CN102256628A - 用于mri成像的灵敏的造影剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于MRI成像的造影剂，包含：(a)一个环糊精，其截锥形结构限定了一个中心轴、沿所述轴的第一和第二开口；(b)一个顺磁性元素，其位于所述环糊精轴上、在所述结构外并接近第一开口；(c)所述顺磁性元素的一个或几个配位配体，其与所述顺磁性元素配位；(d)一个共价结合于所述环糊精、接近第二开口的臂，其能够与所述环糊精形成包合络合物。

Description

用于MRI成像的灵敏的造影剂
技术领域
本发明涉及用于MRI成像的造影剂。进一步地，本发明涉及用于MRI成像的生物可活化的造影剂。这些造影剂可以被活化，也就是说，一旦感兴趣的现象发生，它们可以产生预期的MRI信号，并可以显示增强的特异性。它们允许在体内检测生物现象。
背景技术
关于MRI和CA：
由于其出色的分辨率，磁共振成像(MRI)目前在现代诊断研究中被认为是优选的技术。超过35％的临床扫描目前通过施用造影剂(CA)来进行，造影剂可更好地区分病理组织和正常组织。MRI中最常用的造影剂是钆(III)螯合物，其高顺磁性(7个未配对电子)可导致它们所分布的组织中水质子弛豫率的强烈提高。缩短检查时间，增强信号强度，因此改善患者的水分配的成像质量。
与碘造影剂比较，钆的致敏反应是极其罕见的。由于游离的镧系元素耐受性很差，必须由占据大部分可用配位位点的强结合的配体对其配位，留下一个或两个自由的位点给水分子，其弛豫率可通过MRI检测。这种螯合物稳定络合物，使其变得无毒、化学惰性和在活的有机体中稳定。因此，避免了与内源性金属离子(Zn2+、Cu2+、Fe2+、Ca2)的交换。这种示踪剂以其络合物的形式通过尿液排泄(半衰期80-100分钟)。
1988年推出且目前用于临床诊断的第一代造影剂是高度亲水性试剂。这一类的典型例子是Gd-DPTA(DPTA：二亚乙基-三胺-五乙酸；r1＝3.8mM1s-1)。到现在它已用于亿万次的MRI扫描。已经特别证明了具有非特异性细胞外分布的Gd-DTPA在检测血脑屏障和肾清除率异常中的应用。它通常以大约0.1mmol/kg的剂量施用。这意味着，为了提供足够的对比度，Gd-DTPA必须达到大约50-100μM的浓度。在MRI中，具有与用于其他诊断技术(SPECT、PET、光学成像)中的示踪剂相比相对较低的灵敏度。然而，尽管它们具有高灵敏度，这些方法具有差的图像分辨率。
为了弥补这个缺点，需要：(i)开发具有高弛豫度(relaxivity)的系统；(ii)在靶位置累积大量的CA单位，以便能够识别给定疾病的特异的细胞膜标志物。
对于随磁场强度变化的钆络合物弛豫度的测量产生核磁共振分散谱(NMRD)，其已被模拟以提供对τm(水交换率)、τr(再定位相关时间)和τs(电子自旋弛豫时间)的可靠估计。该弛豫增强的主要决定因素为分子再定位所需要的总时间。
通过作用于弛豫度的三个参数，可以提高造影剂的效率：
(i)由于多个水分子的存在，水交换率τm的提高。水合数在决定弛豫度中发挥重要作用；
(ii)再定位相关时间τr的提高；
(iii)电子自旋弛豫时间τs的改变，这是通过引入合适的电子供体取代基，以减少金属中心的正电荷以及改变与Gd(III)络合物表面上存在的极性基团氢键键合的可交换质子的水交换动力学。此外，负性络合物的存在降低对于体内阴离子底物的亲和力。
关于CD的应用：
已经注意到，使用常用于MRI的磁场(0.2-17.6T)，如果顺磁性络合物是大分子系统的一部分，由于超分子加合物的τr的延长，观察到水质子的弛豫率的提高。这种方法已被利用，或通过具有例如蛋白质、树状聚体(dendrimer)和多肽的大分子系统的共价缀合物的合成，或通过合适的官能化的螯合剂和蛋白质(主要是人血清白蛋白)或胶束之间的非共价相互作用。
