は幾つかある（特許文献６，７）。また、Alcadein-βと呼ばれる生体内の膜蛋白質が、γセクレターゼにより切断され、さらにαセクレターゼによっても切断されることによって、３７アミノ酸（VLSSQQFLHRGHQPPPEMAGHSLASSHRNSMIPSAAT）からなるペプチドが産生されることも知られている（非特許文献１１）。
　しかし、このようなペプチドをアルツハイマー病の制御剤にするというアイデアは、現在の知見・技術水準では想定し難く、従って報告も皆無である。
EP 0296560 A2 US 3391142 A WO 2002/40451 A2 US 2004/198778 A1 WO 2009/017467 A1 US 7666982 B2 US 7807777 B2
De Strooper et al, Nat Rev Neurol 6, 99-107, 2010 Lambert et al, Proc Natl Acad Sci USA 95, 6448-6453, 1998 Walsh et al, Nature 416, 535-539, 2002 Cleary et al, Nat Neurosci 8, 79-84, 2005 Balducci et al, Proc Natl Acad Sci USA 107, 2295-2300, 2010 Brouillette et al, J Neurosci 32, 7852-7861, 2012 Haapasalo and Kovacs, J Alzheimers Dis 25, 3-28, 2011 De Strooper et al, Nature 398, 518-522, 1999 Okochi et al, EMBO J 21, 5408-5416, 2002 Araki et al, J Biol Chem 279, 24343-24354, 2004 Hata et al, J Biol Chem 284, 36024-36033, 2009
　上記のような状況の下、アミロイドβ蛋白質を作用機序とするが、従来の作用機序とは異なる抗アルツハイマー剤が切望されており、本発明はそのような抗アルツハイマー剤を提供することを課題とする。
　前述のように、γセクレターゼはアミロイド前駆体蛋白質以外の膜蛋白質をも切断することが知られている。本発明者らは、γセクレターゼにより切られたアミロイドβ蛋白質"以外"のペプチド断片そのものが、アルツハイマー病改善作用を示すのではないかという大胆な仮説をたてた。そして、そのようなペプチド断片のうち、前述したAlcadein-βがγセクレターゼおよびαセクレターゼによっても切断されることで生じる３７アミノ酸（VLSSQQFLHRGHQPPPEMAGHSLASSHRNSMIPSAAT）からなるペプチド（p3-Alcβ37ペプチド）が、アミロイドβ蛋白質による認知障害を劇的に改善することを見出し、さらにp3-Alcβ37ペプチドに含まれるわずか１１アミノ酸（HRGHQPPPEMA）からなるペプチド（p3-Alcβ[9-19]ペプチド）でも認知障害改善作用があることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は一つの側面において、アミロイドβ蛋白質により誘発される認知障害の治療剤およびアルツハイマー病治療薬を提供する。本発明は別の側面において、アミロイドβ蛋白質により誘発される認知障害の治療方法およびアルツハイマー病の治療方法を提供する。本発明はさらなる側面において、アミロイドβ蛋白質により誘発される認知障害の病態解析方法およびアルツハイマー病の病態解析方法を提供する。かかる本発明には下記の発明が包含される。
　［１］　下記（I）～（VI）のいずれかに該当するペプチドを有効成分として含有することを特徴とする、アミロイドβ蛋白質により誘発される認知障害の治療剤。
　（I）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
ＶＬＳＳＱＱＦＬＨＲＧＨＱＰＰＰＥＭＡＧＨＳＬＡＳＳＨＲＮＳＭＩＰＳ
ＡＡＴ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（配列番号１）
　（II）配列番号１で表されるアミノ酸配列に対して１～３個のアミノ酸が、欠失、付加、置換または側鎖の修飾のいずれか一種以上により改変されたアミノ酸配列からなるペプチド。
　（III）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む、配列番号１で表されるアミノ酸配列の部分配列からなるペプチド。
ＨＲＧＨＱＰＰＰＥＭＡ　　　　　　　　　　　　　　　　（配列番号２）
　（IV）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む、配列番号１で表されるアミノ酸配列の部分配列に対して、１～２個のアミノ酸が、欠失、付加、置換または側鎖の修飾のいずれか一種以上により改変されたアミノ酸配列からなるペプチド。
　（V）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、当該アミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端に合計で１～５０個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列（ただし、配列番号１で表されるアミノ酸配列の全部または一部と一致する場合を除く。）からなるペプチド。
　（VI）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して、１～２個のアミノ酸が、欠失、付加（Ｎ末端および／またはＣ末端に対する付加を除く。）、置換または側鎖の修飾のいずれか一種以上により改変されたアミノ酸配列を含み、当該改変されたアミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端に合計で１～５０個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。
