CN102260308A

CN102260308A - 左旋异戊酰螺旋霉素iii、其制剂、制备方法及应用

Info

Publication number: CN102260308A
Application number: CN2011101362542A
Authority: CN
Inventors: 姜洋; 郝玉有
Original assignee: Shenyang Tonglian Group Co Ltd
Current assignee: Shenyang Tonglian Group Co Ltd
Priority date: 2010-05-25
Filing date: 2011-05-25
Publication date: 2011-11-30
Anticipated expiration: 2031-05-25
Also published as: CN102260308B

Abstract

本发明涉及一种左旋异戊酰螺旋霉素III，还涉及其制剂、制备方法和用途，所述制剂的组成为左旋异戊酰螺旋霉素III和药学上可接受的载体和/或辅料，左旋异戊酰螺旋霉素III的纯度大于90wt％，优选大于95wt％，进一步优选为大于98wt％。本发明的左旋异戊酰螺旋霉素III具有良好的抗菌活性，其制剂包括注射用水针剂、注射用粉针剂、冻干粉针剂，本发明的制剂填补了目前市场上异戊酰螺旋霉素III单一组分制剂的空白，为抗感染疾病的治疗提供了一种见效迅速的新途径；本发明的异戊酰螺旋霉素III的单一组分的制剂，其生产工艺稳定、质量标准易控，适用于大规模工业化生产。

Description

左旋异戊酰螺旋霉素III、其制剂、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种大环内酯类基因工程新抗生素，特别是左旋异戊酰螺旋霉素III、其药用制剂、制备方法以及在抗感染疾病药物中的应用。

背景技术

大环内酯类抗生素在临床上占有重要地位，因其对革兰氏阳性菌和支原体有很好的活性，对部分革兰氏阴性菌也有作用，且对一些日趋流行的弓形体、军团菌等难以控制的病原体有良好的抗菌活性和组织渗透性，口服吸收快，不良反应少，对肝、肾功能基本无影响，还有潜在的免疫调节作用，九十年代被认为在治疗成人呼吸道感染上将会与β-内酰胺类药物竞争。

手性(Chirality)是三维物体的基本属性，是自然界的本质属性之一。作为生命活动重要基础的生物大分子，如蛋白质、多糖、核酸和酶等，几乎全是手性的，这些大分子在体内往往具有重要的生理功能。手性药物(chiral drug)是指药物分子结构中引入手性中心后，得到的一对互为实物与镜像的对映异构体。这些对映异构体的理化性质基本相似，仅仅是旋光性有所差别，分别被命名为R-型(右旋)或S-型(左旋)、外消旋。而近20年以来随着药学研究工作的深入，已表明药物对映体的立体选择性(stereoselectivity)的不同，使其与各受体的亲和力不同而导致药理作用的极大差异。人们将手性药物中活性高的对映体称为优对映体(Eutomer)；而活性低的或无活性的对映体称为劣对映体(Distomer)。在许多情况下，劣对映体不仅没有药效，而且还会部分抵消优对映体的药效，有时甚至还会产生严重的毒副反应，表现出药效差异的复杂性，也决定了单一对映体的治疗指数与其消旋体有着相当的差异，如熟知的DL-(+-)合霉素的疗效仅为D(-)氯霉素的一半；普萘洛尔(propranolol)L-异构体的药物活性比D-异构体大100倍；(-)美沙酮是强止痛剂，而(+)无效。而且毒性也存在差别，如沙立度胺(thalidomide)的两个对映体对小鼠的镇静作用相近，但只有S(-)异构体及其代谢物才有胚胎毒及致畸作用；氯胺酮为一有特点的广泛应用的麻醉和镇痛药，但存在产生幻觉等副作用，研究发现，S(+)体作用比R(-)体强3～4倍，而毒副作用明显与后者有关。手性药物疗效的极大差异促进了手性药物的研究开发以及分离分析的发展。利用“手性”技术，人们可以有效地将药物中不起作用或有毒副作用的成分剔除，生产出具有单一定向结构的纯手性药物，从而让药物成分更纯，在治疗疾病时疗效更快、疗程更短。因此，手性药物的研究目前已成为国际新药研究的新方之一，各国政府和各大医药公司纷纷投入巨资，在手性药物制剂、手性原材料和手性中间体等领域进行研究开发，抢占世界手性制药市场。此外，随着手性技术的不断改进，尤其是液相色谱法的迅速广泛应用，积极地推动了手性药物对映体的分离分析和测定。单一对映体手性药物已得到了广泛的应用。

可利霉素是利用基因工程技术研制的新型螺旋霉素衍生物，原命名为必特螺旋霉素，曾用名为生技霉素[专利号：ZL97104440.6]。根据“中国药品通用名称命名原则”，经国家药典委员会技术审核及研究确定，必特螺旋霉素的中文通用名称更改为可利霉素，英文名称为Carrimycin。可利霉素的化学结构是以4”-异戊酰螺旋霉素为主成分，包括4”-异戊酰螺旋霉素I、II、III，其次还含有约6种4”-位羟基酰基化的螺旋霉素，故其化学名统称为4”-酰化螺旋霉素。

可利霉素主成分的化学结构如式(1)所示：

其中：异戊酰螺旋霉素I中的R选自H；

异戊酰螺旋霉素II中的R选自COCH₃、

异戊酰螺旋霉素III中的RCOCH₂CH₃。

可利霉素为16元环大环内酯类抗生素，其作用机制是通过与细菌核糖体结合而抑制其蛋白质合成。

药代动力学研究结果表明，可利霉素中具活性的有效组分主要为异戊酰螺旋霉素I、II、III。可利霉素进入体内后很快代谢为螺旋霉素，以母体药物异戊酰螺旋霉素I、II、III和活性代谢物螺旋霉素I、II、III的AUC_0-t总和计算，其口服绝对生物利用度平均为91.6％。文献报道，螺旋霉素人体口服绝对生物利用度为30～40％(Frydman AM et al J Antimicrob Chemother.1988，22(suppl B)：93-103)。说明异戊酰螺旋霉素的结构明显改善了活性成分螺旋霉素的生物利用度。单次服药可利霉素消除较慢，T_1/2在23～27小时之间。

体外试验结果表明，可利霉素对革兰氏阳性菌、尤其对某些耐药菌(如耐β-内酰胺金葡菌、耐红霉素金葡菌等)有效，与同类药无明显的交叉耐药性。同时它对支原体、衣原体有很好的抗菌活性，对部分革兰氏阴性菌也有抗菌活性，且对弓形体、军团菌等有良好抗菌活性和组织渗透性，还有潜在的免疫调节作用。其体内抗菌活性明显优于体外(ZL200310122420.9)。临床研究表明，每日服用可利霉素片剂200mg～400mg 5～7天，可适用于治疗化脓性链球菌引起的急性细菌性咽炎、急性化脓性扁桃体炎；敏感细菌引起的细菌性鼻窦炎、急性支气管炎；肺炎链球菌、流感嗜血杆菌以及肺炎支原体所致的轻症肺炎；支原体、衣原体引起的非淋球菌性尿道炎；敏感细菌引起的皮肤软组织感染、牙周炎、中耳炎等感染性疾病。其总有效率为92.68％。

临床研究证明，可利霉素是一个口服安全有效的抗生素。然而，由于可利霉素本身是经过发酵得到的产品，为多组分药物，因此多组分的进一步分离和提纯很困难。目前建立的高效液相色谱法，能将可利霉素样品中的多种酰化螺旋霉素进行分离，如异戊酰螺旋霉素II与(异)丁酰螺旋霉素III、(异)丁酰螺旋霉素II与丙酰螺旋霉素III、丙酰螺旋霉素III与其前面的小组分、丙酰螺旋霉素II与乙酰螺旋霉素III的分离度达到中国药典规定的1.5以上；而乙酰螺旋霉素III与其前面的小组分的分离度为1.2。