特别地，当环糊精(CD)用于CA中时，产生的络合物具有大得多的分子量，导致在水中较慢的旋转和对比增强。已经证明CDs可以作为催化剂、药物递送系统、配体、手性分离介质的组分、单层、特别是作为形成包合络合物的主体分子。CD的腔的大小和形状在利用疏水相互作用、氢键和范德华力形成这些包合络合物中发挥重要作用。由于在其溶于极性溶剂如水中时在其腔内结合疏水性分子的能力，CD广泛应用于超分子化学。功能性CD已应用于分子反应器、酶模拟物(催化剂)、分子机器和电极表面改性剂。它们是最有前途且广泛应用于药物络合的寡糖主体。事实上，CD-包封的药物通常具有良好的水溶性、较好的生物利用度、在生理条件下较长的半衰期、不受阻碍的排泄和没有额外的毒性。因此，环糊精似乎是有希望的用于Gd(III)络合物的体内载体化(vehiculation)的载体。例如，下面的包含CD的造影剂，已由Nocera小组在1996年(Mortellaro等人，J.Am.Chem.Soc.1996，118，7414-7415)和Aime小组在2000年(Skinner等人，J.Chem.Soc.，Perkin Trans.2 2000，1329-1338)公开：
Figure BPA00001390355100031
然而，CD-络合物无法穿透细胞膜的亲脂性屏障；它携带药物，提高其在膜表面的浓度。它有利于解离后的药物吸收。
以前的工作已经确定，通过共价键或非共价键相互作用连接的Gd和CD的伴随施用可以提高τr，进而提高水质子弛豫率(r1)。因此，达到比那些报道的通常用于临床实践的系统高出五倍的弛豫度。事实上，据报道具有略高于4kDa的分子量的系统具有大约r1＝25mM-1s-1的弛豫度。
临床上可用的络合物与9个配体配位，聚氨基聚羧酸酯配体提供8个供体，1个水分子占据第九个配位位点。
弛豫度增强通过两种机制发生：(i)减少配位的水分子数，因而减少球体内水(直接与Gd(III)配位)的贡献；(ii)提高第二球体水(氢键键合于羧酸酯(carboxylate)氧原子上的孤对)的弛豫度。已经提出，CD腔的冠上的羟基的高密度可能会导致与络合物表面上的水分子的强相互作用，并延长其在顺磁性中心附近的持续时间。包括配位的水分子的氢键网络得到加强。在另一方面，这种紧密排列似乎导致对观测到的弛豫度的增强的贡献，这是由金属中心的第二配位球体中的水分子引起的。因此，这些超分子络合物会对配位的水分子的交换过程带来有利影响，且它们在MRI的灵敏度方面非常可能提供显著的改善。
关于灵敏的探测剂(smart probe)：
最近文献报道了用于特定靶标的CA，目标是识别特定疾病。Aime最近开发出一种响应于体外组织中的游离硫醇浓度的灵敏的CA(Carrera等人，Dalton Trans.2007)。几种灵敏的CA被描述为用于体内应用。例如，通过使用包含β-吡喃型半乳糖的Gd-络合物将MRI-灭活剂转化为活化的MRI剂来观察酶的活性(Chang等人，Bioconjugate2007)。McIntyre的小组也已基于显著改变试剂药代动力学性质的溶解度由亲水性向疏水性转换的概念检测蛋白酶活性(Lepage等人，Molecular Imaging 2007)。
关于生物靶标：
仍然需要识别和量化与挑战性病理有关的细胞外靶标。观察这些靶标使得可以评估相关功能障碍，而且还可以评估假定的治疗剂在体内的效率。生物靶标可以是显示酶裂解活性的任何细胞外的蛋白质。所述生物靶标可以是膜结合的酶或分泌的酶。事实上，细胞外区室包含多种参与细胞外基质改型、营养成分消化等的酶。对于上述细胞外膜靶标的逐渐增长的兴趣清楚地说明需要有效的方法来通过简单可靠的方法进行成像以评估其体内活性。
总之，需要用于MRI成像的更有效的新的造影剂，特别是提供较高的弛豫率(r1)，其不会有其他基于钆的造影剂的有害的副作用(如引起过敏性反应)。此外，提供能够可视化并且也可能量化体内特定活性的灵敏的造影剂是分子成像领域的真正挑战。
发明内容
经过多年的研究，申请人发现了用于MRI成像的新的造影剂。
本发明的造影剂可以是一种化合物，其包含：
