CN102258892A

CN102258892A - 离心方法

Info

Publication number: CN102258892A
Application number: CN2011101261024A
Authority: CN
Inventors: 碓井圭名子; 岸田小百合; 田中友美; 向井博之
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 2010-05-13
Filing date: 2011-05-13
Publication date: 2011-11-30
Also published as: JP2011255369A; US20110278229A1; EP2392658A3; EP2392658A2

Abstract

本发明提供了一种将高比重物质和低比重物质从其混合物中分离的离心方法，该方法可防止在离心操作后收集低比重物质的过程中高比重物质的污染。该离心方法包括将包含高比重物质、低比重物质、以及热可逆凝胶和能够形成热可逆凝胶剂的已溶解的胶凝剂中的至少一种的混合物进行离心，其中，所述热可逆凝胶或者所述已溶解的胶凝剂可形成使所述低比重物质和所述高比重物质分离的凝胶层。所述离心操作优选在等于或低于所述胶凝剂的胶凝温度的条件下进行。

Description

离心方法

外国优先权

本申请基于2010年5月13日提交的日本专利申请No.2010-111134，其全部内容以引用的方式并入本文。

技术领域

本发明涉及一种将高比重物质和低比重物质从其混合物中分离出来的离心方法。

背景技术

固液分离法是一种将高比重物质和低比重物质从其混合物中分离出来的方法，固液分离法可大致分为过滤分离法和沉淀分离法。过滤分离法是一种通过过滤操作将固体物质和液体物质分离的方法，所述过滤操作使用诸如滤纸、滤网、多孔薄膜之类的过滤材料，并且利用自然重力、压缩力、减压力、离心力等作为驱动力。沉淀分离法是一种通过自然沉淀或离心力将混合物中的固体物质沉淀下来，并由此将其与上清液中的液体物质分离的方法，而利用离心力的方法称为离心法。

在诸如离心法之类的沉淀分离法中，会出现这样的情况：当将上清液与沉淀物分离时，沉淀物会进入上清液并将其污染。特别是当沉淀物的上部为浆液的形状时，则难以避免沉淀物进入并污染上清液。作为解决该问题的手段，已知一种使用沉淀辅助剂的方法(例如，专利文件1)。然而，需要根据固体物质的种类来选择合适的沉淀辅助剂，而且还会存在合适的沉淀辅助物是未知的情况，所以该方法缺乏灵活性。

此外，尽管离心方法也用于分离具有不同比重的液体混合物(液-液分离)。然而，即使是在离心辅助的液-液分离中，当对离心后形成为最外层的层进行分级时，仍会存在下层物质被污染的情况。

[专利文件1]国际公布No.WO2005/063979

发明内容

本发明的目的之一是提供一种可解决上述问题的离心方法。

本发明人进行了深入的研究，结果发现，在使用了离心法的固-液分离中，通过使用热可逆凝胶(thermoreversible gel)或能够形成热可逆凝胶的已溶解的胶凝剂，可防止沉淀物进入并污染上清液。此外，本发明人还发现，在使用离心法的液-液分离中，通过使用热可逆凝胶或者能够形成热可逆凝胶的已溶解的胶凝剂，可防止高比重物质进入并污染低比重物质，由此完成了本发明。