本发明人通过大量的研究发现，通过对培养、发酵条件的调整和优化，意外的得到了一种左旋可利霉素，该左旋可利霉素具有更加优良的抗感染活性。

目前采用高效液相色谱法，测定可利霉素9个酰化螺旋霉素组分，其中异戊酰螺旋霉素(I+II+III)总含量应不低于60％，酰化螺旋霉素总含量应不低于80％。对于发酵产生的多组分抗生素，很难达到化学药品对于注射剂的质量控制标准，但是对于临床危重病人或不宜口服用药的病人，注射给药见效迅速，因此研制异戊酰螺旋霉素的单一组分的制剂则具有非常深远的意义。本发明通过对左旋可利霉素的进一步研究得到了左旋异戊酰螺旋霉素I的单一组分，纯度可达到98wt％。

发明内容

本发明的首要发明目的在于提供一种左旋异戊酰螺旋霉素III。

本发明的第二发明目的在于提供一种左旋异戊酰螺旋霉素III的制剂。

本发明的第三发明目的在于提供这种左旋异戊酰螺旋霉素III的制备方法。

本发明的第四发明目的在于提供这种左旋异戊酰螺旋霉素III的应用。

本发明的第五发明目的在于提供这种左旋异戊酰螺旋霉素III的晶体化合物。

本发明的第六发明目的在于提供这种左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物的制备方法。

为了实现本发明的发明目的，本发明采用的技术方案为：

本发明涉及左旋异戊酰螺旋霉素III化合物，所述左旋异戊酰螺旋霉素III的化学结构式如式(1)所示，

其比旋光度为[α]_D＝(-)-49°～-51°(C＝0.02g/ml，CHCl₃，25℃，λ＝589.3nm)；熔点为116℃～118℃。

本发明涉及一种左旋异戊酰螺旋霉素III的制剂，所述制剂包括左旋异戊酰螺旋霉素III、左旋异戊酰螺旋霉素III的药用盐、左旋异戊酰螺旋霉素III与药学上可接受的辅料、或左旋异戊酰螺旋霉素III的药用盐与药学上可接受的辅料，所述左旋异戊酰螺旋霉素III的纯度大于90wt％。

本发明的第一优选方案为：在左旋异戊酰螺旋霉素III制剂中，左旋异戊酰螺旋霉素III的纯度大于95wt％，优选左旋异戊酰螺旋霉素III的纯度大于98wt％。

本发明的第二优选方案为：本发明的制剂为液体制剂、固体制剂、半固体制剂或气体制剂，所述的液体制剂选自注射剂、输液剂、溶液剂、合剂、糖浆剂、酊剂、溶胶剂、芳香水剂、甘油剂、胶体溶液剂、胶浆剂、混悬剂或乳剂；所述的固体制剂选自粉针、冻干粉针、片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、丹剂或膜剂；所述的半固体制剂选自软膏剂、硬膏剂、栓剂、浸膏剂、凝胶剂；所述的气体制剂选自气雾剂或喷雾剂，优选注射用水针剂、注射用粉针剂、冻干粉针剂。

本发明的第三优选方案为：本发明的制剂包含左旋异戊酰螺旋霉素III的单位剂量为10～1500mg，优选50～1000mg，更优选100～500mg。

本发明的第四优选方案为：在制剂中，左旋异戊酰螺旋霉素III在制剂中的重量百分比为10～95％，优选50～95％，更优选75～95％。

本发明还涉及一种含有左旋异戊酰螺旋霉素III的制剂，所述制剂包括左旋异戊酰螺旋霉素III和枸橼酸、己二酸、马来酸中的至少一种制备的注射用水针剂、注射用粉针剂或冻干粉针剂。其中，左旋异戊酰螺旋霉素III与枸橼酸的摩尔比为1∶0.8～1.2，左旋异戊酰螺旋霉素III与己二酸的摩尔比为1∶0.8～1.2、左旋异戊酰螺旋霉素III与马来酸的摩尔比为1∶0.8～1.2。

本发明还涉及左旋异戊酰螺旋霉素III的制备方法：包括左旋可利霉素的制备、左旋异戊酰螺旋霉素III的纯化。

其中，左旋可利霉素的制备过程包括将含有4″-异戊酰基转移酶基因的螺旋酶素产生菌克隆菌株WSP-195培养后进行生物发酵，并对发酵液进行提取；在pH值6.0～9.0，优选6.0～8.0，更优选6.0～7.5的条件下进行发酵，且pH值随时间的变化曲线呈三个连续的阶段，第一阶段满足方程式y₁＝k₁x₁+6.0，其中0.0227≤k₁≤0.1364，0＜x₁≤22；第二阶段满足方程式y₂＝k₂x₂+b₂，其中-0.0735≤k₂＜0，6.5＜b₂≤10.62，22≤x₂≤56；第三阶段满足方程式y₂＝k₃x₃+b₃，其中0＜k₃≤0.0078，6.06≤b₃＜6.5，56≤x₃≤120。

本发明中，通过对培养发酵条件的调整和优化，尤其是通过pH调节剂严格控制发酵过程中的pH值，使发酵过程中pH值随时间的变化曲线呈三个连续的阶段，并且每个阶段各满足一定的方程式，从而得到了具有光学活性的左旋可利霉素。进而分离得到左旋异戊酰螺旋霉素III。

优选的，本发明中生物发酵的条件为：将含有4″-异戊酰基转移酶基因的螺旋霉素产生菌克隆菌株WSJ-195，在含有黄豆饼粉2％、葡萄糖1％、淀粉3％、CaCO₃ 0.5％、NaCl 0.4％和琼脂2％的斜面培养基上，于pH6.5～7.5、温度28～38℃的条件下培养8～15天，接种于含有黄豆饼粉1.5％、淀粉3.0％、NaCl 0.4％、CaCO₃ 0.5％、鱼蛋白胨0.3％和KH₂PO₄ 0.05％的种子培养基，于pH6.5～7.5、25～30℃的条件下培养40～80小时，以0.1～20％接种量种入含有葡萄糖0.5％、淀粉6.0％、酵母粉0.5％、鱼粉2.0％、NH₄NO₃ 0.6％、NaCl 1.0％、CaCO₃ 0.5％、KH₂PO₄ 0.05％、MgSO₄ 0.1％、豆油0.5％和消沫剂0.02％的发酵培养基，于pH6.5～7.5、26～30℃的条件下培养72～120小时，获得发酵液；

所述pH调节剂选自盐酸、醋酸、氨水、氢氧化钠、氢氧化钾中的至少一种。

优选的，本发明的生物发酵液的提取的步骤为：将得到的发酵液用硫酸铝处理得滤液，调pH至8.5～9.0，用乙酸丁酯提取，乙酸丁酯提取液用无盐水及I％NaH₂PO₄分别洗涤，再用pH2.0～2.5水提取，得水相提取液，调pH至4.5～5.5，挥发除去残余乙酸丁酯得水提取液，过滤，滤液调pH8.5～9.0，沉淀，用纯化水进行淋洗，得湿品，干燥，得左旋可利霉素；

其中，采用盐酸、醋酸、枸橼酸、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠、碳酸钠中的至少一种来调节pH值。

左旋异戊酰螺旋霉素III的纯化的步骤包括：采用色谱分离的方法对可利霉素样品进行纯化，采用ODS色谱柱，乙腈和醋酸氨缓冲液进行梯度洗脱，对左旋异戊酰螺旋霉素III组分目标峰进行分离。

优选的，在左旋异戊酰螺旋霉素III的纯化过程中，采用制备型高效液相色谱、紫外检测，记录分离的紫外谱图，按照异戊酰螺旋霉素III的保留时间RT 48.009收集异戊酰螺旋霉素III样品。