-一个环糊精，其截锥形结构限定了一个中心轴、沿所述轴的第一和第二开口，
-一个顺磁性元素，其位于所述环糊精轴上、在所述结构外并接近第一开口，
-所述顺磁性元素的一个或几个配位配体，其与所述顺磁性元素配位，
-一个式-A的臂，其共价结合于所述环糊精、接近第二开口，
其中，A是能够与环糊精形成包合络合物的碳基团。
在本申请的上下文中，“一个”指“至少一个”。
此外，申请人提出用于MRI成像的新的生物可活化的造影剂。本发明的生物可活化的造影剂可以是一种化合物，其包含：
-一个环糊精，其截锥形结构限定了一个中心轴、沿所述轴的第一和第二开口，
-一个顺磁性元素，其位于所述环糊精轴上、在所述结构外并接近第一开口，
-所述顺磁性元素的一个或几个配位配体，其与顺磁性元素配位，
-一个式-A-X的可移动臂(mobile arm)，其共价结合于环糊精、接近第二开口，
其中，X是可裂解的、生物可代谢的部分，
A是环糊精和X之间的间隔基，其中A是能够与环糊精形成包合络合物的碳基团。
本发明的造影剂能够检测体外和体内的细胞外生物过程，所述细胞外生物过程转化为这些试剂的IRM信号调制。因此，它们提供准确、特异性和可靠的诊断，这将导致患者的治疗和生存率改善。这些造影剂也允许随时间和在治疗后对这些病理过程(如心血管疾病，包括心肌梗死和癌症)进行非侵入性的监测。此外，与现有技术的在组织中积累而没有被生物化学地修饰的造影剂相反，本发明的生物可活化的造影剂使得不仅可以可视化，而且可以量化涉及的生化过程。
具体实施方式
CD的描述：
环糊精(有时称为环状直链淀粉)构成环状低聚糖的家族，由5个或更多的1→4连接的α-D-吡喃葡萄糖苷单位组成。典型的环糊精在环中包含数量为6至8个的葡萄糖单体，产生截锥形形状(参见图1)。这种结构限定了一个中心轴(1)和沿所述轴(1)的两个开口(第一(2)和第二(3)开口)。
优选地，MRI造影剂包含一个选自α-环糊精(六元糖环分子)、β-环糊精(七元糖环分子)和γ-环糊精(八元糖环分子)的环糊精。
更优选地，MRI造影剂包含至少一个β-环糊精。
环糊精可以被官能化，特别是被亲脂性基团官能化，例如，以提高其生物利用度。
在本说明书中，因此术语“环糊精”表示官能化或未官能化的α-、β-或γ-环糊精。
顺磁性元素的描述：
元素的顺磁性特征是由于存在未配对电子。
优选地，MRI造影剂包含至少一个顺磁性元素，该元素选自镧系元素，如钆和镝；过渡金属，如锰、铁、钴和铬；及镁。更优选地，本发明的顺磁性元素是钆。
根据本发明，顺磁性元素沿环糊精的轴定位并且接近第一开口。第一开口优选是环糊精的最小开口。
配位配体的描述：
配位基团的选择影响接近顺磁性中心的水分子的数量和保留时间，因此影响弛豫度。顺磁性元素的一个或几个配位配体与所述顺磁性元素配位，且与环糊精共价结合、接近环糊精的第一开口。
如果存在几个配体，它们可以相同或不同。优选地，它们是相同的。
配位配体可以是单齿、双齿、三齿、四齿或具有五个或多个配位位点。
如果配位配体是单齿配体，它可以对应于式I
其中，R和R’独立地为氢或烷基链，
Z是NR或O，
Y是CO2 -、PO3 2-或SO3 2-。
优选的单齿配体具有下式：-CH2-O-CH2-COO-。优选地，5至7个单齿配体被接枝到环糊精上。
如果配位配体是双齿配体，它可以对应于式II至式VIII中的一种：
Figure BPA00001390355100072
Figure BPA00001390355100081
例如，环糊精可以携带3-5个双齿配体。
如果配位配体是三齿配体，它可以对应于式IX至式XV中的一种：
例如，环糊精可以携带两个三齿配体。
如果配位配体是四齿配体，它可以对应于式XVI至XXIII中的一种：
Figure BPA00001390355100091
在优选的实施方式中，配体是7个单齿配体，优选具有式-CH2-O-CH2-COO-。
在另一优选的实施方式中，配体是4个双齿配体，优选具有式V。