即，本发明包括以下实施方案。

[1]一种分离高比重物质和低比重物质的离心方法，其包括：

将包含高比重物质、低比重物质、以及热可逆凝胶和能够形成热可逆凝胶剂的已溶解的胶凝剂中的至少一种的混合物进行离心，

其中，所述热可逆凝胶或者所述已溶解的胶凝剂可形成使所述低比重物质和所述高比重物质分离的凝胶层。

[2]上述[1]所述的离心方法，其中，所述离心操作是在温度等于或低于所述胶凝剂的胶凝温度的条件下进行的。

[3]上述[1]或[2]所述的离心方法，其中，所述混合物包含固体和液体。

[4]上述[1]所述的离心方法，其中，所述混合物通过如下方法得到：

(a)将所述高比重物质、所述低比重物质和所述胶凝剂混合，或者将包含所述高比重物质和所述低比重物质的组合物与所述胶凝剂混合；以及

(b)将包含所述高比重物质、所述低比重物质和所述胶凝剂的混合物加热，以使所述胶凝剂溶解。

[5]上述[1]所述的离心方法，其中，所述混合物通过如下方法得到：

(A)获得溶解有所述胶凝剂的溶液；以及

(B)将所述溶液与所述高比重物质和所述低比重物质混合，或者使将所述溶液与包含所述高比重物质和所述低比重物质的组合物混合。

[6]上述[1]-[5]所述的离心方法，其中，所述混合物包含离子交换树脂。

[7]上述[6]所述的离心方法，其中，所述离子交换树脂为螯合树脂。

[8]上述[1]或[2]所述的离心方法，其中，所述混合物包含水成液和有机液体。

[9]上述[8]所述的离心方法，其中，所述有机液体为选自苯酚、氯仿和异戊醇所组成的组中的至少一种。

[10]上述[8]或[9]所述的离心方法，其中，所述水成液包含核酸。

[11][1]-[10]所述的离心方法，其中，所述胶凝剂为亲水性胶凝剂。

[12]上述[11]所述的离心方法，其中，所述亲水性胶凝剂为琼脂糖。

[13]上述[1]-[12]所述的离心方法，其中，所述胶凝剂部分地溶解在所述混合物中。

[14]上述[1]-[13]所述的离心方法，其还包括收集所述低比重物质。

[15]一种组合物，包含能够形成热可逆凝胶的亲水性胶凝剂和离子交换树脂。

根据本发明的示例性实施方案，可容易地防止沉淀物进入并污染上清液，其中沉淀物进入并污染上清液是通过沉淀分离法对上清液进行分级时所存在的问题。此外，还可容易地防止高比重物质进入并污染低比重物质，其中高比重物质进入并污染低比重物质是使用离心进行液-液分离时所存在的问题。

附图说明

图1A为示出了本发明示例性实施方案的固-液分离法的例子的图。

图1B为示出了本发明示例性实施方案的固-液分离法的例子的图。

图2为示出了通过常规方法进行用以大米DNA提取的离心后的状态图。

图3为示出了通过本发明示例性实施方案的方法进行用以大米DNA提取的离心后的状态图。

图4为示出了通过常规方法进行用以从植物中提取DNA的离心后的状态图。

图5为示出了通过本发明示例性实施方案的方法进行用以从植物中提取DNA的离心后的状态图。

图6为示出了通过常规方法进行用以从福尔马林固定的石蜡包埋组织切片中提取DNA的离心处理后的状态图。

图7为示出了通过本发明示例性实施方案的方法进行用以从福尔马林固定石蜡包埋的组织切片中提取DNA的离心处理后的状态图。

图8为示出了实施例6中通过以鼠CCND基因中的164bp区段作为目标序列而获得的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果的图。

泳道M表示100bp DNA Ladder Marker。泳道1表示阴性对照。泳道2表示阳性对照。泳道3和6分别表示使用2.5μl和1μl的下述上清液作为PCR模板而获得的PCR产物，该上清液为：使用不含胶凝剂的样品，通过极为小心的方式以避免树脂层的污染而收集得到的上清液。泳道4和7分别表示使用2.5μl和1μl的下述上清液作为PCR模板而获得的PCR产物，该上清液为：使用不含胶凝剂的样品，通过故意使树脂层受到少量的污染而收集得到的上清液。泳道5和8分别表示使用2.5μl和1μl的下述上清液作为PCR模板而获得的PCR产物，该上清液为通过使用含有胶凝剂的样品而收集得到的上清液。

图9为示出了实施例6中通过以鼠CCND基因中的416bp区段作为目标序列而获得的PCR的琼脂糖凝胶电泳结果的图。

具体实施方式

以下详细描述本发明的示例性实施方案。在此，除非另有注释，否则在以下描述中“％”是指“(重量/体积)％”。

本发明的示例性实施方案的离心方法是一种通过离心方式来分离高比重物质和低比重物质的方法，其中通过在存在热可逆凝胶和/或能够形成热可逆凝胶的已溶解的胶凝剂的情况下进行离心，形成了使低比重物质与高比重物质分离的热可逆凝胶层。无论是固-液分离法还是液-液分离法中，本发明的示例性实施方案的离心方法均可应用。

对本发明示例性实施方案的高比重物质和低比重物质没有特别的限定，只要高比重物质的比重高于低比重物质的比重即可。

低比重物质可以是这样的物质、组合物、或者它们的混合物，其包含需要通过使用本发明的离心方法而与其它组分分离的组分。低比重物质优选为液体物质，更优选为水成液物质。

高比重物质可以是这样的物质、组合物、或者它们的混合物，其包含需要通过使用本发明的离心方法而除去的组分。高比重物质可以是固体物质、液体物质、或者它们的混合物。当高比重物质为液体物质时，其可以是水成液或者有机液体，优选为有机液体。

对本发明示例性实施方案中所使用的能够形成热可逆凝胶的胶凝剂(也简称为胶凝剂)没有特别的限定，只要其为能够引起热可逆的溶胶-凝胶转变的胶凝剂即可，其可以是亲水性胶凝剂或者亲油性胶凝剂。其优选的例子包括这样的胶凝剂，在制备该胶凝剂的溶解产物以及在等于或低于其胶凝温度下进行离心时，该胶凝剂能够在所需位置上形成凝胶层。虽然没有对胶凝剂加以特别的限定，但是当低比重物质为水成液物质时，可适当使用亲水性胶凝剂。作为能够形成热可逆凝胶的亲水性胶凝剂，可以列举的有琼脂糖、角叉菜胶、胞外多糖胶、罗望子胶、红藻胶、果胶和明胶，最适合列举的为琼脂糖。可使用包含上述胶凝剂的组合物(例如，以琼脂糖作为主要组分的琼脂)作为胶凝剂。