　［２］　［１］に記載の治療剤を含有する、アルツハイマー病治療薬。
　［３］　［１］に記載の治療剤を、アミロイドβ蛋白質により誘発される認知障害を発症した哺乳類（ヒトを除く）またはそのモデル動物に投与するステップを含むことを特徴とする、アミロイドβ蛋白質により誘発される認知障害の治療方法。
　［４］　［２］に記載の治療薬を、アルツハイマー病に罹患した哺乳類（ヒトを除く）またはそのモデル動物に投与するステップを含むことを特徴とする、アルツハイマー病の治療方法。
　［５］　前記（I）～（VI）のいずれかに該当するペプチドを、アミロイドβ蛋白質により誘発される認知障害を発症した哺乳類（ヒトを除く）またはそのモデル動物に投与するステップ、あるいはそのモデル細胞としての培養神経細胞または神経細胞に発現している生体分子に添加するステップを含むことを特徴とする、アミロイドβ蛋白質により誘発される認知障害の病態解析方法。
　［６］　前記（I）～（VI）のいずれかに該当するペプチドを、アルツハイマー病に罹患した哺乳類（ヒトを除く）またはそのモデル動物に投与するステップ、あるいはそのモデル細胞としての培養神経細胞または神経細胞に発現している生体分子に添加するステップを含むことを特徴とする、アルツハイマー病の病態解析方法。
　なお、上述したような発明が、アミロイドβ蛋白質により誘発される認知障害の治療剤またはアルツハイマー病治療薬の有効成分としての（これらの薬剤類の製造における）前記特定のペプチドの使用などとして表現される発明に転換することが可能であることは、当業者にとって自明である。
　アルツハイマー病は、現在有効な治療薬が存在せず、新しい治療薬が待ち望まれている状況である。背景技術において前述したように、アミロイドβ蛋白質に基づく新しい治療薬は臨床開発されているが、副作用などもあり未だ上市されていない。本発明により提供される抗アルツハイマー剤は、既存の抗アルツハイマー剤とは異なる新たな作用機序を持ち、γセクレターゼで切断されて生じる、生体内に実際に存在するペプチド（p3-Alcβ37）自体またはその部分ペプチド（p3-Alcβ[9-19]）あるいはそれらに類するアミノ酸配列を有するペプチドを用いるため、副作用のない、高い安全性が期待される抗アルツハイマー剤となる。
アミロイドβ蛋白質オリゴマーにより誘発される記憶障害に対するp3-Alcβ37ペプチドの効果。グラフは、実施例において測定された、新規物体（Novel object）および既知物体（Familiar object）の探索時間を表す。Ａ（ACSF）：人工脳脊髄液のみ（コントロール）。Ｂ（Aβ oligomer）：1 μMアミロイドβ蛋白質オリゴマー体を溶解した人工脳脊髄液。Ｃ（Aβ oligomer + p3-Alcβ37）：1 μMアミロイドβ蛋白質オリゴマー体および10 μM p3-Alcβ37ペプチドを溶解した人工脳脊髄液。**：P < 0.01。 p3-Alcβ37ペプチドの投与による識別指標（Discrimination Index）の変化。グラフは、実施例の結果（図１）から次式により算出された識別指標を表す：識別指標＝([新規物体の探索時間]－[既知物体の探索時間])/([新規物体の探索時間]＋[既知物体の探索時間])。**：P < 0.01。 MK-801により誘発される記憶障害に対するp3-Alcβ37ペプチドの効果。グラフは、実施例において測定された、新規物体（Novel object）および既知物体（Familiar object）の探索時間を表す。Ａ（MK-801 + ACSF）：人工脳脊髄液（コントロール）を脳室投与、MK-801を腹腔内投与。Ｂ（MK-801 + p3-Alcβ37）：10 μM p3-Alcβ37ペプチドを溶解した人工脳脊髄液を脳室投与、MK-801を腹腔内投与。 アミロイドβ蛋白質オリゴマーにより誘発される記憶障害に対する、p3-Alcβ37の部分ペプチドの効果。Ａ：実験に用いた部分ペプチドp3-Alcβ[1-19]、p3-Alcβ[20-37]、p3-Alcβ[1-11]およびp3-Alcβ[9-19]のアミノ酸配列の対比。Ｂ（Aβ oligomer + p3-Alcβ[1-19]）：1 μMアミロイドβ蛋白質オリゴマー体および10 μM p3-Alcβ[1-19]ペプチドを溶解した人工脳脊髄液。**：P < 0.01。Ｃ（Aβ oligomer + p3-Alcβ[20-37]）：1 μMアミロイドβ蛋白質オリゴマー体および10 μM p3-Alcβ[20-37]ペプチドを溶解した人工脳脊髄液。Ｄ（Aβ oligomer + p3-Alcβ[1-11]）：1 μMアミロイドβ蛋白質オリゴマー体および10 μM p3-Alcβ[1-11]ペプチドを溶解した人工脳脊髄液。Ｅ（Aβ oligomer + p3-Alcβ[9-19]）：1 μMアミロイドβ蛋白質オリゴマー体および10 μM p3-Alcβ[9-19]ペプチドを溶解した人工脳脊髄液。**：P < 0.01。
　－治療剤－
　本発明に係るアミロイドβ蛋白質により誘発される認知障害の治療剤は、下記第１～第６実施形態を包含する。
　ここで、「アミロイドβ蛋白質」は、一般的にアルツハイマー病の進行と共に脳内に蓄積していくことが知られているポリペプチドであって、１本のポリペプチド鎖からなるモノマー型のものであっても、複数本（通常２～６本）のポリペプチド鎖からなるオリゴマー型ものであっても、当該オリゴマーが複数個集合してなる凝集体であってもよい。また、「アミロイドβ蛋白質により誘発される認知障害」には、一般的にアルツハイマー病の症状として知られている、記憶障害、見当識障害、学習障害、注意障害、空間認知機能や問題解決能力の障害などが包含される。
　第１実施形態では、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを、本発明の治療剤の有効成分として用いる。