在另一优选的实施方式中，配体是2个三齿配体，优选具有式XI。臂的描述：
本发明的MRI造影剂包含臂A，臂A是碳基团。
优选地，A可以是烷基、芳基、或芳基-烷基，包含优选8至20个碳原子，任选地包含一个或几个杂原子，未取代或被烷基、芳基、羧酸根(carboxylate)、膦酸根(phosphonate)、磺酸根(sulphonate)或其他官能团取代。
本发明的臂有利地包含苯环。
根据第一实施方式中，造影剂包含式XXIV至XXVII之一的臂-A：
Figure BPA00001390355100101
其中，n为1至10。
在一些实施方式中，臂A的末端官能团，例如羧酸基或膦酸基，能够与顺磁性元素配位。
根据本发明的第二实施方式，用于MRI成像的生物可活化的造影剂包含X部分，X部分接枝于作为间隔基发挥作用的A上。间隔基A，其优选是可移动的，可以优选地为亚烷基链、亚芳基链或芳基-亚烷基链，包含优选8至20个碳原子，任选地包含一个或几个杂原子，未取代或被烷基、芳基、羧酸根，膦酸根、磺酸根或其他官能团取代。
X部分是可裂解的、生物可代谢的部分。术语“生物可代谢的”意味着X是生物靶标(例如，胞外酶)的底物。当靶标是肽酶或蛋白酶时，X优选包含肽序列，更优选是被体内的靶酶特异性识别的肽序列。
分子成像的感兴趣的靶标是蛋白酶或肽酶，即特异性裂解显示给定氨基酸序列的蛋白质或肽的肽键的酶。还包括糖苷酶(osidases)，它裂解特定的糖苷(osidic)键(在此情况下，X可以是含糖分子)。还包括酯酶，它裂解酯键或膦酸酯键或酰胺键(水解)(在此情况下，X分别是包含酯、磷酸酯或酰胺的分子)。可以根据本发明靶向的特异性的酶的例子是血管紧张素I转换酶和基质金属蛋白酶(MMP)。
造影剂的应用：
申请人提供了用于MRI成像的良好的造影剂。
本发明还涉及获取图像的方法，包括：a)向组织、细胞或患者施用本发明的造影剂，和b)获取所述细胞、组织或患者的磁共振图像。优选地，可以以包含药学上可接受的载体的组合物形式施用MRI造影剂。根据本发明的实施方式，组合物，优选造影剂本身，可以包括至少一种可以通过MRI检测的药物。由于良好的包合能力和大腔，β-CD可以作为这种药物的载体。此外，这种环糊精的高分子量结构(M＝6kDa)可以提高τr，因而提高水质子弛豫率。
由于其更好的效率，造影剂的用量和选择的配体对顺磁性元素的较强配位减少了患者中毒和过敏反应的风险。
根据本发明的实施方式，MRI造影剂可以用于检测那些由于与特定疾病有关的生化反应而在血液中过量存在的配体。如图2所示，使用这种造影剂，通过诱导该元素配位的变化和水化程度的变化的顺磁性元素的分子间络合，可以检测这些配体。在这种情况下，造影剂发出对应于造影剂的臂与生物靶标结合的第一信号和对应于生物配体的配位的第二信号。
本发明的生物可活化的造影剂也构成用于MRI成像的新的和有效的造影剂。因此，本发明还涉及获取图像的方法，包括：a)向组织、细胞或患者施用本发明的生物可活化的造影剂，和b)获取所述细胞，组织或患者的磁共振图像。优选地，可以以包含药学上可接受的载体的组合物形式施用生物可活化的造影剂。所记录的由造影剂的臂结合生物靶标所触发的信号被表示为“信号1”。
细胞膜靶标上的生化反应优选在生物可代谢的部分裂解臂。在生化裂解后仍然保留的碳基团或间隔基然后可以形成与CD的包合络合物。关于MRI方面，该包合络合物对于连接到顺磁性元素上的水质子的弛豫度的影响是显著的。生化反应导致质量减小，并可能诱导干扰弛豫度因而干扰MRI信号的包合现象。因此，生物可代谢的部分裂解后记录的信号不同于“信号1”，被表示为“信号2”(见图3)。
由本发明的造影剂发射的信号可以通过本领域的技术人员已知的任何方法检测，例如弛豫度、频率或相位变化。
在另一优选的实施方式中，所述可裂解的、生物可代谢的部分包含可以通过除MRI之外的任何其他成像技术例如核成像(断层摄影、PET、SPECT…)、光学检测(荧光光谱技术…)或超声法检测的部分，作为进一步的信号。根据这一实施方式，本发明的MRI造影剂可以因此成为多模式探测剂，它允许在体内多模式检测生物现象。