对本发明示例性实施方案的热可逆凝胶没有特别的限定，只要其为热可逆的溶胶-凝胶转变即可。可由上述胶凝剂来制备热可逆凝胶。

可任选地通过确定离心后凝胶层的形成条件来决定热可逆凝胶和/或胶凝剂的用量。当需要形成厚的凝胶层以确保防止离心后高比重物质进入并污染低比重物质时，可将包含高比重物质、低比重物质以及热可逆凝胶和/或胶凝剂的混合物中的热可逆凝胶和/或胶凝剂的浓度设定在较高水平上。当需要提高低比重物质的收集量(collectionyield)时，可将混合物中热可逆凝胶和/或胶凝剂的浓度设定为能够在离心后形成凝胶层的范围内的较低水平上。尽管对胶凝剂的浓度没有特别的限定，但是当使用琼脂糖作为胶凝剂时，包含高比重物质、低比重物质以及琼脂糖的混合物中琼脂糖的浓度优选为0.05％至1.0％，更优选为0.075％至0.75％，进一步优选为0.1％至0.3％。

对离心条件没有特别的限定，但前提条件是：在离心后，低比重物质形成为上层，并且会形成使低比重物质与高比重物质分离的凝胶层。可根据热可逆凝胶和/或胶凝剂的种类、混合物中热可逆凝胶和/或胶凝剂的浓度、用作热可逆凝胶和/或胶凝剂的溶剂的液体物质的种类等来确定离心条件。尽管对离心条件没有特别的限定，但是当使用琼脂糖作为胶凝剂时，离心力优选为5000G至30000G，更优选为10000G至20000G，进一步优选为12000G至18000G。此外，离心时间优选为1分钟至1小时，更优选为3分钟至30分钟，进一步优选为5分钟至20分钟。离心温度可等于或低于胶凝剂的胶凝温度。尽管对离心温度没有特别的限定，但是当将Agarose LO3“TaKaRa”(由TAKARA BIO INC.生产)用作胶凝剂时，离心温度优选低于37℃，更优选低于34℃，进一步优选低于10℃。

热可逆凝胶和/或可溶性胶凝剂在离心后形成了使低比重物质与高比重物质分离的凝胶层。术语“使低比重物质与高比重物质分离”是指凝胶层形成为使低比重物质的层(上层)与高比重物质(其可形成为层)分离的层(下层)。在此，该说明书中的术语“下层”是指通过离心而形成于液体层(其形成为上层)的下方的层。除了能够与最下层区分开的上述上层(中间层)之外的其他层均包括在本说明书的术语“下层”的范围内。当离心后形成三个以上的层时，可在能够防止高比重物质进入并污染低比重物质这样的范围内，在这两个以上的下层中的任意位置处形成凝胶层。当离心后高比重物质发生沉淀并且沉淀物未形成层时，会出现所形成的凝胶层为包含沉淀物的形式的情况。此外，例如当混合物中存在比沉淀物的比重更高的物质时，则离心后沉淀物或沉淀物层不总是位于最下层。

本发明离心方法的实施方案为固-液分离法。固-液分离法包括以下步骤：对包含固体(高比重物质)、液体(低比重物质)以及热可逆凝胶和/或能够形成热可逆凝胶的已溶解的胶凝剂的混合物进行离心，其中热可逆凝胶和/或已溶解的胶凝剂形成为与液体层(上层)分离的凝胶层(下层)。优选在等于或低于胶凝剂的胶凝温度的条件下进行离心操作。该方法还可进一步包括收集低比重物质的步骤。如图1A和图1B所示，其示意性地示出了本发明示例性实施方案的固-液分离法的例子。图1B示出的是沉淀物未形成层、并且凝胶层形成为包含沉淀物的形式的实施方案。

根据本发明示例性实施方案的固-液分离法，在获得包含高比重物质、低比重物质和已溶解的用以形成热可逆凝胶的胶凝剂的混合物之后，在等于或低于胶凝剂的胶凝温度的温度下，上述混合物的全部或者一部分可能会胶凝化，之后可对胶凝化的混合物进行离心处理。

当本发明示例性实施方案的固-液分离法包括收集低比重物质(液体)的步骤时，对收集方法没有特别的限定。甚至当由于沉淀物的上部变为浆液形成而难以通过常规的沉淀分离法来防止沉淀物进入并污染液体时，也可通过本发明示例性实施方案的固-液分离法来防止沉淀物进入并污染液体，从而使得可通过(例如)倾析来收集液体。

对获得包含高比重物质、低比重物质和热可逆凝胶和/或能够形成热可逆凝胶的已溶解的胶凝剂的混合物的方法没有特别的限制。在本发明的固-液分离法的示例性实施方案中，通过以下步骤来获得该混合物：(a)将高比重物质、低比重物质和胶凝剂混合，或者将包含高比重物质和低比重物质的组合物与胶凝剂混合；以及(b)将包含高比重物质、低比重物质和胶凝剂的混合物加热，以使胶凝剂溶解。