进一步优选的，在左旋异戊酰螺旋霉素III的纯化过程中，将收集到的左旋异戊酰螺旋霉素III采用旋转蒸发除去乙腈，然后用乙酸乙酯萃取，蒸发除去萃取液中乙酸乙酯，得膏状样品；用石油醚重溶所得样品，再蒸发除去石油醚，获得左旋异戊酰螺旋霉素III白色粉末状固体。

其中，所述的流动相为乙腈A和pH＝8.5、150mM醋酸氨水溶液的混合溶剂。

所述的左旋异戊酰螺旋霉素III纯化的具体条件为：采用线性梯度：0～60分钟，A为25％～65％；61～90分钟，A为65％～90％；

流速：260mL/min；

进样量：10mL；

进样浓度：0.5g/mL；

检测波长：231nm；

收集方式：紫外触发收集。

本发明还涉及左旋异戊酰螺旋霉素III的晶体化合物，该左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物使用Cu-Kα射线测量得到的X-射线粉末衍射在2θ为8.0°、10.0°、11.2°、11.7°、16.4°、19.1°、19.6°、20.0°、21.4°、22.9°、23.6°和29.4°显示有特征峰。其X-射线粉末衍射图谱如附图5所示。

所述左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物的制备方法为，先将左旋异戊酰螺旋霉素III化合物固体溶解于无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮的混合溶剂中，然后加入纯水，边加入边搅拌，纯水加完后降温至5℃～15℃，降温的同时继续搅拌，得到左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物。

其中，所述左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物的制备方法的第一优选技术方案为，所加入的纯水的体积为无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮体积之和的2～9倍，优选2.5～7.5倍；加入纯水的速度为4～10ml/分钟，优选6～8ml/分钟。

所述左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物的制备方法的第二优选技术方案为，所用混合溶剂中无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮的体积比为1∶0.1～10∶0.5～1，优选1∶2～8∶0.8～1。

所述左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物的制备方法的第三优选技术方案为，所加入纯水的搅拌速度为30～60转/分钟，优选45～60转/分钟；纯水加完后，搅拌速度为10～30转/分钟，优选10～20转/分钟。

所述左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物的制备方法的第四优选技术方案为，纯水加完后降温的速度为每小时1～3℃，优选每小时1～1.5℃。

不同晶型的晶胞内分子在空间构型、构象与排列不同，使其溶解性存在显著差异，导致制剂在体内有不同的溶出速率，直接影响制剂在体内的吸收、分布、排泄和代谢，最终因其生物利用度不同而导致临床药效的差异。本发明对所制备的左旋异戊酰螺旋霉素III晶体与左旋异戊酰螺旋霉素III的疗效进行了比较，发现本发明所制备的左旋异戊酰螺旋霉素III晶体的疗效优于左旋异戊酰螺旋霉素III。

本发明还涉及含有左旋异戊螺旋霉素III及其制剂在制备治疗和/或预防抗感染疾病药物中的应用。所述的感染性疾病为革兰氏阳性菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、解脲支原体、沙眼衣原体、化脓性链球菌、卡他球菌、淋球菌、流感杆菌、军团菌或厌氧菌感染引起的疾病。

本发明还涉及含有左旋异戊螺旋霉素III及其制剂在制备抗菌药物中的应用，所述的菌为肺炎链球菌、甲类链球菌、化脓性链球菌、肠球菌、金葡菌、表葡菌、卡他球菌、淋球菌、流感杆菌、大肠杆菌、产毒大肠杆菌、致病性大肠杆菌、侵龚性大肠杆菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯氏菌、普通变形杆菌、伤寒杆菌、不动杆菌、枸橼酸杆菌枸橼酸杆菌、粘质沙雷氏菌、宋内氏痢疾杆菌、福氏痢疾杆菌、白色念球菌；军团菌如嗜肺军团菌、高曼军团菌、博茨曼军团菌、杜莫夫军团菌、佐丹军团菌、米克戴德军团菌；厌氧菌如脆弱类杆菌、多形类菌、普通类杆菌、吉氏类杆菌、吉氏类杆菌、栖瘤胃类杆菌、不解糖普氏杆菌、口腔普氏杆菌、具核酸杆菌、拉式梭杆菌、双岐杆菌、乳杆菌、消化链球菌、疮疱丙酸杆菌、产气荚膜梭菌、酵母样真菌。

下面对本发明进行进一步的详细描述。

本发明涉及一种左旋异戊酰螺旋霉素III，本发明通过对培养、发酵条件的调整和优化，严格控制溶液的pH值，得到了左旋异戊酰螺旋霉素III。

本发明的左旋异戊酰螺旋霉素III具有较好的抗菌活性，为抗生素类药物增加了一个新的可用于注射的品种，为现有抗生素耐药性这一技术难题提出了新的解决方案。

其中，本发明的左旋异戊酰螺旋霉素III比旋度测定方法为：取本品精密称定，加氯仿溶解并稀释成每1ml中约含20mg的溶液，采用钠光谱的D线(589.3nm)测定旋光度，测定长度为1dm，测定温度为25℃，使用读数至0.0001°，并经过检定的旋光计。

本发明的左旋异戊酰螺旋霉素III的熔点的测定方法为：取干燥的左旋异戊酰螺旋霉素III适量，置熔点测定用毛细管中，进行熔点测定，重复测定3次，取平均值。

本发明还涉及含有左旋异戊酰螺旋霉素III的制剂，其组成为左旋异戊螺旋霉素III和药学上可接受的载体和/或辅料，其中，异戊酰螺旋霉素III的纯度大于90wt％，优选大于95wt％，更优选大于98wt％。

本发明的含有左旋异戊酰螺旋霉素III的制剂优选注射用水针剂、注射用粉针剂、冻干粉针剂。将本发明的含有单一组分的左旋异戊螺旋霉素制剂制成注射用水针剂或粉针剂，从而使本发明的左旋异戊酰螺旋霉素III制剂能够更加迅速的为人体所吸收，从而达到抗感染的作用。

本发明的含有左旋异戊螺旋霉素的制剂，包含下述单位剂量：左旋异戊螺旋霉素III 10～1500mg，优选50～1000mg，更优选100～500mg。

本发明的含有左旋异戊酰螺旋霉素III的制剂中左旋异戊酰螺旋霉素III的重量百分比为10～90％，优选50～90％，更优选75～90％。

本发明的口服制剂可含有常用的赋形剂，如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。其中，适用的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂。适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁。适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。

本发明的固体口服制剂可通过混合，填充，压片等常用的方法制备。

本发明的口服液体制剂的形式，例如：水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂，或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂可含有常规的添加剂，如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯或阿拉伯胶；非水性载体(它们可以包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常规的香味剂或着色剂。

本发明的注射剂中可含有任何常用的药用载体和/或赋形剂、稳定剂、抗氧化剂、络合剂，还可以含有药用的防腐剂、缓冲剂或局部麻醉剂等。其制备方法采用常用方法制备。

本发明的制剂所采用的药学上可接受的载体选自：甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、EDTA二钠、EDTA钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、吐温-80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β-环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。

本发明的制剂在使用时根据病人的实际情况确定用法用量，可每日服三次，每次1～20剂。

本发明的有益效果为：

1、本发明的左旋异戊酰螺旋霉素III具有良好的抗菌性能。根据现代药理学研究，由于药物对映体的立体选择性的不同，使其与各受体的亲和力不同而导致药理作用发生很大差异，因此本发明的左旋异戊酰螺旋霉素III具有很强的药理活性。

2、本发明的左旋异戊酰螺旋霉素III或其晶体的单一组分的注射剂，为临床危重病人或不宜口服给药的病人提供了见效迅速、易于接受的用药剂型的可能性；

3、不同晶型的晶胞内分子在空间构型、构象与排列不同，使其溶解性存在显著差异，导致制剂在体内有不同的溶出速率，直接影响制剂在体内的吸收、分布、排泄和代谢，最终因其生物利用度不同而导致临床药效的差异。本发明对所制备的左旋异戊酰螺旋霉素III晶体与左旋异戊酰螺旋霉素III的疗效进行了比较，发现本发明所制备的左旋异戊酰螺旋霉素I、II或III晶体的疗效优于左旋异戊酰螺旋霉素III；