ＶＬＳＳＱＱＦＬＨＲＧＨＱＰＰＰＥＭＡＧＨＳＬＡＳＳＨＲＮＳＭＩＰＳ
ＡＡＴ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（配列番号１）
　第２実施形態では、配列番号１で表されるアミノ酸配列に対して１～３個のアミノ酸が、欠失、付加、置換または側鎖の修飾（非天然アミノ酸、翻訳後修飾アミノ酸などに相当）のいずれか一種以上により改変されたアミノ酸配列からなるペプチドを、本発明の治療剤の有効成分として用いる。欠失は、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端における欠失だけでなく、配列番号１で表されるアミノ酸配列の内部での欠失も包含する。付加は、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端への付加だけでなく、配列番号１で表されるアミノ酸配列の内部への付加、すなわち挿入も包含する。第２実施形態において、改変されるアミノ酸の数は通常１～３個であるが、好ましくは１または２個、より好ましくは１個である。欠失、付加、置換または側鎖の修飾のうち二種以上の組み合わせによってアミノ酸配列が改変されている場合、前記個数はそれらの合計の個数を表す。このような第２実施形態における欠失、付加（挿入）、置換または側鎖の修飾は、本発明の作用効果を阻害しない限り、配列番号１で表されるアミノ酸配列に含まれる配列番号２で表されるアミノ酸配列の部分（ＨＲＧＨＱＰＰＰＥＭＡ）においてなされていてもよいし、配列番号２で表されるアミノ酸配列以外の部分においてなされていてもよい。
　第３実施形態では、配列番号１で表されるアミノ酸配列の部分配列からなるペプチド、特に配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む部分配列からなるペプチドを、本発明の治療剤の有効成分として用いる。
ＨＲＧＨＱＰＰＰＥＭＡ　　　　　　　　　　　　　　　　（配列番号２）
　ここで、部分配列とは、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの連続する一部のアミノ酸配列であり（つまり配列番号１で表されるアミノ酸配列の全部は「部分配列」の定義には包含されない）、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端および／またはＣ末端側から少なくとも１個のアミノ酸を切除することにより作製することができる。このような部分配列からなるペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列のみからなるペプチドであってもよいし、配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端に、配列番号１と同様のアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。
　なお、第３実施形態で用いられるペプチドは、第２実施形態で用いられるペプチドと重複する（同義となる）可能性がある。たとえば、第２実施形態で用いられる、配列番号１で表されるアミノ酸配列（長さ３７アミノ酸）のＮ末端および／またはＣ末端のアミノ酸が合計１～３個欠失したアミノ酸配列（長さ３４～３６アミノ酸）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列（長さ１１アミノ酸）のＮ末端および／またはＣ末端に合計２３～２５個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列（長さ３４～３６アミノ酸）と重複する可能性がある。必要であれば、第３実施形態で用いられるペプチドは、そのような第２実施形態で用いられるペプチドを除くものとして定義することができる。このことは、続く第４実施形態で用いられるペプチドについても同様である。
　第４実施形態では、配列番号１で表されるアミノ酸配列の部分配列、特に配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む部分配列（すなわち第３実施形態において定義される部分配列）に対して、１～２個のアミノ酸が、欠失、付加、置換または側鎖の修飾のいずれか一種以上により改変されたアミノ酸配列からなるペプチドを、本発明の治療剤の有効成分として用いる。欠失は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の部分配列のＮ末端および／またはＣ末端における欠失だけでなく、配列番号１で表されるアミノ酸配列の内部での欠失も包含する。付加は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の部分配列のＮ末端および／またはＣ末端への付加だけでなく、当該部分配列の内部への付加、すなわち挿入も包含する。第４実施形態において、改変されるアミノ酸の数は通常１～２個であるが、好ましくは１個である。欠失、付加、置換または側鎖の修飾のうち二種以上の組み合わせによってアミノ酸配列が改変されている場合、前記個数はそれらの合計の個数を表す。このような第４実施形態における欠失、付加（挿入）、置換または側鎖の修飾は、本発明の作用効果を阻害しない限り、配列番号２で表されるアミノ酸配列の部分（ＨＲＧＨＱＰＰＰＥＭＡ）においてなされていてもよいし、配列番号２で表されるアミノ酸配列以外の部分においてなされていてもよい。
　第５実施形態では、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、当該アミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端に合計で１～５０個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるペプチドを、本発明の治療剤の有効成分として用いる。第５実施形態において付加されるアミノ酸の数は通常１～５０個であるが、好ましくは１～２６個（付加後のペプチド全長が最大で、p3-Alcβ37と同じく３７個になる程度）、より好ましくは１～８個（付加後のペプチド全長が最大で、p3-Alcβ[1-19]と同じく１９個になる程度）である。