例如，当目标是通过用固体物质从而从作为样品的液体中除去不需要的物质(例如，通过使不需要的物质附着在固体物质上而将其除去)时，可通过预先制备胶凝剂和固体物质的混合物、并随后将该混合物加入到液体中以进行本发明示例性实施方案的离心方法，从而除去不需要的物质。在这种情况下，可将胶凝剂和固体物质的混合物以悬浮液的形式使用，以有助于其加入到样品中。此外，当目标是从作为样品的固体中提取所需物质时，可通过预先制备包含待用作萃取溶剂的液体和胶凝剂的混合物、并随后将其加入到样品中以进行本发明示例性实施方案的离心方法，从而提取所需物质。此外，当样品中不需要物质的除去(通过使用固体物质以除去不需要的物质)和所需物质的提取(通过使用萃取剂来提取所需物质)需要同时进行时，可通过预先制备包含胶凝剂、固体物质和萃取剂的混合物、并随后将其加入到样品中以进行本发明示例性实施方案的方法。

尽管对上述胶凝剂的形状没有特别的限定，但是可以列举的有可通过后续加热而容易地溶解的粉末或微凝胶。微凝胶为微细凝胶的松散材料，是指类似于水溶液状的具有流动性的凝胶，它可以通过在冷却时对由溶解胶凝剂而制备得到的溶液施加搅拌力或类似的力，以破坏凝胶的形成而制备得到。通过使用微凝胶形式的胶凝剂，使得胶凝剂易于分散在经过混合处理的产物中。可按照现有文献(例如，日本专利文献No.2513506)中描述的方法来制备微凝胶。

尽管对上述用于除去不需要物质的固体物质没有特别的限定，但是可以列举的有离子交换树脂、活性炭、硅胶以及亲合树脂。作为离子交换树脂，可以列举的有阴离子交换树脂、阳离子交换树脂和螯合树脂。此外，作为待提取的特定物质，可以列举的有(例如)核酸，如DNA、RNA等。

在“(b)将包含高比重物质、低比重物质和胶凝剂的混合物加热，以使胶凝剂溶解”中，胶凝剂溶解在成为溶剂的液体中。加热条件可以是使胶凝剂完全溶解在液体中的条件、或者是使胶凝剂部分溶解在液体中的条件，前提是在随后的离心操作中可形成凝胶层。例如，在Naomichi Kunizaki和Masao Sano的“Food polysaccharides-Knowledge onEmulsification，Viscosity Improvement and Gelation(日文版)”(Heibunsha出版，2001年11月25日)中描述了各种胶凝剂的溶解度。在设置加热条件时，也可参考现有文献。例如，在将琼脂糖粉末溶解在水中的情况中，可用肉眼确定胶凝剂在溶剂中的溶解状态。尽管未溶解的琼脂糖粉末的水悬浮液是白色的，但是可观察到部分溶解于水中的琼脂糖粉末为透明颗粒、或者为中心部分呈白色而表面透明的颗粒(所谓的未溶解粉块)。尽管对加热条件没有特别限定，但是(例如)当使用琼脂糖作为胶凝剂时，温度优选为46℃至120℃，更优选为50℃至110℃，进一步优选为55℃至100℃。此外，加热时间优选为1分钟至1小时，更优选为2分钟至30分钟，进一步优选为5分钟至20分钟。在此，可存在这样的情况：在该步骤中通过加热以溶解胶凝剂的同时，可进行样品中特定物质的提取以及不需要物质的除去。

在本发明固液分离法的另一实施方案中，通过以下步骤来获得混合物：(A)获得其中溶解有胶凝剂的溶液；以及(B)将该溶液与高比重物质和低比重物质混合，或者将该溶液与包含高比重物质以及低比重物质的组合物混合。

本发明还包括一种组合物，该组合物包含能够形成热可逆凝胶的胶凝剂以及可用于分离或纯化所需物质的固体物质。该组合物优选用于(例如)上述本发明示例性实施方案的固液分离法中。该组合物优选包含用于形成热可逆凝胶的亲水性胶凝剂和吸附载体。作为吸附载体，可以列举的有离子交换树脂、活性炭、硅胶、螯合树脂和亲合树脂，可将选自其中的一种用作PCR抑制剂的吸附树脂。吸附载体优选为离子交换树脂。