4、本发明的左旋异戊酰螺旋霉素III或其晶体的单一组分的制剂，其生产工艺稳定、质量标准易控，适用于大规模工业化生产。

附图说明

图1为实施例1中左旋异戊酰螺旋霉素III紫外触发收集所得的色谱图；

图2为本发明实施例1发酵过程的pH值随时间的变化曲线图；

图3为本发明实施例2中发酵过程的pH值随时间的变化曲线图；

图4为本发明实施例3中发酵过程的pH值随时间的变化曲线图；

图5为本发明的左旋异戊酰螺旋霉素III的X-射线粉末衍射图谱。

以下具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不对本发明的内容构成限制。

具体实施方式

实施例1 左旋异戊酰螺旋霉素III的分离制备

(1)生物发酵：将含有4″-异戊酰基转移酶基因的螺旋酶素产生菌克隆菌株WSJ-195，在含有黄豆饼粉2％、葡萄糖1％、淀粉3％、CaCO₃ 0.5％、NaCl 0.4％和琼脂2％的斜面培养基上，于pH6.5～7.5、温度28～38℃的条件下培养8～15天，接种于含有黄豆饼粉1.5％、淀粉3.0％、NaCl 0.4％、CaCO₃ 0.5％、鱼蛋白胨0.3％和KH₂PO₄ 0.05％的种子培养基，于pH6.5～7.5、25～30℃的条件下培养40～80小时，以0.1～20％接种量种入含有葡萄糖0.5％、淀粉6.0％、酵母粉0.5％、鱼粉2.0％、NH₄NO₃ 0.6％、NaCl 1.0％、CaCO₃0.5％、KH₂PO₄ 0.05％、MgSO₄ 0.1％、豆油0.5％和消沫剂0.02％的发酵培养基，于pH6.5～7.5、26～30℃的条件下培养72～120小时，获得发酵液；

其中，通过对培养、发酵条件的调整和优化，严格控制溶液的pH值，在pH值6.0～9.0条件下进行发酵，在pH值6.0～9.0的条件下进行发酵，发酵时间为120h，且pH值随时间的变化曲线呈三个连续的阶段，第一阶段满足方程式y₁＝0.1364x₁+6.0，其中0＜x₁≤22；第二阶段满足方程式y₂＝-0.0735x₂+10.64，其中22≤x₂≤56；第三阶段满足方程式y₃＝0.0078x₃+6.06，其中56≤x₃≤120，曲线变化如图2所示，获得发酵液。

(2)生物发酵液的提取：将步骤(1)将得到的发酵液用硫酸铝处理得滤液，调pH至8.5，用乙酸丁酯提取，乙酸丁酯提取液用无盐水及1％NaH₂PO₄分别洗涤，再用pH2.0水提取，得水相提取液，调pH至4.5～5.5，挥发除去残余乙酸丁酯得水提取液，过滤，滤液调pH8.5～9.0，沉淀，用纯化水进行淋洗，得湿品，干燥，得左旋可利霉素；

(3)左旋异戊酰螺旋霉素III纯化：采用制备型高效液相色谱对初步分离得到的样品进行纯化，采用ODS制备色谱柱，用乙腈和醋酸氨缓冲液进行梯度洗脱，通过紫外检测，记录分离的紫外谱图，对异戊酰螺旋霉素III组分目标峰进行收集：

色谱柱：ODS制备色谱柱；

流动相：乙腈(A)，100mM醋酸氨水溶液(B)；

梯度条件：采用线性梯度0～60分钟，A为25％～65％；61～90分钟，A为65％～90％；

流速：260mL/min；

进样量：10mL；

进样浓度：0.5g/mL；

检测波长：231nm；

收集方式：紫外触发收集；

按照异戊酰螺旋霉素III的保留时间RT 48.009，收集的异戊酰螺旋霉素III样品，采用旋转蒸发除去乙腈，然后用1倍量乙酸乙酯萃取，用旋转蒸发除去萃取液中乙酸乙酯，得膏状样品；用石油醚重溶所得样品，再用旋转蒸发除去石油醚，获得异戊酰螺旋霉素III白色粉末状固体。

实施例2：左旋异戊酰螺旋霉素III的分离制备

(1)生物发酵：将含有4″-异戊酰基转移酶基因的螺旋酶素产生菌克隆菌株WSJ-195，在含有黄豆饼粉2％、葡萄糖1％、淀粉3％、CaCO₃ 0.5％、NaCl 0.4％和琼脂2％的斜面培养基上，于pH7.2、温度32℃的条件下培养12天，接种于含有黄豆饼粉1.5％、淀粉3.0％、NaCl 0.4％、CaCO3 0.5％、鱼蛋白胨0.3％和KH2PO4 0.05％的种子培养基，于pH7.2、27℃的条件下培养70小时，以12％接种量种入含有葡萄糖0.5％、淀粉6.0％、酵母粉0.5％、鱼粉2.0％、NH4NO3 0.6％、NaCl 1.0％、CaCO3 0.5％、KH2PO40.05％、MgSO4 0.1％、豆油0.5％和消沫剂0.02％的发酵培养基，于pH6.0～9.0、26℃的条件下培养100小时，获得发酵液；在pH值6.0～8.0的条件下进行发酵，发酵时间为110h，且pH值随时间的变化曲线呈三个连续的阶段，第一阶段满足方程式y₁＝0.0909x₁+6.4，其中0＜x₁＜22；第二阶段满足方程式y₂＝-0.0441x₂+7.8，其中22＜x₂＜56；第三阶段满足方程式y₃＝0.0078x₃+6.06，其中56≤x₃≤110，曲线变化如图3所示，获得发酵液。具体控制曲线见附图3。

(2)生物发酵液的提取：将步骤(1)得到的发酵液用硫酸铝处理得滤液，调pH至8.6，用乙酸丁酯提取，乙酸丁酯提取液用无盐水及I％NaH₂PO₄洗涤，再用pH2.3水提取，得水相提取液，调pH至5.0，挥发除去残余乙酸丁酯得水提取液，过滤，滤液调pH8.6，沉淀，用纯化水进行淋洗，得湿品，干燥，得左旋可利霉素。

(3)左旋异戊酰螺旋霉素III纯化：采用制备型高效液相色谱对初步分离得到的样品进行纯化，采用ODS制备色谱柱，用乙腈和醋酸氨缓冲液进行梯度洗脱，通过紫外检测，记录分离的紫外谱图，对左旋异戊酰螺旋霉素III组分目标峰进行收集：

色谱柱：ODS制备色谱柱；

流动相：乙腈(A)，100mM醋酸氨水溶液(B)；

流速：260mL/min；

进样量：10mL；

进样浓度：0.5g/mL；

检测波长：231nm；

收集方式：紫外触发收集；

按照左旋异戊酰螺旋霉素III的保留时间RT 48.009，收集的左旋异戊酰螺旋霉素III样品，采用旋转蒸发除去乙腈，然后用1倍量乙酸乙酯萃取，用旋转蒸发除去萃取液中乙酸乙酯，得膏状样品；用石油醚重溶所得样品，再用旋转蒸发除去石油醚，获得异戊酰螺旋霉素III白色粉末状固体。

实施例3 左旋异戊酰螺旋霉素III的分离制备

(1)培养发酵：将含有4″-异戊酰基转移酶基因的螺旋霉素产生菌克隆菌株WSJ-195，在斜面培养基上培养后，将其接种于种子培养基，培养后，再将其接种于发酵培养基，通过葡萄糖和枸橼酸控制发酵过程，在pH值6.0～7.5的条件下进行发酵，发酵时间为115h，且pH值随时间的变化曲线呈三个连续的阶段，第一阶段满足方程式y₁＝0.0682x₁+6.0，其中0＜x₁＜22；第二阶段满足方程式y₂＝-0.0294x₂+8.147，其中22＜x₂＜56；第三阶段满足方程式y₃＝0.0078x₃+6.06，其中56＜x₃＜115，变化曲线如图4，获得发酵液。