合成：
本发明的新的MRI造影剂和本发明的生物可活化的造影剂可以通过在CD的每个面上进行两个接枝步骤来制备。合成策略需要已知的和选择性的依次的保护和去保护步骤。在任何情况下，可以在最后一步引入顺磁性元素。
以下合成策略是制备权利要求所述的造影剂的例子。这些合成不是限制性的例子。
本发明的新的造影剂的合成策略可以包括两部分：
(i)具有配体的CD的合成；
(ii)具有(任选可移动的)臂的CD的官能化。
此外，本发明的生物可活化的造影剂的合成可以包括另外两个部分：
(iii)生物可代谢部分的合成；
(iv)生物可代谢部分向官能化CD上的接枝。
部分(i)和(iii)可以独立地开始。
(i)具有配体的CD的合成
通过本领域的技术人员已知的任何合成策略，用一个或几个步骤从市售产品合成配体。
配体可以被接枝到CD上，例如通过生物学稳定的连接体乙醚官能团。经过CD的上下面的选择性保护后，可以设想通过加入碱和配体的前体在去保护的伯醇上进行配体的接枝(Tian等人，J.Org.Chem.2000)。
例如，根据一种方法，式XI的三齿配体可以被接枝到环糊精上，该方法包括：在吡啶的存在下通过加入苄基氯对环糊精进行全苄化(perbenzylation)。然后如Pierce和
Figure BPA00001390355100131
(Angew.Chem.Int.Ed.，2000，39，3610-3612)所述，用DIBAL对位置A和D脱保护。分别地，通过在市售的2-溴甲基-6-甲基吡啶上进行Arbusov反应(Med.Chem.Lett.，2007，17，1466-1470)，然后进行基团溴化来制备配体。然后在强碱的存在下，这些配体被接枝到A和D自由位置。接着将这两个膦酸基脱保护并进行脱苄。在图4中部分说明了这种方法。
式V的双齿配体可以由市售的6-甲基吡啶甲酸经三个步骤合成(见图5)(Ijiun等人，Bioorg.Med.Chem.2006)。可以在酸性介质中通过甲醇酯化前体。甲基的基团溴化将产生相应的6-溴甲基吡啶甲酸甲酯。可以根据图6的合成策略进行接枝。具体来说，如以上参考图4所述，在用DIBAL对位置A至D上的4个伯醇脱保护后，在碱如NaH的存在下，通过添加上述制备的6-溴甲基吡啶甲酸甲酯进行4个双齿配体的接枝。然后对吡啶单位上的苄醇和羧酸官能团脱保护。
通过在如吡啶的溶剂中向其加入碘醋酸钠，单齿配体-CH2-O-CH2-COO-可以接枝到环糊精上。
(ii)具有臂的CD的功能化
存在于C2-、C3-和C6-位置的羟基与试剂竞争，使得选择性改性极为困难。在存在的3种类型的羟基中，那些在C6位置对应于伯醇的羟基是碱性最强的(pKa 15-16)，那些在C2位置的羟基是酸性最强的(pKa12.1)，那些在C3位置的羟基是最难接近的且不易进行进一步修饰。二级侧面由于存在两倍数量的羟基，比一级侧面位阻更大。相比C-6位置，C2和C3位置的羟基之间的氢键使得它们具有刚性和较低的柔性。所有这些因素使得二级侧面比一级侧面反应性更低和更难以选择性地官能化。
最近，已经公开了通过用DMSO中的乙醇钠处理在未保护的β-CD的C2位置进行直接单取代(Masurier等人，Eur.J.Med.Chem.2005，40，615-623，及Masurier等人，Carbohydrate Res.2006，341，935-940)(图7)。通过碱的量控制官能化程度。这种方法可以应用在这种具有可移动臂的部分A的情况中。
通过本领域的技术人员已知的合成策略，使用一个或几个步骤，从市售产品合成可移动臂的部分A。
例如，从市售的1，4-二氢-3(2H)异喹啉酮合成2-溴乙基苄胺(图8)(Ikeda等人，Tetrahedron，1977，33，489-495)。在酸性介质中水解环酰胺后，还原羧酸官能团，并用溴原子取代相应的醇。也可以考虑胺官能团的保护步骤。也可以考虑其他结构(甲胺基的各个位置，芳香取代)以优化包合络合物的形成。这些新官能化的CD的结构可以通过NMR、X射线和质谱分析来证实。