　なお、第５実施形態で用いられるペプチドは、第１～第４実施形態で用いられるペプチドと重複する（同義となる）可能性がある。たとえば、第１実施形態で用いられる、配列番号１で表されるアミノ酸配列（長さ３７アミノ酸）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列（長さ１１アミノ酸：配列番号１の９～１９番目のアミノ酸）の、Ｎ末端に９個のアミノ酸（配列番号１の１～８番目のアミノ酸）およびＣ末端に１８個のアミノ酸（配列番号１の２０～３７番目のアミノ酸）が付加したアミノ酸配列ともいえる。必要であれば、第５実施形態で用いられるペプチドは、そのような第１～第４実施形態で用いられるペプチドを除くものとして定義することができる。このことは、続く第６実施形態で用いられるペプチドについても同様である。
　第６実施形態では、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して、１～２個のアミノ酸が、欠失、付加、置換または側鎖の修飾のいずれか一種以上により改変されたアミノ酸配列を含み、当該改変されたアミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端に合計で１～５０個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるペプチドを、本発明の治療剤の有効成分として用いる。欠失は、配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端における欠失だけでなく、配列番号２で表されるアミノ酸配列の内部での欠失も包含する。付加は、配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端への付加（この場合、第６実施形態の規定の前半に記載された「１～２個」のアミノ酸の付加に加えて、この規定の後半に記載された「１～５０個」のアミノ酸の付加がさらになされてもよい。）だけでなく、当該部分配列の内部への付加、すなわち挿入も包含する。第６実施形態において、改変されたアミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端にさらに付加されるアミノ酸の数は通常１～５０個であるが、好ましくは１～２６個（付加後のペプチド全長が最大で、p3-Alcβ37と同じく３７個になる程度、ただし配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して１～２個のアミノ酸が欠失または付加されている場合は、それによるアミノ酸の数の増減を考慮することができる。）、より好ましくは１～８個（付加後のペプチド全長が最大で、p3-Alcβ[1-19]と同じく１９個になる程度、ただし配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して１～２個のアミノ酸が欠失または付加されている場合は、それによるアミノ酸の数の増減を考慮することができる。）である。
　当業者であれば、第２～第６実施形態において定義されるアミノ酸配列からなるペプチドのうち、アミロイドβ蛋白質により誘発される認知障害を治療する作用効果を奏するものを選択して本発明に用いることは、過度の試行錯誤を要することなく行うことができる。
　第１～第６実施形態で用いられるペプチドは公知の手法により作製することができ、その作製方法は特に限定されるものではない。たとえば、ペプチドの合成法として慣用されているＦｍｏｃ－ペプチド固相合成法を用いてアミノ酸を順次結合させていくことにより、所望のアミノ酸配列からなるペプチドを作製することができる。
　上述したような本発明に係る治療剤ないしそれに含有される所定のペプチドは、次に述べるような本発明に係るアルツハイマー病治療薬の有効成分として使用することが好適である。しかしながら、本発明に係る治療剤ないしそれに含有される所定のペプチドの実施形態はそのような治療薬（医薬品）における使用に限られるものではなく、たとえば、アミロイドβ蛋白質により誘発される認知障害に対する治療効果やその作用機序の詳細を検証するために、当該認知障害を発症したヒトもしくはヒト以外の哺乳類、またはそのモデル動物（たとえばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ネコ、イヌ、ブタ、サル）の生体に投与してインビボで作用するような実施形態、あるいはこれらの動物に由来する培養神経細胞から作製されたモデル細胞に添加してインビトロで作用するような実施形態における使用であってもよい。
　本発明に係る治療剤は、その有効成分としての所定のペプチドのみからなるものとして調製し、当該ペプチドを単独で、または適切な溶媒（たとえば人工脳脊髄液）に溶解させた状態で、投与または添加してもよいし、次に述べる治療薬に準じた剤型を調製した上で投与または添加してもよい。
　－治療薬－
　本発明に係るアルツハイマー病治療薬は、上述したような本発明に係る治療剤を含有し、さらに任意で、本発明の治療剤（所定のペプチド）以外の有効成分、剤形に応じた製薬学的に許容される担体、その他一般的な医薬品に用いられている製薬学的添加物などを含有していてもよい。すなわち、本発明に係るアルツハイマー病治療薬は、そのような成分を含有する医薬組成物として調製することができる。
　治療薬の剤型は、たとえば、錠剤、カプセル剤、軟カプセル剤、顆粒剤、散剤、細粒剤、（ドライ）シロップ、溶液剤、懸濁剤などの経口投与用の剤型、ならびに皮下、筋肉内もしくは静脈内投与用の注射剤、点滴剤、坐剤、経鼻など非経口投与用の剤型の中から選択することが可能である。