色谱柱：ODS制备色谱柱；

流动相：乙腈(A)，100mM醋酸氨水溶液(B)；

流速：260mL/min；

进样量：10mL；

进样浓度：0.5g/mL；

检测波长：231nm；

收集方式：紫外触发收集；

实施例4 左旋异戊酰螺旋霉素III注射用水针剂的制备

(1)将左旋异戊酰螺旋霉素III 100mg与等摩尔数的己二酸混合均匀，溶解于1～5ml蒸馏水中，得到淡黄色澄明溶液，pH为4.6～5.6。

(2)在步骤(1)所配制好的溶液中加入溶液体积0.1％的活性炭，过滤；

(3)在无菌条件下灌封、灭菌、检查和包装。

实施例5 左旋异戊酰螺旋霉素III注射用水针剂的制备

(1)将左旋异戊酰螺旋霉素III 100mg与等摩尔数的枸橼酸混合均匀，溶解于1～5ml蒸馏水中，得到淡黄色澄明溶液，pH为4.6～5.6。

(3)在无菌条件下灌封、灭菌、检查和包装。

实施例6 左旋异戊酰螺旋霉素III注射用水针剂的制备

(1)将左旋异戊酰螺旋霉素III 100mg与等摩尔数的马来酸混合均匀，溶解于1～5ml蒸馏水中，得到淡黄色澄明溶液，pH为4.6～5.6。

(3)在无菌条件下灌封、灭菌、检查和包装。

实施例7 左旋异戊酰螺旋霉素III注射用粉针剂的制备

(3)再加入甘露醇30～150mg作为冻干支撑剂，低温快速冷冻9h后，冷冻干燥，获得淡黄色疏松块状物，在无菌条件下压盖、检查和包装。

实施例8 左旋异戊酰螺旋霉素III注射用粉针剂的制备

实施例9 左旋异戊酰螺旋霉素III注射用粉针剂的制备

实施例10 左旋异戊酰螺旋霉素III片(按1000片计算)

处方：

制备工艺：称取适量淀粉，稀释至15％浓度，加热至糊状，制成粘合剂；主料可利霉素、辅料淀粉、低取代羟丙基纤维素、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁分别过100目筛，按处方量，称取所需主料和辅料；左旋异戊酰螺旋霉素III、淀粉、低取代羟丙基纤维素充分混合均匀后，用15％淀粉浓度的淀粉糊制成软材，14目筛制粒，50-60℃干燥，水份控制在3-5％，14目筛整粒，加羧甲基淀粉钠，硬脂酸镁混合，测定颗粒含量；根据颗粒含量，计算片重，压片(Φ9mm浅凹冲头)，检测片重差异；经检验合格后进行包装。

实施例11 左旋异戊酰螺旋霉素III胶囊剂(按1000粒计算)

处方：

制备工艺：将主料左旋异戊酰螺旋霉素III、辅料药用淀粉按工艺配方量分别称取后，装入混合器充分混合后1.5～2小时；取样检测含量所得数据应和理论数据基本一致(每粒胶囊所装重量约为0.105g)，将经检验合格的药用3号胶囊及混合好的待装原料按全自动胶囊机操作要求，分别填入装料器进行填充，将填充好的胶囊进行差异检验(±10％以内，＜0.3g)，溶出度符合要求，将检验后符合要求的胶囊，放入打光机内加入液体石蜡进行15-20分钟的打光，然后取出进行成品包装盒检验。

实施例12 左旋异戊酰螺旋霉素III糖衣片(按1000片计算)

处方：同实施例10。

制备工艺：按照实施例11的方法操作，将检验合格后的片芯放入糖衣锅中，将配好的糖浆(浓度为65～70％)慢慢放入锅中，然后将温度升至40℃左右，加入适量滑石粉，鼓风干燥25-30分钟反复几次粉衣层包平后，再进行糖衣层15～20分钟进行糖衣层包衣，待糖衣层包平后进行所需色调的包衣层包衣，将色浆调好后放入糖浆中搅匀倒入锅内，每次约15～20分钟，分别几次搅拌均匀。

实施例13 左旋异戊酰螺旋霉素III糖浆(按1000袋计算)

处方：

制备工艺：左旋异戊酰螺旋霉素III原粉，柠檬酸、蔗糖分别用高速气流粉碎机粉碎成颗粒85％通过300目，15％通过180目，然后将粉碎后的细粉按处方量称取后充分混合1～1.5小时，测其含量，计算装量(理论装量为每袋500mg)，然后将混合物装入袋装机中，装好铝箔纸，按分装机操作要求分装，装量差异在±5％以内，装好后进行检验合格后外包装。

实施例14 左旋异戊酰螺旋霉素III肠溶片(按1000片计算)

处方：参照实施例10。

制备工艺：片芯制备按实施例5操作，将符合要求的片芯放入糖衣锅中，用60～70％浓度的糖浆和滑石粉进行底衣层包衣三层，然后进行隔离层包衣，加入10％玉米朊酒精溶液，滚转法10～15分钟吹干，再用苯二甲酸二乙酯、丙酮、邻苯二甲酸醋酸纤维、酒精溶液，即肠溶液滴入锅内，滚转法10～15分钟吹干2～3次。检验合格后，按实施例13进行糖衣包衣。

实施例15 左旋异戊酰螺旋霉素III胃溶片(按1000片计算)

处方：参照实施例10。

制备工艺：片芯制备按实施例11操作，将符合要求的片芯放入高效包衣机中，然后将符合标准的包衣粉(包括脂溶性和水溶性)按要求配制成包衣液，再将包衣液放入胶体磨粉碎、过滤待用。将装好片芯的高效包衣锅预热，转速控制在5～10转/分，温度控制在45～60℃，用气雾喷头(＞300目)将包衣孔液喷入锅内，然后干燥25～35分钟，反复进行8-12次，直至包匀，晾干检验合格后包装。

实施例16 左旋异戊酰螺旋霉素III颗粒剂(按1000袋计算)

处方：

制备工艺：左旋异戊酰螺旋霉素III原粉、糖粉、糊精过120目筛，按处方量称取左旋异戊酰螺旋霉素III、糖粉、糊精混合均匀，将混合均匀的上述物料用5％PVP-K30胶浆制成软材，摇摆式颗粒剂制粒70℃干燥、整粒，送检合格后分装。

实施例17

将实施例1中制备的左旋异戊酰螺旋霉素III白色粉末状固体进一步制备成晶体。

左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物的制备方法：

1.先将实施例1中得到的左旋异戊酰螺旋霉素III化合物固体溶解于无甲醇、无水乙醇和无水丙酮的混合溶剂中，所用混合溶剂中无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮的体积比为1∶10∶1；

2.然后加入纯水，边加入边搅拌，所加入的纯水的体积为无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮体积之和的2.5倍；加入纯水的速度为4ml/分钟；加入纯水时的搅拌速度为30转/分钟；

3.纯水加完后降温至5℃，降温的速度为每小时1℃，降温的同时继续搅拌，搅拌速度为10转/分钟；得到左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物。

将制备得到的左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物使用Cu-Kα射线测量得到的X-射线粉末衍射在2θ为8.0°、10.0°、11.2°、11.7°、16.4°、19.1°、19.6°、20.0°、21.4°、22.9°、23.6°和29.4°显示有特征峰，其X-射线粉末衍射图谱如附图5所示。

实施例18

左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物的制备方法：

1.先将左旋异戊酰螺旋霉素III化合物固体溶解于无甲醇、无水乙醇和无水丙酮的混合溶剂中，所用混合溶剂中无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮的体积比为1∶10∶1；