例如，当应用本发明示例性实施方案的离心方法，通过使用PCR抑制剂吸附树脂而从福尔马林固定石蜡包埋的组织切片中提取DNA[例如，使用市售可得的DEXPAT(注册商标，由TAKARA BIO株式会社生产)提取DNA]时，本发明示例性实施方案的组合物可包含能够形成热可逆凝胶的亲水性胶凝剂、PCR抑制剂吸附树脂(螯合树脂)以及表面活性剂水溶液。将完全悬浮的上述组合物倒入盛有福尔马林固定石蜡包埋的组织切片的容器中，于约100℃下加热大约10分钟，之后在等于或低于胶凝剂的胶凝温度的温度下进行离心处理，此时在最下层中形成有螯合树脂沉淀物，其上为凝胶层，上层为包含从福尔马林固定石蜡包埋的组织切片中提取出的DNA的水层。由于通过利用所述组合物而在上层和沉淀物之间形成了凝胶层，使得在对水层进行分级时引发PCR抑制剂吸附树脂的污染的可能性大幅下降，从而使得水层的分级变得容易。例如，可通过倾析来收集水层。在使用常规方法的情况中，离心后PCR抑制剂吸附树脂沉淀物的上部成为浆液状态，并且PCR抑制剂吸附树脂为透明的，因此在水层分级过程中，会存在因不小心而引起树脂污染的情况。由于PCR抑制剂吸附树脂可能会抑制随后的核酸处理(例如PCR)，因此需要尽可能避免PCR抑制剂吸附树脂进入并污染DNA溶液。在含有通过上述方法提取的DNA的水层中，除去了来自福尔马林固定石蜡包埋的组织切片的物质，该物质可抑制随后的核酸处理(例如PCR)。在此尽管没有特别的限定，但是当通过本发明示例性实施方案并使用PCR抑制剂吸附树脂而从福尔马林固定石蜡包埋的组织切片提取DNA时，使用琼脂糖作为亲水性胶凝剂是有利的。

本发明包括含有能够形成热可逆凝胶的亲水性胶凝剂和吸附载体的试剂盒。该试剂盒还可包含(例如)用于核酸扩增反应的热稳定聚合酶、缓冲液、镁盐、dNTP混合液等。能够形成热可逆凝胶的亲水性胶凝剂和吸附载体的例子包括上文所述的那些。

本发明离心方法的一个实施方案为液-液分离法。本发明示例性实施方案的液-液分离法为基于比重的差别，通过利用热可逆凝胶和/或能够形成热可逆凝胶的胶凝剂而将液体混合物分离成两个以上的液体层的离心方法，其中所述热可逆凝胶和/或能够形成热可逆凝胶的胶凝剂会在所需位置上形成层。通过本发明示例性实施方案的液-液分离法，在进行上层中低比重物质的分级时，可防止高比重物质的污染。本发明示例性实施方案的液-液分离法可用于分离两种以上不会相互溶混的液体。作为上述高比重物质，可以适当地列举有机液体，而作为上述低比重物质，可以适当地列举水成液(例如，水性溶液)。即，液-液分离法的优选实施方案为包括以下步骤的方法：获得包含有机液体、水成液和热可逆凝胶和/或能够形成热可逆凝胶的胶凝剂的混合物；以及通过对上述混合物进行离心处理而形成为最下层的有机层、为上层的凝胶层、以及为最上层的含水层。

当离心后还包括收集低比重物质的步骤时，对收集方法没有特别的限定，也可(例如)通过倾析来收集包含低比重物质的液体层。

对本发明示例性实施方案的液-液分离法中所使用的有机液体没有特别的限定，前提是其比重大于水的比重，例如，可以列举的有苯酚、氯仿和异戊醇，也可以是包含两个或以上上述液体的混合液体。此外，作为上述含水液体，可以列举的有核酸水溶液。对上述热可逆凝胶没有特别的限定，前提是在离心后热可逆凝胶能够在所需位置上形成凝胶层，优选在高比重物质(例如，有机液体)和低比重物质(例如，含水液体)之间形成凝胶层。

尽管对本发明示例性实施方案的液-液分离法的用途没有特别的限定，但是本发明示例性实施方案的液-液分离法可用作从核酸水溶液中除去蛋白质的方法，例如苯酚处理、苯酚/氯仿处理、氯仿/异戊醇处理等。在这些除去蛋白质的方法中，离心后有机层形成为下层，含有变性蛋白质的层形成为上层，含水层形成为最上层，但是当收集含水层时却容易引起变性蛋白质的污染。当将本发明示例性实施方案的液-液分离法应用于从核酸水溶液中除去蛋白质的方法中时，则可在包含变性蛋白质的层以及含水层之间形成热可逆凝胶层，从而可以便捷地防止变性蛋白质进入并污染含水层。在此，在苯酚/氯仿处理中通常使用的是包含体积比为25∶24∶1的苯酚、氯仿和异戊醇的混合液体，并且在氯仿/异戊醇处理中通常使用的是包含体积比为24∶1的氯仿和异戊醇的混合液体。在此，在核酸水溶液的上述苯酚处理、苯酚/氯仿处理以及氯仿/异戊醇处理中，可使用已预先胶凝化的胶凝剂，而无须将其溶解。

实施例

以下将参照实施例来示意性地描述本发明的示例性实施方案，但是本发明并不局限于这些实施例。

实施例1

在从大米中提取DNA的离心操作中，使用了利用胶凝剂的离心方法，以对该方法进行测试。在此，作为从大米中提取DNA时所用的各试剂，使用了贴于大米DNA提取试剂盒[(可用于20粒精米)(用于大米鉴定的PCR试剂盒)，由TAKARA BIO株式会社制造]上的那些试剂。