作为一般原则，通过向其加入环氧乙烷(oxiranne)，可以从市售的对二溴苯的衍生物获得臂(Bemstein等人，Med.Chem.，1986，29，2477-2483)，以便获得醇，其然后与氢溴酸反应。
(iii)生物可代谢部分的合成
如上所述，生物可代谢的部分可以为某种酶特异性的任何裂解底物。它可以是蛋白质或肽、糖(ose)或与任何具有酯官能团的其他基团。本领域的技术人员能够根据其希望识别和/或量化的生物靶标，选择特异性的生物可代谢的部分。通过本领域的技术人员已知的合成策略，使用一个或几个步骤，从市售产品合成它。
如果生物可代谢的部分包含可以被除了MRI之外的任何其他成像技术检测的部分，为了提供多模式探测剂，由本领域的技术人员调整合成策略。
(iv)生物可代谢部分向官能化的CD上的接枝
通过任何可用的技术，例如肽连接体，将生物可代谢的部分连接到CD上的可移动臂上。
只是出于说明目的给出下面的实施例，并不是为了限制由附加的权利要求定义的本发明的范围。
实施例
实施例1：具有双齿配体的造影剂的合成
第1步.在500mL的圆底烧瓶中，将10g的β-环糊精(8.81mmol)溶解于100mL蒸馏过的吡啶中。在搅拌下和惰性气氛中，在圆底烧瓶中加入预先溶于100mL蒸馏过的吡啶中的10.3g的TBDMSCl(氯化叔丁基(tertiobutyl)-二甲基甲硅烷)(68.4mmol)。在3小时中将反应混合物的温度降低到0℃。然后，将反应混合物放置在室温下24小时。然后通过加水沉淀产物。通过硅胶色谱纯化获得的粉末，其中，洗脱液是氯仿/甲醇/水的混合物(40/10/1；v/v/v)。
这一步的反应收率为58％。
第2步.在500mL圆底烧瓶中，在搅拌下和惰性气氛中，将2g的第1步的产物溶于50mL的蒸馏过的吡啶中。加入20mL的苯甲酰氯。将反应混合物在100℃加热48小时。减少该混合物一半，然后放置在冰浴中。滴加60mL的甲醇。然后蒸发混合物以获得浆液，其中加入105mL的甲醇和30mL的水。过滤并干燥获得的沉淀。通过硅胶色谱纯化获得的粉末，其中洗脱液是环己烷/丙酮混合物(3/2；v/v)。
这一步的反应收率为57％。
第3步.在100mL圆底烧瓶中，将2g的第2步的产物溶于30mL的二氯甲烷中。加入2mL的蒸馏过的三氟化硼(15.8mmol)。然后在室温下搅拌反应混合物72小时。然后用30mL二氯甲烷稀释反应混合物，再将其倒入100mL的水/冰混合物(1/1；v/m)。用25mL的NaHCO3溶液洗涤有机相，然后用25mL的水洗涤，并用MgSO4干燥。过滤后，除去溶剂。
这一步的反应收率为78％。
第4步.将1g的2-氰基-6-甲基吡啶(8.75mmol)引入20mL的圆底烧瓶中。加入10mL的6M的盐酸。回流反应混合物24小时。加入130mL乙腈。过滤沉淀，并蒸发溶剂。
该步骤的反应收率为94％。
第5步.在双颈圆底烧瓶中，将2g的第4步的产物溶于10mL的甲醇中。从滴液漏斗向烧瓶滴加3mL的96％硫酸。回流反应混合物24小时，然后在室温下冷却，将其倒入30mL的冰水中，并用Na2CO3溶液中和。用几份二氯甲烷萃取该产物。然后蒸发溶剂。
该步骤的反应收率为74％。
第6步.将1.1g的第5步的产物(7.28mmol)引入250mL的圆底烧瓶中。加入1.3g的NBS(N-溴代琥珀酰亚胺，7.3mmol)、80mL的CCl4和少量过氧化苯甲酰。回流反应混合物24小时。过滤获得的固体，并抽出。蒸发溶剂。通过硅胶色谱纯化获得的产物(洗脱液：二氯甲烷)。
该步骤的反应收率为32％。
第7步.可以在回流的两种溶剂(吡啶和2，6-二甲基吡啶)的混合物中将第3步的产物和第6步的产物偶合。通过加入三氯化钆六水合物，获得式XXVIII的造影剂。
Figure BPA00001390355100161
基于获得的式XXVIII的造影剂，实施一般合成的部分(ii)来产生本发明的造影剂。