2.然后加入纯水，边加入边搅拌，所加入的纯水的体积为无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮体积之和的9倍；加入纯水的速度为10ml/分钟；所加入纯水的搅拌速度为60转/分钟；

3.纯水加完后降温至15℃，降温的速度为每小时3℃，降温的同时继续搅拌，搅拌速度为10转/分钟；得到左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物。

该左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物使用Cu-Kα射线测量得到的X-射线粉末衍射图谱与附图5相似。

实施例19

将实施例2中制备的左旋异戊酰螺旋霉素III白色粉末状固体进一步制备成晶体。

左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物的制备方法：

1.先将左旋异戊酰螺旋霉素III化合物固体溶解于无甲醇、无水乙醇和无水丙酮的混合溶剂中，所用混合溶剂中无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮的体积比为1∶5∶0.8；

2.然后加入纯水，边加入边搅拌，所加入的纯水的体积为无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮体积之和的7.5倍；加入纯水的速度为6ml/分钟；所加入纯水的搅拌速度为40转/分钟；

3.纯水加完后降温至10℃，降温的速度为每小时2℃，降温的同时继续搅拌，搅拌速度为15转/分钟；得到左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物。

实施例20

将实施例3中制备的左旋异戊酰螺旋霉素III白色粉末状固体进一步制备成晶体。

左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物的制备方法：

1.先将左旋异戊酰螺旋霉素III化合物固体溶解于无甲醇、无水乙醇和无水丙酮的混合溶剂中，所用混合溶剂中无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮的体积比为1∶2∶1；

2.然后加入纯水，边加入边搅拌，所加入的纯水的体积为无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮体积之和的7.5倍；加入纯水的速度为8ml/分钟；所加入纯水的搅拌速度为45转/分钟；

3.纯水加完后降温至12℃，降温的速度为每小时2.5℃，降温的同时继续搅拌，搅拌速度为20转/分钟；得到左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物。

实施例21

左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物的制备方法：

2.然后加入纯水，边加入边搅拌，所加入的纯水的体积为无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮体积之和的5倍；加入纯水的速度为7ml/分钟；所加入纯水的搅拌速度为60转/分钟；

3.纯水加完后降温至12℃，降温的速度为每小时1.2℃，降温的同时继续搅拌，搅拌速度为15转/分钟；得到左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物。

实施例22 左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物的注射用水针剂的制备

取实施例17制备的左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物制备注射用水针剂，制备方法同前。

实施例23 左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物的注射用水针剂的制备

实施例24 左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物注射用粉针剂的制备

取实施例18制备的左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物制备注射用粉针剂，制备方法同前。

实施例25 左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物注射用粉针剂的制备

实施例26 左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物的片剂的制备

取实施例19制备的左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物制备片剂，制备方法同前。

实施例27 左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物的胶囊剂的制备

取实施例20制备的左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物制备胶囊剂，制备方法同前。

实施例28 左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物的颗粒剂的制备

取实施例21制备的左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物制备颗粒剂，制备方法同前。

实验例1 左旋异戊酰螺旋霉素III的急性毒性试验

一、试验方法：

小鼠、大鼠口服给药(实施例1制得的左旋异戊酰螺旋霉素III)

小鼠和大鼠试验前观察2天，动物未见异常者进行试验。试验前小鼠和大鼠禁食过夜。根据预试结果，试验药分别给小鼠和大鼠灌胃给药4000mg/kg，未见动物死亡。本试验按4000mg/kg分别给小鼠和大鼠灌胃给药，小鼠按100mg/ml，灌胃容量为0.6-0.8ml/只；大鼠按173mg/ml，灌胃容量0.8～1.0ml/50克。灌胃给药后观察一周的动物毒性反应和死亡数。

二、试验结果见表1、表2

表1.试验药小鼠口服急性毒性(LD₅₀)

对本发明其它实施例所制备的左旋异戊酰螺旋霉素III或左旋异戊酰螺旋霉素III制剂也进行了相同的试验，其获得的结果相似。

实验例2 左旋异戊酰螺旋霉素III体内药效

试验方法：感染菌液制备：将-80℃冰箱保存的试验菌液取出放在室温1h左右，然后将肺炎链球菌、化脓性链球菌、肠球菌吸取0.1ml菌液分别接种于2ml MH汤中(加10％灭活马血清)，金葡菌也按上述方法接种0.1ml菌液于2ml MH汤中，置37℃孵箱中培养18h后为原菌液，用5％胃膜素稀释原菌液，使动物感染100％致死菌数作为感染菌液。

可利霉素的临床用药途径拟为口服，因此可利霉素试验选择灌胃给药。左旋异戊酰螺旋霉素III(实施例1制得)采用肌肉注射给药。

将小鼠腹腔注射0.5ml致死菌量后动物出现活动明显减少、静卧、毛松等症状。感染后分别在0.5-6h每一只小鼠灌胃一次0.2ml，无任何不良反应。观察七日动物死亡数，用Bliss程序，分别计算各药对小鼠感染后的半数保护剂量(ED₅₀)，与各药物比较保护效果。

体内试验结果见表3和表4。

表3：5种抗生素对小鼠腹腔感染6株链球菌的疗效比较

表4：5种抗生素对小鼠腹腔感染肠球菌和金葡菌的疗比较

体内试验结果：

异戊酰螺旋霉素III对小鼠感染12株细菌的疗效见表3和表4，显示有良好的保护效果。

实验例3：体外药效实验：

一、临床分离菌的测定：

试验方法：采用平皿二倍稀释法：将熔化琼脂培养基定量倒入含系列药物浓度的平皿内与药液混匀(链球菌和肠球菌加入5％去纤维羊血做成血培基、流感杆菌加入7％、淋球菌用淋球菌培养基加入7％去纤维羊血做成巧克力培基)，待凝固后，再将新鲜培养菌液稀释成106CFU/mL，用多点接种仪接种于含抗菌药物的平皿琼脂上，经37℃培养18h；淋球菌置5％CO₂培养箱中孵育24h；军团菌置5％CO₂培养箱中培养48h；厌氧菌置厌氧箱内，37℃厌氧培养48h。观察抗菌药抑制细菌生长的最低浓度即为最低抑菌浓度(MIC)，并计算药物MIC₅₀和MIC₉₀与对照药比较。

附注：MIC₅₀抑制50％细菌生长最低的抑菌浓度；

MIC₉₀抑制90％细菌生长最低的抑菌浓度。

试验结果见表5：

表5：异戊酰螺旋霉素III与其他抗生素临床分离菌敏感分布的比较

二、体外抗沙眼衣原体和肺炎衣原体的测定

试验方法：

1.将HEp-2和McCoy细胞系分别种植在96孔细胞培养板(Costar公司)内，37℃，5％CO₂培养48小时成为单层细胞。

2.将待接种菌种稀释为10000～20000ifu(包涵体形成单位)/ml，0.1ml/孔接种。沙眼衣原体血清型B/TW-5/OT、D/UW-3/Cx接种McCoy细胞培养板，肺炎衣原体CWL-029接种HEp-2细胞培养板。首先吸去96孔培养板内的细胞培养液，然后按0.1ml/孔进行接种。其中A11～D11的4个孔，C12和D12的2个孔不接种菌种。

3.菌种接种完毕离心96孔细胞培养板，使用Beckman-Coulter公司的J-6MC离心机，离心力×1500g，离心温度35℃，离心时间60分钟。

4.离心完毕后，吸取接种的沙眼衣原体或肺炎衣原体，分别加入系列稀释的4种抗生素药物，0.1ml/孔。

5.37℃，5％CO₂培养，沙眼衣原体药敏试验板培养48小时，肺炎衣原体药敏试验板培养72小时。培养完毕，吸取抗生素药物溶液，PBS(0.01M，pH 7.4)洗涤2次，100％甲醇室温固定15分钟。