　このような剤型の医薬組成物は、一般的な製造方法により製造することができる。たとえば、経口投与用の剤型であれば、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、懸濁化剤、等張化剤、乳化剤、甘味料、香料、着色料などの添加剤と上記の有効成分とを常法により混合して成形することにより製造することができる。このうち賦形剤としては、セルロース誘導体（たとえば結晶セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等）、ポリビニルピロリドン、デキストリン、デンプン、乳糖、マニトール、ソルビトール、植物油（たとえばトウモロコシ油、綿実油、ココナッツ油、アーモンド油、オリーブ油、落花生油等）、中鎖脂肪酸グルセリド油等の油状エステル、鉱物油、トリカプリリン、トリアセチン等のグリセリンエステル類、エタノール等のアルコール類、生理食塩水、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、動物油脂、ワセリンなどが挙げられる。
　一方、注射剤であれば、適切な希釈剤（生理食塩水、ブドウ糖注射液、乳糖注射液、マンニット注射液等）に上記の有効成分を溶解し、濾過滅菌等の滅菌処理を施してアンプル等の密封容器に充填することにより製造できる他、日本薬局方に基づいて凍結乾燥した形態の注射剤や塩化ナトリウムと混合した粉末注射剤として製造することもできる。また、添加剤としては、ポリエチレングリコール、界面活性剤等の補助剤、エタノール、リポソーム、シクロデキストリン等の担体を用いることもできる。
　医薬組成物中の有効成分の含有量は適切な範囲で調整すればよいが、医薬組成物の総重量に対して、通常０．０５～９９重量％、好ましくは０．１～７０重量％、より好ましくは０．１～５０重量％の量である。
　－治療方法－
　上述したような治療剤は、アミロイドβ蛋白質により誘発される認知障害を治療するために使用することができる。また、上述したような治療薬は、アルツハイマー病を治療するために使用することができる。
　すなわち、本発明に係るアミロイドβ蛋白質により誘発される認知障害の治療方法は、アミロイドβ蛋白質により誘発される認知障害を発症した哺乳類（ヒトまたはヒト以外の哺乳類）またはそのモデル動物（ヒト以外の哺乳類）に投与するステップを含む。また、本発明に係るアルツハイマー病の治療方法は、アルツハイマー病に罹患した哺乳類（ヒトを除く）またはそのモデル動物に投与するステップを含む。
　なお、本発明に係る治療剤の対象となるアミロイドβ蛋白質により誘発される認知障害は、典型的にはアルツハイマー病に伴う症状を指すが、アルツハイマー病と確定診断されていない疾患に伴う症状や軽度認知障害(MCI)を含む前臨床段階対象者、またはモデル動物における症状であってもよい。アミロイドβ蛋白質により誘発される認知障害のモデル動物は公知の手法を用いて作製することができる。たとえば、アミロイドβ蛋白質を過剰に発現するトランスジェニックマウスや、アミロイドβ蛋白質が溶解した人工脳脊髄液を投与したマウスをそのようなモデル動物として用いることができる。
　治療剤および治療薬についての「治療」には、治療的処置および予防的処置が包含される。その治療の効果としては、疾患の発症または再発の予防、症候の緩和、疾患の進行の抑制、症状の緩和または軽減、回復などが包含される。効果の程度は特に限定されるものではなく、アミロイドβ蛋白質により誘発される認知障害またはアルツハイマー病に関する公知の手法により評価することができる。
　本発明に係る治療剤または治療薬の投与方法は、所望の効果が得られるものであれば特に限定されるものではない。通常、インビボでは、アミロイドβ蛋白質が集積する部位である脳室に有効成分としての所定のペプチドを送達できる投与方法が用いられる。また、インビトロでは、細胞培養液に所定のペプチドを添加して培養神経細胞等と接触させる添加方法が用いられる。
　さらに、例えばウイルスベクターを用いて脳神経細胞でp3-Alcβ37およびその一部のペプチド配列を発現させることが治療方法の選択肢として考えられる。このようなウイルスベクターとして、例えば血液脳関門を通過しうる組み換え体アデノ随伴ウイルス血清型9（AAV9）を用いる事ができる。血中に投与したAAV9ベクターを用いて中枢神経およびグリア細胞系で遺伝子を発現させる事は公知である。さらに、神経細胞特異的なp3-Alcβ37の発現が必要であれば、ウイルスベクターに、例えばsynapsin I 遺伝子のプロモーター領域を組み込んだAAV9を用いる事が可能である。p3-Alcβ37を細胞で発現させ、分泌させるためには、例えばAlcadein βのシグナルペプチド配列19アミノ酸に連結された、Alcadein βのε切断サイトで切断した前駆体ペプチド配列を発現させる。細胞で発現後、この前駆体ペプチドは、シグナルペプチダーゼによりシグナル配列が切断され、ガンマセクレターゼによる切断がεサイトからγサイトへ進み、37アミノ酸からなるp3-Alcβ37が分泌される (Piao et al, PLoS One 8, e62431, 2013)。もちろん、ペプチドを発現・分泌させる方法として、最初からγサイトで切断される37アミノ酸をコードした遺伝子をもちいる方法など、本方法以外の既知の方法を用いる事ができ、発現および分泌の効率を検討して、治療に有効な手法を用いる事ができる。血中にウイルスベクターを導入する方法を用いる事で、中枢神経系に非侵襲的にp3-Alcβ37を導入し治療効果を公知の方法で検定する事が可能となる。
　治療薬の投与量、すなわち投与１回あたりの有効成分量および投与回数（頻度）は、目的、投与対象の年齢、体重、疾患の重篤度、投与経路、薬物動態などを考慮しながら、適切な範囲で調節すればよい。
　－病態解析方法－