分别将4.5mg、9mg、15mg和22.5mg的SeaKem(注册商标)GTG琼脂糖(由Lonza生产)加入到500μl的Lysis Buffer A中并使其悬浮，从而制得四种悬浮液。将所制得的4种悬浮液转移至沸水浴中，以使琼脂糖完全溶解。接下来，将200μl的已在沸水浴中预热的Lysis Buffer B加入到各悬浮液中并混合，在将这些琼脂糖溶液用于接下来的测试之前一直将其置于沸水浴中。

准备5只试管：分别将20粒大米置于容积为2ml的小试管中，之后加入540μl的无菌水，室温下静置过夜。在各试管中加入300μl的Lysis BufferA，将米粒粉碎直至完全没有块状物，然后加入120μl的LysisBuffer B并加以混合。再加入10μl的Protease K(由TAKARA BIO株式会社生产)并混匀，随后立即加热至55℃并在该温度下保温1小时。在此过程中，在开始加热后的第10分钟、第20分钟和第40分钟时进行反转混合(reversion mixing)。

接下来，加入200μl的上述4种琼脂糖溶液从而制得4个样品。在此方面，加入200μl的Lysis Buffer混合物(Lysis Buffer A：Lysis BufferB＝5∶2)而非琼脂糖溶液来制备样品以作为对照。将上述5个样品在4℃下以17,000G的离心力进行离心处理10分钟。

离心后分别收集全部上清液(在下层形成为凝胶层的例子中，上清液为含水层)并称重。表1所示的是离心时各样品的琼脂糖的浓度、离心后各样品的状态以及离心后各上清液(含水层)的收集量。

[表1]

通过在离心前向各样品中加入琼脂糖溶液并在琼脂糖胶凝温度或更低的温度下进行离心操作，使得含水层形成为上层，凝胶层形成为下层，并且大米粉碎产物的沉淀物形成为最下层。由于在大米粉碎产物和含水层之间形成了凝胶层，所以无需考虑大米粉碎产物的污染即可容易的分离出含水层。另一方面，在对照例中，当收集上清液时大米粉碎产物发生了污染。在这一方面，与对照例相比，虽然加入了琼脂糖的样品的含水层收集量较低，但是发现随着琼脂糖浓度的下降，含水层的收集量有上升的趋势。

实施例2

在通过氯化苄法从植物中提取DNA的离心操作中，使用了利用胶凝剂的离心方法，以对该方法进行测试。在此，作为氯化苄法中所用的各试剂，使用了贴于Plant DNA Isolation Reagent(由TAKARABIO株式会社生产)上的那些试剂。

分别将1ml无菌水加入到4个容量为1.5ml的小试管中，并分别向其中加入4.5mg、9mg、15mg或22.5mg的SeaKem(注册商标)GTG琼脂糖(由Lonza生产)并使其悬浮，从而制得四种悬浮液。将所制得的4种悬浮液转移至沸水浴中，以使琼脂糖完全溶解。在将这些琼脂糖溶液用于接下来的测试之前一直将其置于沸水浴中。

将菠菜切成3mm²以下的小块，并在5个容量为1.5ml的小试管中放入50mg菠菜，在-20℃下冷冻，随后在室温下解冻。用Pipetman的尖端按压各小试管底部的菠菜约10次，以粉碎植物组织。加入400μl的提取液1，用Vortex Mixer搅拌5秒。待旋转减慢后，加入80μl的提取液2，并用Vortex Mixer搅拌5秒。待旋转减慢后，加入150μl的提取液3，用Vortex Mixer搅拌5秒后至其旋转减慢。

接下来，加入120μl的上述浓度不同的琼脂糖溶液，从而制得4种样品。在这一方面，加入120μl的未添加琼脂糖的提取液混合液体来制备样品，以作为对照。将上述5个样品在4℃下以17,000G的离心力进行离心处理15分钟。

离心后将全部上层收集至容量为1.5ml的小试管中并称重。根据Plant DNA Isolation Reagent的标准操作进行后续操作，以由收集到的各上层制备DNA溶液。表2所示的是离心时各样品的琼脂糖的浓度、离心后各样品的状态以及离心后各上层的收集量。

[表2]

通过在离心前向各样品中加入琼脂糖溶液并在琼脂糖的胶凝温度或低于胶凝温度的温度下进行离心操作，从而能够形成如下这些层，从最下层起，这些层依次为：有机层、植物组织研磨产物的沉淀物层、白色层、凝胶层以及含水层。在这一方面，认为白色层为以来源于植物组织的多糖为主要组分的沉淀物。从形成有位于含水层下方的凝胶层的样品中，能够收集到上层，而无需考虑由再下层(furtherlower layers)(有机层、沉淀物层等)的污染。而在对照组中，由于小试管非常轻微的震动也会扰动沉淀物，所以需要在仅收集上层时特别注意。