6.间接免疫荧光染色鉴定：沙眼及肺炎衣原体药敏试验板分别加入纯化的抗沙眼衣原体单克隆抗体(N54克隆)和肺炎衣原体单克隆抗体(P33克隆)，50μl/孔，37℃湿盒内温育30分钟，然后洗板机洗板4次，再加入兔抗鼠荧光抗体(Sigma公司)，50μl/孔，同样方法及条件温育及洗板。加入封片甘油，100μl/孔，在Nikon倒置荧光显微镜(Diaphot-200)下观察结果。

7.MIC的定义：96孔试验板中沙眼衣原体或肺炎衣原体包涵体生长完全被抑制孔(全孔未发现荧光染色的包涵体)的最小抗生素稀释浓度。

实验结果如表6。

表6：5种大环内脂类抗生素对沙眼及肺炎衣原体体外作用的最小抑菌浓度比较(MIC)

1、对于沙眼血清型B/TW-5/OT，异戊I、异戊II优于异戊III、可利霉素、红霉素、阿奇霉素，乙酰螺旋霉素(MIC为4μg/ml)较差。

2、对于沙眼血清型D/UW-3/Cx，三个异戊酰螺旋霉素和可利霉素、阿奇霉素体外作用类似，MIC为0.25μg/ml，属敏感；红霉素(0.5μg/ml)其次，乙酰螺旋霉素(MIC为2μg/ml)较差。

3、对于肺炎衣原体CWL-029，异戊II和红霉素体外作用最敏感，MIC≤0.016μg/ml，阿奇霉素和可利霉素、异戊I、异戊III较敏感；乙酰螺旋霉素(MIC为0.5μg/ml)较差。

4、总体来看异戊酰螺旋霉素对衣原体的效果优于其他试验药物。

三、体外抗解脲支原体和肺炎支原体

1、试验方法：在无菌12孔细胞培养板各孔加入U-PPLO 0.8ml(菌液对照孔加入0.9ml，培养基对照孔加入1.0ml)。

2、在各实验孔中加入10⁴CCU/ml的Uu菌液0.1ml，孔中的最终菌量为10³CCU/ml(培养基对照孔不加菌液)。

3、分三组(100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml抗生素原液)按照二倍递降浓度梯度用无菌Tip向各实验孔加入实验用抗生素：100μl，50μl，25μl，12.5μl。(菌液对照孔、培养基对照孔不加抗生素，同时设抗生素对照孔)

4、上述各孔混匀，培养版用胶带封口，放37℃温箱培养。

5、于实验后17-24h观察记录Uu生长情况。当Uu菌液对照孔呈现阳性生长时，此时能抑制Uu生长的最低抗生素浓度为该药样的最低MIC，实验结束时的MIC为最终MIC(24h)。

对抗解脲支原体和肺炎支原体菌株进行MIC测定，进行4次测定，结果显示如下：

异戊III的MIC值为0.025～0.125μg/ml，

可利霉素0.025～0.125μg/ml，

乙酰螺旋霉素0.5μg/ml，

红霉素5μg/ml，

阿奇霉素0.025～0.125μg/ml。

上述结果表明，异戊酰螺旋霉素III、可利霉素有良好的抗Uu作用，与阿奇霉素作用相似，优于乙酰螺旋霉素，红霉素在本组药样中抗Uu作用效果最差。

实验例4 左旋异戊酰螺旋霉素III临床试验

左旋异戊酰螺旋霉素III(实施例1制得)、阿奇霉素治疗敏感菌引起的成人急性呼吸道感染包括急性细菌性咽炎、化脓性扁桃体炎、急性气管-支气管炎、轻症肺炎等的疗效和安全性。

采用多中心、随机、双盲、双模拟对照试验。在5家医院按统一临床试验方案同时进行。

一、受试者入选标准

1、年龄为18～65岁的成年男女患者；

2、敏感菌引起的急性呼吸道感染包括急性细菌性咽炎、急性化脓性扁桃体炎、急性气管-支气管炎、轻症肺炎和急性鼻窦炎等；

3、入选前必须签署知情同意书；

4、所有受试者在研究期间及给药后至少3个月内实施避孕。

二、受试者排除标准

1、有肝、肾功能不全者(血Cr＞1.5mg/dl ALT＞正常上限)；

2、妊娠期或哺乳期妇女；

3、有胃肠道疾患无法口服药物者；

4、入选本试验前一周内曾服过抗菌药者；

5、有长期酗酒史者。

试验结果经过统计学专家统计，临床疗效(FAS)为：

异戊III、阿奇霉素的疗效分别为92.30％、89.61％。

细菌清除率为：

异戊III、阿奇霉素的细菌清除率分别为：97.56％、92.86％。

不良反应为：

异戊III、阿奇霉素的不良反应分别为2.5％、7.6％。

通过临床试验表明，异戊III是安全有效的抗感染类新药。

实验例5：左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物的体内药效

采用实施例17制备的左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物，试验方法同实施例2。

体内试验结果见表7和表8：

表7：5种抗生素对小鼠腹腔感染6株链球菌的疗效比较

表8：5种抗生素对小鼠腹腔感染肠球菌和金葡菌的疗比较

体内试验结果：

异戊酰螺旋霉素III晶体化合物对小鼠感染12株细菌的疗效见表7和表8，显示有良好的保护效果，并优于异戊酰螺旋霉素III化合物。

对本发明其它实施例所制备的左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物或左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物的制剂也进行了相同的试验，其获得的结果相似。

Claims

1.一种左旋异戊酰螺旋霉素III化合物，其特征在于，所述左旋异戊酰螺旋霉素III的化学结构式如式(1)所示，以氯仿为溶剂，25℃、浓度0.02g/ml的条件下测得比旋光度为[α]_D＝-49°～-51°；熔点为116℃～118℃；

2.一种含有权利要求1所述的左旋异戊酰螺旋霉素III的制剂，其特征在于，所述制剂包括异戊酰螺旋霉素III、异戊酰螺旋霉素III的药用盐、异戊酰螺旋霉素III与药学上可接受的辅料、或异戊酰螺旋霉素III的药用盐与药学上可接受的辅料，所述异戊酰螺旋霉素III的纯度大于90wt％，优选纯度大于95wt％，更优选纯度大于98wt％。

3.根据权利要求2所述的含有左旋异戊酰螺旋霉素III的制剂，其特征在于，所述制剂为液体制剂、固体制剂、半固体制剂或气体制剂，所述的液体制剂选自注射剂、输液剂、溶液剂、合剂、糖浆剂、酊剂、溶胶剂、芳香水剂、甘油剂、胶体溶液剂、胶浆剂、混悬剂或乳剂；所述的固体制剂选自粉针、冻干粉针、片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、丹剂或膜剂；所述的半固体制剂选自软膏剂、硬膏剂、栓剂、浸膏剂、凝胶剂；所述的气体制剂选自气雾剂或喷雾剂，优选注射用水针剂、注射用粉针剂、冻干粉针剂。

4.根据权利要求2所述的含有左旋异戊酰螺旋霉素III的制剂，其特征在于，所述制剂包含下述单位剂量：左旋异戊酰螺旋霉素III 10～1500mg，优选50～1000mg，更优选100～500mg。

5.根据权利要求2所述的含有左旋异戊酰螺旋霉素III的制剂，其特征在于，所述制剂中左旋异戊酰螺旋霉素III的重量百分比为10～95％，优选50～95％，更优选75～95％。

6.权利要求1所述的左旋异戊酰螺旋霉素III化合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括左旋可利霉素的制备、左旋异戊酰螺旋霉素III的纯化，其中，左旋可利霉素的制备过程包括将含有4″-异戊酰基转移酶基因的螺旋霉素产生菌克隆菌株WSP-195培养后进行生物发酵，并对发酵液进行提取；