　本発明における所定のペプチド、すなわち前述したような第１～第６実施形態において用いられるペプチドは、アミロイドβ蛋白質により誘発される認知障害またはアルツハイマー病の病態解析方法において使用することもできる。すなわち、本発明に係るアミロイドβ蛋白質により誘発される認知障害の病態解析方法は、本発明で用いられる所定のペプチドを、アミロイドβ蛋白質により誘発される認知障害を発症した哺乳類（ヒトまたはヒト以外の哺乳類）またはそのモデル動物（ヒト以外の哺乳類）に投与するステップ、あるいはそのモデル細胞としての培養神経細胞または神経細胞に発現している生体分子に添加するステップを含む。また、本発明に係るアルツハイマー病の病態解析方法は、本発明で用いられる所定のペプチドを、アルツハイマー病に罹患した哺乳類（ヒトまたはヒト以外の哺乳類）またはそのモデル動物（ヒト以外の哺乳類）に投与するステップ、あるいはそのモデル細胞としての培養神経細胞または神経細胞に発現している生体分子に添加するステップを含む。
　神経細胞に発現している生体分子にとしては、たとえば細胞表面に発現している受容体のようなタンパク質や、細胞質内で発現しているシグナル伝達に関連するタンパク質などが考えられる。
　前記モデル細胞は、アミロイドβ蛋白質により誘発される認知障害またはアルツハイマー病により神経細胞（ニューロンなど）などに起きる変性などの病態を再現したものであり、公知の手法を用いて、ヒトまたはヒト以外に哺乳動物に由来する培養神経細胞から作製することができる。
　このような病態解析方法において、本発明で用いられる所定のペプチドを投与または添加することにより起きる反応を観察、評価することにより、当該ペプチドを使用した治療剤または治療薬の作用機序の詳細を検証することが可能となり、これらを用いた治療方法の効果を増強するための手段や、新たな治療剤または治療薬を開発することができるようになる。
　方法
　アミロイドβ蛋白質オリゴマー体投与による記憶障害マウスモデルの作製、および新規物体認識試験 (novel object recognition test) による記憶獲得能力の評価は、過去の論文に従っておこなった (Balducci et al, Proc Natl Acad Sci USA 107, 2295-2300, 2010)。
　ICRマウス (6-7週令) に対し、ケタミン (100mg/kg) とキシラジン (40mg/kg) によって麻酔し、脳定位固定装置にセットした。頭皮を除去後、側脳室上の頭蓋骨に小さな穴を開け、ブレグマから側方向に ± 1.0 mm、後方向に 0.65 mm の位置にガイドカニューレ (23 gage) を両側性に埋め込んだ。ガイドカニューレは歯科用レジンで固定した。手術からの回復期間として4-5日経過後、テストケージ (39 cm x 22 cm) の環境に慣れさせるため、10分間自由行動させた (habituation)。これを3日間続けた。その次の日、頭部に埋め込んでいたガイドカニューレを介して、人工脳脊髄液（コントロール）、1 μMアミロイドβ蛋白質オリゴマー体を溶解した人工脳脊髄液、1 μMアミロイドβ蛋白質オリゴマー体と10 μM p3-Alcβ37ペプチドもしくはその部分ペプチドを混合した人工脳脊髄液のいずれかを、インジェクションカニューレ (30 gage, 脳表面から 1.7 mm) により、側脳室に両側性に投与した (3.5 μl/side)。
　投与から２時間後、順応させたテストケージの中に、同一の２つの物体（プラスチックキャップのついたガラスバイアル[物体Ａ]：直径3 cm x 高さ 6.5 cm）を約20 cm 離してセットし、その中でマウスを10分間自由行動させ、物体Ａを学習させた (training session)。次の日、学習から24時間経過後、昨日見せた物体Ａを覚えているか試験した (test session)。詳しくは、同じテストケージの中に、昨日提示した物体Ａ（すなわち、既知物体）と新しい物体（メタルキューブ[物体Ｂ]： 4 cm 四方）を前日と同じ位置にセットし、その中でマウスを10分間自由行動させた。正常マウスは元々、新しい物体に興味を示すので、既知物質（物体Ａ）よりも新規物体（物体Ｂ）の方を探索している時間が長くなる。一方、記憶能力を障害されたマウスは、前日見せた物体（物体Ａ）を覚えていないので、test session では物体Ａも物体Ｂも同程度の探索時間を示す。両物体に対する探索行動はビデオカメラで記録し、それぞれの物体に対する探索時間を積算した。物体に対する頭部の接触や接近(sniffing含む)および前後肢の接触を、探索時間としてカウントした。各グループにおけるマウスの記憶獲得能力は、識別指標を用いて表わした。識別指標 [discrimination index] は、([新規物体の探索時間]－[既知物体の探索時間])/([新規物体の探索時間]＋[既知物体の探索時間])と設定した。新規物体と既知物体の区別が出来ていないと識別指標は０となり、既知物体に比べて新規物体を探索する時間が長いと、識別指標はプラスとなる。マウスに新規物体を見せると、時間経過と共に興味を示さなくなる（新規物体に対する探索行動を示さなくなる）ので、テストケージに入れてから５分間の行動から探索時間および識別指標を算出した。
　NMDA受容体阻害剤であるMK-801投与による記憶障害マウスモデルに関しても、新規物体認識試験 (novel object recognition test) による記憶獲得能力の評価を行った。実験手法は、以下２点を除き、上述と同じ方法で行った。(1) 脳室には、人工脳脊髄液（コントロール）もしくは10 μM p3-Alcβ37ペプチドを溶解した人工脳脊髄液のいずれかを投与した。(2) 脳室投与から１時間半後（すなわち、テストケージに入れる３０分前）に、(+)-MK-801 maleate (2 mg/kg) を腹腔内投与し、NMDA受容体依存性の記憶障害を誘発した。