实施例3

在用于从福尔马林固定石蜡包埋的组织切片中提取DNA的试剂的离心操作中，使用利用了胶凝剂的沉淀分离法，以对该方法进行测试。

将Agarose LO3“TaKaRa”(由TAKARA BIO株式会社生产)加入并悬浮在DEXPAT(注册商标，由TAKARA BIO株式会社生产)中，以使其终浓度为0.1％、0.2％、0.3％或0.4％，其中DEXPAT为来自福尔马林固定石蜡包埋的组织切片的PCR抑制剂吸附树脂和待用于DNA提取的特殊的表面活性剂的混合物。

将500μl的4种悬浮液分别转移至容量为1.5ml的小试管中。此外，将500μl未加入琼脂糖的DEXPAT(注册商标)放入容量为1.5ml的小试管中，以作为对照。

用加热器将上述5种悬浮液在100℃下加热10分钟，之后在4℃下以17,000G的离心力进行离心处理10分钟。

离心后将全部上层分别收集至新的容量为1.5ml的小试管中并称重。表3所示的是离心时各样品的琼脂糖的浓度、离心后各样品的状态以及离心后各上层的收集量。

[表3]

通过在琼脂糖的胶凝温度或低于胶凝温度的温度下，对添加了琼脂糖的DEXPAT(注册商标)进行离心处理，能够在最下层沉淀物(树脂层)和上层含水层之间形成为中间层的凝胶层。在其中凝胶层形成为中间层的样品中，能够收集到上层，而无需考虑最下层树脂的污染。而在对照组中，在收集上层的时候，位于树脂层上部的悬浮液形式的沉淀物会带来污染。

实施例4

利用用以从福尔马林固定石蜡包埋的组织切片中提取DNA的试剂的离心操作作为模型系统，以测试包含琼脂粉末和液体物质的混合物的加热条件。

通过除去DEXPAT(注册商标)中的树脂，并向其中加入SeaKem(注册商标)GTG琼脂糖至其浓度为0.15％，以制备溶液。将500μl的该溶液分配至7个容量为1.5ml的小试管中，并用加热器在36℃、40℃、45℃、55℃、65℃、75℃或85℃下加热10分钟。加热后在4℃下以17,000G的离心力进行离心处理10分钟，从而收集上层。表4所示的是加热后各样品的状态、离心后各样品的状态以及离心后各上层的收集量。

[表4]

该实施例的结果显示，即使是在胶凝剂部分溶解(未完全溶解在液体中)的状态下，通过随后的离心仍有可能形成凝胶层。

实施例5

对在固-液混合物胶发生凝胶化后进行离心操作的情况进行测试。

将SeaKem(注册商标)GTG Agarose悬浮在DEXPAT中至其终浓度为0.15％，以制备得到悬浮液，将500μl的该悬浮液置于容量为1.5ml的小试管中。用加热器将该小试管在100℃下加热10分钟，之后在4℃下进行冷却，直至全部悬浮发生胶凝化。之后，在4℃下以17,000G的离心力进行离心操作10分钟。

其结果是能够在最下层沉淀物(树脂层)和上层含水层之间形成凝胶层，从而可收集到240μl的含水层。该实施例表明，即使是在胶凝剂溶解后全部的固-液混合物发生胶凝化情况下，仍可通过离心处理来进行固-液分离。

实施例6

在用以从福尔马林固定石蜡包埋的组织切片中提取出DNA的试剂的离心操作中，使用利用胶凝剂的沉淀分离法和常规方法，以对这两种方法进行对比。

将DEXPAT(注册商标)完全悬浮，并将500μl的悬浮DEXPAT置于2个容量为1.5ml的小试管中(未添加胶凝剂的样品)。同样的，将SeaKem(注册商标)GTG Agarose加入DEXPAT(注册商标)中至其最终浓度为0.15％，并使其悬浮以制备悬浮液，将500μl的该悬浮液倒入容量为1.5ml的小试管中(添加胶凝剂的样品)。

使用加热器将上述悬浮液在100℃下加热1分钟。将加热后的各悬浮液的一部分分别逐滴加入到固定在载玻片上的石蜡包埋的鼠组织切片中，之后将切片切薄，并分别收集到装有悬浮液的原小试管中。之后将各悬浮液在100℃下加热10分钟。在此加热过程中，需在开始加热5分钟后将各悬浮液小心地反转混合2-3次。加热完成后在4℃下以17,000G的离心力进行离心操作10分钟，在冰上静置5分钟后，收集上清液(含水层)。在此方面，在收集上清液的过程中，需要对没有添加胶凝剂的2个样品中的一个样品多加注意，以防树脂层进入并污染上清液，而故意使另一个样品中的少量树脂层进入并污染上清液。

用1μl或2.5μl的所收集到的各上清液作为模板，以鼠的CCND基因区段作为目标进行PCR。所述PCR是用Ex Taq(TAKARA BIO株式会社)共进行35个循环，每次循环为94℃下加热30秒，54℃下加热60秒，72℃下加热60秒，之后在72℃下孵育5分钟。此处，分别以具有不同扩增链长度(164bp和416bp)的两种引物组合(primer set)进行PCR。用于扩增164bp的引物组合中引物的序列如序列表中SEQ ID NO：1和SEQID NO：2所示，而用于扩增416bp的引物组合中引物的序列分别如序列表中SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。