在pH值6.0～9.0，优选6.0～8.0，更优选6.0～7.5的条件下进行发酵，且pH值随时间的变化曲线呈三个连续的阶段，第一阶段满足方程式y₁＝k₁x₁+6.0，其中0.0227≤k₁≤0.1364，0＜x₁≤22；第二阶段满足方程式y₂＝k₂x₂+b₂，其中-0.0735≤k₂＜0，6.5＜b₂≤10.62，22≤x₂≤56；第三阶段满足方程式y₂＝k₃x₃+b₃，其中0＜k₃≤0.0078，6.06≤b₃＜6.5，56≤x₃≤120。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述pH调节剂选自葡萄糖、枸橼酸、盐酸、醋酸、氨水、氢氧化钠、氢氧化钾中的至少一种，优选葡萄糖或氨水。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述左旋可利霉素制备过程的培养过程为：将含有4″-异戊酰基转移酶基因的螺旋霉素产生菌克隆菌株WSP-195，在含有黄豆饼粉2％、葡萄糖1％、淀粉3％、CaCO₃ 0.5％、NaCl 0.4％和琼脂2％的斜面培养基上，于pH6.5～7.5、温度28～38℃的条件下培养8～15天，接种于含有黄豆饼粉1.5％、淀粉3.0％、NaCl 0.4％、CaCO₃ 0.5％、鱼蛋白胨0.3％和KH₂PO₄ 0.05％的种子培养基，于pH6.5～7.5、25～30℃的条件下培养40～80小时，以0.1～20％接种量种入含有葡萄糖0.5％、淀粉6.0％、酵母粉0.5％、鱼粉2.0％、NH₄NO₃ 0.6％、NaCl 1.0％、CaCO₃ 0.5％、KH₂PO₄ 0.05％、MgSO₄ 0.1％、豆油0.5％和消沫剂0.02％的发酵培养基，26～30℃的条件下培养72～120小时，获得发酵液。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述生物发酵液提取的具体步骤包括：将发酵液用硫酸铝处理得到滤液，调滤液的pH至8.5～9.0，用乙酸丁酯提取，乙酸丁酯提取液分别用无盐水及1％NaH₂PO₄洗涤，再用pH2.0～2.5水提取，得水相提取液，调pH至4.5～5.5，挥发除去残余乙酸丁酯得水提取液，过滤，滤液调pH8.5～9.0，沉淀，用纯化水进行淋洗，得湿品，干燥，得左旋可利霉素。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，在生物发酵液提取过程中采用盐酸、醋酸、枸橼酸、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠、碳酸钠中的至少一种来调节pH值，优选醋酸或枸橼酸。

11.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述左旋异戊酰螺旋霉素III纯化的具体步骤包括：采用色谱分离的方法对可利霉素样品进行纯化，采用ODS色谱柱，乙腈和醋酸氨缓冲液进行梯度洗脱，对异戊酰螺旋霉素III组分目标峰进行分离。

12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，在左旋异戊酰螺旋霉素III的纯化过程中，采用制备型高效液相色谱、紫外检测，记录分离的紫外谱图，按照左旋异戊酰螺旋霉素III的保留时间RT 48.009收集异戊酰螺旋霉素III样品。

13.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，左旋异戊酰螺旋霉素III的纯化过程中，将收集到的左旋异戊酰螺旋霉素III采用旋转蒸发除去乙腈，然后用乙酸乙酯萃取，蒸发除去萃取液中乙酸乙酯，得膏状样品；用石油醚重溶所得样品，再蒸发除去石油醚，获得左旋异戊酰螺旋霉素III白色粉末状固体。

14.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述的流动相为乙腈A和pH＝8.5、150mM醋酸氨水溶液的混合溶剂。

15.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述的左旋异戊酰螺旋霉素III纯化的条件为：采用线性梯度：0～60分钟，A为25％～65％；61～90分钟，A为65％～90％；

流速：260mL/min；

进样量：10mL；

进样浓度：0.5g/mL；

检测波长：231nm；

收集方式：紫外触发收集。

16.权利要求1所述的异戊螺旋霉素III或权利要求2～6任意一项所述的异戊螺旋霉素III制剂在制备治疗和/或预防感染性疾病药物中的应用。

17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述的感染性疾病为革兰氏阳性菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、解脲支原体、沙眼衣原体、化脓性链球菌、卡他球菌、淋球菌、流感杆菌、军团菌或厌氧菌感染引起的疾病。

18.权利要求1所述的异戊螺旋霉素III或权利要求2～6任意一项所述的异戊螺旋霉素III制剂在制备抗菌药物中的应用，所述的菌为肺炎链球菌、甲类链球菌、化脓性链球菌、肠球菌、金葡菌、表葡菌、卡他球菌、淋球菌、流感杆菌、大肠杆菌、产毒大肠杆菌、致病性大肠杆菌、侵龚性大肠杆菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯氏菌、普通变形杆菌、伤寒杆菌、不动杆菌、枸橼酸杆菌枸橼酸杆菌、粘质沙雷氏菌、宋内氏痢疾杆菌、福氏痢疾杆菌、白色念球菌；军团菌如嗜肺军团菌、高曼军团菌、博茨曼军团菌、杜莫夫军团菌、佐丹军团菌、米克戴德军团菌；厌氧菌如脆弱类杆菌、多形类菌、普通类杆菌、吉氏类杆菌、栖瘤胃类杆菌、不解糖普氏杆菌、口腔普氏杆菌、具核酸杆菌、拉式梭杆菌、双岐杆菌、乳杆菌、消化链球菌、疮疱丙酸杆菌、产气荚膜梭菌、酵母样真菌。

19.一种含有权利要求1所述的左旋异戊酰螺旋霉素III的制剂，其特征在于，所述制剂包括左旋异戊酰螺旋霉素III和枸橼酸、己二酸、马来酸中的至少一种制备的注射用水针剂、注射用粉针剂或冻干粉针剂。

20.根据权利要求1所述的左旋异戊酰螺旋霉素III化合物，其特征在于，所述的左旋异戊酰螺旋霉素III化合物为晶体，使用Cu-Kα射线测量得到的X-射线粉末衍射在2θ为8.0°、10.0°、11.2°、11.7°、16.4°、19.1°、19.6°、20.0°、21.4°、22.9°、23.6°和29.4°显示有特征峰。

21.根据权利要求20所述的左旋异戊酰螺旋霉素III化合物，其特征在于，所述的左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物的制备方法为，先将左旋异戊酰螺旋霉素III化合物固体溶解于无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮的混合溶剂中，然后加入纯水，边加入边搅拌，纯水加完后降温至5℃～15℃，降温的同时继续搅拌，得到左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物，所用混合溶剂中无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮的体积比为1∶0.1～10∶0.5～1，优选1∶2～8∶0.8～1。

22.根据权利要求20所述的左旋异戊酰螺旋霉素III化合物，其特征在于，所加入的纯水的体积为无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮体积之和的2～9倍，优选2.5～7.5倍；加入纯水的速度为4～10ml/分钟，优选6～8ml/分钟。

23.根据权利要求20所述的左旋异戊酰螺旋霉素III化合物，其特征在于，所加入纯水的搅拌速度为30～60转/分钟，优选45～60转/分钟；纯水加完后，搅拌速度为10～30转/分钟，优选10～20转/分钟。

24.根据权利要求20所述的左旋异戊酰螺旋霉素III化合物，其特征在于，纯水加完后降温的速度为每小时1～3℃，优选每小时1～1.5℃。

25.一种含有权利要求20所述的左旋异戊酰螺旋霉素III的制剂，其特征在于，所述制剂包括异戊酰螺旋霉素III晶体化合物、异戊酰螺旋霉素III晶体化合物的药用盐、异戊酰螺旋霉素III晶体化合物与药学上可接受的辅料、或异戊酰螺旋霉素III晶体化合物的药用盐与药学上可接受的辅料，所述异戊酰螺旋霉素III晶体化合物的纯度大于99wt％。