实施例2：具有单齿配体的造影剂的合成
合成携带醋酸配体的β-环糊精。由此获得的官能化的环糊精用携带生物可代谢的基团的间隔基接枝，然后与三氯化钆六水合物络合，以产生本发明的造影剂。
第1步：2，3-二甲基-β-环糊精1b的合成
在500mL的圆底烧瓶中，将10g的β-环糊精(8.81mmol)溶解于100mL蒸馏过的吡啶中。在搅拌下和惰性气氛中，在圆底烧瓶中加入预先溶于100mL蒸馏过的吡啶中的10.3g的TBDMSCl(氯化叔丁基-二甲基甲硅烷)(68.4mmol)。在3小时中将反应混合物的温度降低到0℃。然后，将反应混合物放置在室温下24小时。然后通过加水沉淀产物。通过硅胶色谱纯化获得的粉末，其中，洗脱液是氯仿/甲醇/水的混合物(40/10/1；v/v/v)。这一步的反应收率分别为58％。
将由此获得的6-全甲硅烷基化的-β-环糊精(0.01mol，20g)溶于干THF(200mL)，然后加入NaH(0.26mol，10.4g，分散于油中，60％)。分小份加入碘甲烷(0.57mol，28.5mL)持续1小时。经过17小时后，通过加入甲醇(50mL)中和过量的氢化钠。在压力下蒸发去除溶剂。将残留物悬浮于环己烷(300mL)中。过滤固体，减压蒸发溶剂。将固体(0.589mmol，2g)溶于甲醇(15mL)，并加入氟化铵(14mmol，0.046g)。回流该溶液5小时。通过TCL(CHCl3/MeOH/H2O 40∶10∶1)监测反应。通过蒸发除去甲醇。将粗产物溶于CH2Cl2(60mL)，并将其倒入水(200mL)中。分离有机层，通过MgSO4干燥，并在一定压力下蒸发除去。该产物经硅胶柱色谱纯化，用CH2Cl2然后用CHCl3/MeOH/H2O(40∶10∶1)洗脱。获得白色粉末1b(77.8％)。相应的化合物在图9中显示，其中R1＝CH3且n＝3-7。
第2步：配体的接枝
第2a步：7-(6-O-醋酸根)-β-环糊精(7-(6-O-acetate)-β-cyclodextrin)2a的合成
用无水DMF(100mL)稀释干燥的β-环糊精1a(2.2mmol，2.5g)，并彻底脱气。通过注射器加入无水吡啶(30mmol，2.3g，2.35mL)，接着加入碘醋酸钠(17mmol，3.53g)。在90℃下搅拌混合物72小时。在压力下蒸发溶剂，并用丙酮(250mL)洗涤粘性褐色固体。用玻璃介质(glass frit)过滤不溶性固体。收集黄棕色固体，并经硅胶用CH2Cl2/MeOH(1/1)混合物作为洗脱液过滤。在压力下蒸发后获得2a。第2b步：7-(6-O-醋酸根)-2，3-二甲基-β-环糊精2b的合成：
用无水DMF(7mL)稀释干燥的2，3-二甲基-β-环糊精1b(0.0751mmol，100mg)，并彻底脱气。通过注射器加入无水吡啶(1.02mmol，0.084ml)，接着加入碘醋酸钠(2.63mmol，550mg)。在90℃下搅拌混合物72小时。在压力下蒸发溶剂，并用丙酮(250mL)洗涤粘性褐色固体。用玻璃介质过滤不溶性固体。在压力下蒸发过滤物，并经硅胶用CH2Cl2/MeOH(1/1)混合物作为洗脱液过滤。在压力下蒸发后获得2b。
第3步：间隔基的合成
这一步如图10所说明。
在氩气气氛下，在-78℃下，向搅拌的对二溴苯(4.2mmol，1g)于THF(20mL)的溶液中加入正丁基锂(9.3mmol，6.2mL，于己烷中为1.5M)。在-78℃下，搅拌反应混合物30分钟。在-78℃下，加入环氧乙烷(12.7mmol，0.56g)和BF3.Et2O(12.7mmol，1.8g)，并在同一温度下搅拌5小时。用稀释的H2SO4终止后，用Et2O(50mL×3)萃取反应混合物，经无水MgSO4干燥合并的有机相。真空下除去溶剂，粗产物通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/环己烷1∶10v/v)纯化。以49％的产率获得二醇。