用无菌水作为模板，以作为PCR反应的阴性对照。用1ng的鼠基因组DNA作为模板，以作为PCR反应的阳性对照。

PCR结束后，将8μl的各反应液进行琼脂糖凝胶电泳。用鼠CCND基因中的164bp区段作为目标序列的PCR的结果如图8所示，而用鼠CCND基因中的416bp区段作为目标序列的PCR的结果如图9所示。最终，当将用添加胶凝剂的样品而收集的上清液作为模板时，可稳定地获得扩增产物(图8和图9中的泳道5和泳道8)。而另一方面，在不添加胶凝剂的样品中，则发现当将特意使少量树脂层污染的样品用作模板时，PCR受到抑制(图8和图9中的泳道4和泳道7)。此外，即使是在用多加注意以避免树脂层的污染而收集到的样品作为模板时，也会出现未发现扩增反应的情况(图8中的泳道6)和出现拖尾状(smear like)的电泳图的情况(图9中的泳道3)。

如上所述，难以通过未使用胶凝剂的常规方法来防止在收集上清液的过程中发生沉淀物的污染，而通过本发明示例性实施方案的方法，则无需特别注意即可防止沉淀物进入并污染上清液。

实施例7

对使用胶凝剂的液-液分离法进行测试。

将9mg的SeaKem(注册商标)GTG Agarose悬浮在3ml的无菌蒸馏水中，之后在100℃下进行加热，直至琼脂糖粉末完全溶解。将750μl的上述溶液倒入容量为1.5ml的小试管中，并将其冷却至4℃，从而形成0.3％的琼脂糖凝胶。接下来，从100μl的如下培养基中收集细胞，该培养基是通过37℃下过夜培养大肠杆菌菌株JM109而获得的。向该细胞中加入200μl的无菌水以使细胞悬浮，并在100℃下加热10分钟以破碎细胞。将其全部体积(200μl)倒入上述容量为1.5ml的小试管中(该小试管中形成了0.3％的琼脂糖凝胶)，加入200μl的苯酚/氯仿/异戊醇(体积比＝25∶24∶1)混合液，并通过手摇以使其充分混合。之后，在室温下以17,000G的离心力进行离心处理10分钟。

最终有机层形成为最下层，在含有变性蛋白层(其为有机层的上层)和为最上层的含水层之间形成了凝胶层。由此能够无需考虑变性蛋白的污染而收集含水层。

虽然参照了具体实施方式详细描述了本发明，但是对本领域技术人员显而易见的是，可在不偏离本发明范围的前提下，对本发明进行各种改变和修改。

在本发明的离心方法的示例性实施方案中，可容易的防止高比重物质进入并污染低比重物质(这为常规离心方法中所存在的问题)。因此，根据本发明的离心方法可广泛地应用于使用离心方法的技术领域中。

序列表

SEQ ID NO：1显示的是用于扩增鼠CCND基因的DNA片段的引物。

SEQ ID NO：2显示的是用于扩增鼠CCND基因的DNA片段的引物。

SEQ ID NO：3显示的是用于扩增鼠CCND基因的DNA片段的引物。

SEQ ID NO：4显示的是用于扩增鼠CCND基因的DNA片段的引物。

Claims

1.一种分离高比重物质和低比重物质的离心方法，其包括：

其中，所述热可逆凝胶或者所述已溶解的胶凝剂形成为使所述低比重物质和所述高比重物质分离的凝胶层。

2.根据权利要求1所述的离心方法，其中，所述离心操作是在温度等于或低于所述胶凝剂的胶凝温度的条件下进行的。

3.根据权利要求1所述的离心方法，其中，所述混合物包含固体和液体。

4.根据权利要求1所述的离心方法，其中，所述混合物通过如下方法得到：

5.根据权利要求1所述的离心方法，其中，所述混合物通过如下方法得到：

(A)获得溶解有所述胶凝剂的溶液；以及

6.根据权利要求3所述的离心方法，其中，所述混合物包含离子交换树脂。

7.根据权利要求6所述的离心方法，其中，所述离子交换树脂为螯合树脂。

8.根据权利要求1所述的离心方法，其中，所述混合物包含水成液和有机液体。

9.根据权利要求8所述的离心方法，其中，所述有机液体为选自苯酚、氯仿和异戊醇所组成的组中的至少一种。

10.根据权利要求8所述的离心方法，其中，所述水成液包含核酸。

11.根据权利要求1所述的离心方法，其中，所述胶凝剂为亲水性胶凝剂。

12.根据权利要求11所述的离心方法，其中，所述亲水性胶凝剂为琼脂糖。

13.根据权利要求1所述的离心方法，其中，所述胶凝剂部分地溶解在所述混合物中。

14.根据权利要求1所述的离心方法，其还包括收集所述低比重物质。

15.一种组合物，包含能够形成热可逆凝胶的亲水性胶凝剂和离子交换树脂。