　使用した試薬に関して、人工脳脊髄液の組成はNaCl 137 mM, KCl 3 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 1.2 mM, glucose 2.5 mM, sodium phosphate buffer 2 mM (pH 7.4) である。アミロイドβ蛋白質オリゴマー体の作成は、過去の文献に従って作製した (Balducci et al, Proc Natl Acad Sci USA 107, 2295-2300, 2010)。アミロイドβ蛋白質のストック溶液 (300 μM) は、0.02% のトリフルオロ酢酸水溶液に溶解され、-25℃で保存し、１か月以内に使用した。アミロイドβ蛋白質オリゴマー体の作成は、以下の要領で用事調製した。アミロイドβ蛋白質ストック溶液を融解後、NaOH:NH3=1:3 溶液でアルカリ化し (pH > 10.5)、50 mM phosphate-buffered saline (pH 7.4)で、アミロイドβ蛋白質を 100 μM に薄めた後、22℃で18時間インキュベートした。この溶液を人工脳脊髄液で1 μM に薄め、アミロイドβ蛋白質オリゴマー体として脳室投与した。オリゴマー体とp3-Alcβ37ペプチドもしくはその部分ペプチドの混合液に関しては、上述の手順に沿って行って作製するが、インキュベートされた 100 μM アミロイドβ蛋白質オリゴマー体を 1 μM に薄める際、p3-Alcβ37ペプチドもしくはその部分ペプチドも添加し最終濃度を10 μMとした。
　使用したペプチドの配列は、以下の通りである。
amyloid-β42：DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA
p3-Alcβ37:      VLSSQQFLHRGHQPPPEMAGHSLASSHRNSMIPSAAT
p3-Alcβ[1-19]:  VLSSQQFLHRGHQPPPEMA
p3-Alcβ[20-37]:                    GHSLASSHRNSMIPSAAT
p3-Alcβ[1-11]:  VLSSQQFLHRG
p3-Alcβ[9-19]:          HRGHQPPPEMA
　加えて、使用したペプチドはそれぞれ以下から入手した： amyloid-β42 (Keck Biotechnology Resource Laboratory, Yale University), p3-Alcβ37 (Keck Biotechnology Resource Laboratory, Yale University), p3-Alcβ[1-19] (Genemed Synthesis, and Peptide Institute), p3-Alcβ[20-37] (Genemed Synthesis, and Peptide Institute), p3-Alcβ[1-11] (Peptide Institute), p3-Alcβ[9-19] (Peptide Institute)。
　結果
　人工脳脊髄液を投与したマウスでは、既知物体Ａの探索時間より、新規物体Ｂの探索時間が有意に長かった (図１Ａ, n = 11 mice, P < 0.01, paired t-test)。すなわち、正常に記憶が獲得されていた。一方で、アミロイドβ蛋白質オリゴマー体を投与したマウスでは、既知物体Ａと新規物体Ｂの探索時間がほぼ同じであった (図１Ｂ，n = 20 mice, P > 0.05, paired t-test)。すなわち、記憶獲得が完全に障害されているのが分かった。さらに我々は、アミロイドβ蛋白質オリゴマー体に加えてp3-Alcβ37ペプチドを混合投与したマウスでは、記憶能力が顕著に回復していることを見出した (図１Ｃ，n = 14 mice, P < 0.01, paired t-test)。図２では、識別指標を用いて各グループの記憶獲得能力を表わしている。人工脳脊髄液投与群と比較してオリゴマー体投与群では、識別指標の有意な低下が観察された (図２，P < 0.01, Tukey test)。オリゴマー体投与群と比較してオリゴマー体/p3-Alcβ37混合液投与群では、識別指標の有意な上昇が観察された (図２，P < 0.01, Tukey test)。さらに、人工脳脊髄液投与群とオリゴマー体/p3-Alcβ37投与群では、識別指標の有意な差は見られなかった (図２，P > 0.05, Tukey test)。これらの結果は、アミロイドβ蛋白質オリゴマー体により誘発される記憶障害は、p3-Alcβ37ペプチドの脳内投与により劇的に改善されることを示している。
　次に、この p3-Alcβ37 による記憶障害の回復作用が、アミロイドβ蛋白質による記憶障害に特有なのか、それとも他の記憶障害も回復できるのか検討した。記憶・学習にNMDA受容体が必須なのはよく知られており、NMDA受容体の遺伝子ノックアウト (Rampon et al, Nat Neurosci 3, 238-244, 2000)、およびNMDA受容体阻害剤である MK-801投与 (de Lima et al, Behav Brain Res 156, 139-143, 2005) によって新規物体認識試験も障害されることが報告されている。そこで本研究でも、人工脳脊髄液を脳室投与した状態でMK-801を腹腔内投与したところ、既知物体Ａと新規物体Ｂの探索時間がほぼ同じになることが分かった（図３Ａ，n = 8 mice, P > 0.05, paired t-test）。すなわち、記憶獲得が障害されていた。そこで次に、p3-Alcβ37ペプチドを脳室投与した状態でMK-801を腹腔内投与した。しかしながら、既知物体Ａと新規物体Ｂの探索時間に顕著な差は観察されず（図３Ｂ，n = 9 mice, P > 0.05, paired t-test）、記憶障害の改善効果を示さないことがわかった。すなわち、p3-Alcβ37ペプチドは、アミロイドβ蛋白質オリゴマー体による記憶障害は改善するが、NMDA受容体阻害による記憶障害は改善できないことが示された。これは、この p3-Alcβ37ペプチドが、アミロイドβ蛋白質に対して比較的選択的に作用し、記憶障害を改善することを示している。
　最後に、p3-Alcβ37の部分ペプチドでも、アミロイドβ蛋白質オリゴマー体による記憶障害を回復できるか検討した。アミロイドβ蛋白質オリゴマー体に加え、p3-Alcβ37の1-19番目の部分ペプチド（p3-Alcβ37[1-19], 図４Ａ）を混合投与したマウスでは、記憶能力が顕著に改善した（図４Ｂ，n = 15 mice, P < 0.01, paired t-test）。一方、オリゴマー体とp3-Alcβ37の20-37番目の部分ペプチド（p3-Alcβ37[20-37], 図４Ａ）を混合投与したマウスでは、記憶能力は改善しなかった（図４Ｃ，n = 16 mice, P > 0.05, paired t-test）。そこで次に、p3-Alcβ37[1-19]ペプチドをさらに断片化し、1-11 番目の部分ペプチド（p3-Alcβ37[1-11], 図４Ａ）と 9-19番目の部分ペプチド（p3-Alcβ37[9-19], 図４Ａ）に関して検討した。その結果、オリゴマー体/p3-Alcβ37[1-11] では記憶能力は障害されたままだが（図４Ｄ，n = 14 mice, P > 0.05, paired t-test）、オリゴマー体/p3-Alcβ37[9-19] では記憶能力が顕著に改善することを見出した（図４Ｅ，n = 16 mice, P < 0.01, paired t-test）。これらの結果は、p3-Alcβ37の部分ペプチドである p3-Alcβ37[9-19]（１１アミノ酸）でも、アミロイドβ蛋白質オリゴマー体による記憶障害が回復できることを示している。
配列番号１：p3-Alcβ37
配列番号２：p3-Alcβ[9-19] / a part of p3-Alc beta 37 (position 9-19)
配列番号３：p3-Alcβ[1-11] / a part of p3-Alc beta 37 (position 1-11)
配列番号４：p3-Alcβ[1-19] / a part of p3-Alc beta 37 (position 1-19)
配列番号５：p3-Alcβ[20-37] / a part of p3-Alc beta 37 (position 20-37)
配列番号６：amyloid-β42

Claims (6)

  1. 　下記（I）～（VI）のいずれかに該当するペプチドを有効成分として含有することを特徴とする、アミロイドβ蛋白質により誘発される認知障害の治療剤。
    　（I）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
    ＶＬＳＳＱＱＦＬＨＲＧＨＱＰＰＰＥＭＡＧＨＳＬＡＳＳＨＲＮＳＭ
    ＩＰＳＡＡＴ　　　　　　　　　　　　　　　　　　（配列番号１）
    　（II）配列番号１で表されるアミノ酸配列に対して１～３個のアミノ酸が、欠失、付加、置換または側鎖の修飾のいずれか一種以上により改変されたアミノ酸配列からなるペプチド。
    　（III）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む、配列番号１で表されるアミノ酸配列の部分配列からなるペプチド。
    ＨＲＧＨＱＰＰＰＥＭＡ　　　　　　　　　　　　　（配列番号２）
    　（IV）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む、配列番号１で表されるアミノ酸配列の部分配列に対して、１～２個のアミノ酸が、欠失、付加、置換または側鎖の修飾のいずれか一種以上により改変されたアミノ酸配列からなるペプチド。
    　（V）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、当該アミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端に合計で１～５０個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列（ただし、配列番号１で表されるアミノ酸配列の全部または一部と一致する場合を除く。）からなるペプチド。
    　（VI）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して、１～２個のアミノ酸が、欠失、付加（Ｎ末端および／またはＣ末端に対する付加を除く。）、置換または側鎖の修飾のいずれか一種以上により改変されたアミノ酸配列を含み、当該改変されたアミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端に合計で１～５０個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。
  2. 　請求項１に記載の治療剤を含有する、アルツハイマー病治療薬。
  3. 　請求項１に記載の治療剤を、アミロイドβ蛋白質により誘発される認知障害を発症した哺乳類（ヒトを除く）またはそのモデル動物に投与するステップを含むことを特徴とする、アミロイドβ蛋白質により誘発される認知障害の治療方法。
  4. 　請求項２に記載の治療薬を、アルツハイマー病に罹患した哺乳類（ヒトを除く）またはそのモデル動物に投与するステップを含むことを特徴とする、アルツハイマー病の治療方法。
  5. 　前記（I）～（VI）のいずれかに該当するペプチドを、アミロイドβ蛋白質により誘発される認知障害を発症した哺乳類（ヒトを除く）またはそのモデル動物に投与するステップ、あるいはそのモデル細胞としての培養神経細胞または神経細胞に発現している生体分子に添加するステップを含むことを特徴とする、アミロイドβ蛋白質により誘発される認知障害の病態解析方法。
  6. 　前記（I）～（VI）のいずれかに該当するペプチドを、アルツハイマー病に罹患した哺乳類（ヒトを除く）またはそのモデル動物に投与するステップ、あるいはそのモデル細胞としての培養神経細胞または神経細胞に発現している生体分子に添加するステップを含むことを特徴とする、アルツハイマー病の病態解析方法。
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