将1.7g的二醇于25mL的48％氢溴酸中的悬浮液回流并搅拌15小时。用二氯甲烷萃取混合物，干燥提取物，过滤，并真空浓缩以产生棕色固体。从环己烷的重结晶(Recristallization)产生2.7g(88％)的对二(溴乙基)苯作为淡黄色针晶。
向干甲苯中的对二(溴乙基)苯(40mmol，7g)中缓慢加入亚磷酸三乙酯(Triethylphosphite)(13mmol，3.5mL)。在氮气中回流下搅拌该混合物42小时。真空下除去甲苯，然后加入甲醇(40mL)。收集沉淀，并用甲醇(10mL)洗涤。蒸发滤液，通过真空蒸馏纯化产生的油(4.2g)。获得的产物为无色液体(3.15g，91％)。
第4步：在环糊精上接枝间隔基
如图11所示，按照下列程序，将间隔基或臂接枝到环糊精2a上。它同样可以被接枝到环糊精2b上。
在120℃减压下，2a(0.88mmol，1g)经干燥48小时，并溶于40mL的干DMSO中。在氮气下，向2a加入5mL的EtONa溶液(200mg的Na于50mL的乙醇中)，并搅拌14小时。向反应介质滴加于5mL溶剂中的亲电试剂(0.88mmol，0.307g)。搅拌该混合物9小时。加入丙酮(500mL)，以沉淀粗产物3a。过滤后，通过硅胶色谱(12∶7∶4，EtOAc-异丙醇-水v/v/v)纯化固体残留物。
第5步：钆的络合
a)方法A
将干燥的化合物3a溶于超纯水，并加入氯化钆六水合物。搅拌该溶液，使用碳酸氢钠水溶液(1mol.L-1)调节pH值至8-9。离心该溶液，过滤钆残留物。
b)方法B
将干燥的化合物3a溶于超纯水/NaCl 0.9％w/v，并加入氯化钆六水合物。搅拌该溶液，使用氢氧化钠水溶液(1mol.L-1)调节pH值至6.9-7.4。
c)方法C
将干燥的化合物3a溶于超纯水。使用NaOH水溶液(1mol.L-1)调节溶液的pH值至6.5。将三氯化钆六水合物溶于水，也使用NaOH水溶液(1mol.L-1)调节pH值至6.5。向环糊精溶液加入Gd(III)溶液，并用NaOH水溶液(1mol.L-1)稳定pH在5.5至6.0。室温下搅拌混合物溶液，并调节pH至8.0。
实施例3：本发明的造影剂的应用
如上文实施例1和2所述合成的造影剂可以包括在意图向受试者施用的组合物中。一旦靶向的特定酶切断生物可代谢基团和臂的间隔基之间的键，那么由于间隔基被包合在环糊精内，由灵敏探测剂发出信号。此信号可以与在这些酶作用前发出的信号进行比较，以提供酶活性的量化。

Claims (13)

1.一种用于MRI成像的造影剂，包含：
-一个环糊精，其截锥形结构限定了一个中心轴、沿所述轴的第一和第二开口，
-一个顺磁性元素，其位于所述环糊精轴上、在所述结构外并接近第一开口，
-所述顺磁性元素的一个或几个配位配体，其与所述顺磁性元素配位，
-一个式-A的臂，它共价结合于所述环糊精、接近第二开口，
其中，A是能够与所述环糊精形成包合络合物的碳基团。
2.一种用于MRI成像的生物可活化的造影剂，包含：
-一个环糊精，其截锥形结构限定了一个中心轴、沿所述轴的第一和第二开口，
-一个顺磁性元素，其位于所述环糊精轴上、在所述结构外并接近第一开口，
-所述顺磁性元素的一个或几个配位配体，其与所述顺磁性元素配位，
-一个式-A-X的可移动臂，它共价结合于所述环糊精、接近第二开口，
其中，X是可裂解的、生物可代谢的部分，
A是环糊精和X之间的间隔基，其中A是能够与所述环糊精形成包合络合物的碳基团。
3.根据权利要求1或2的MRI造影剂，其中，所述环糊精选自α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精。
4.根据权利要求3的MRI造影剂，其中，所述环糊精是β-环糊精。
5.根据权利要求1至4的任一项的MRI造影剂，其中，所述顺磁性元素选自镧系元素，如钆和镝；过渡金属，如锰、铁、钴和铬；及镁。
6.根据权利要求5的MRI造影剂，其中，所述顺磁性元素是钆。
7.根据权利要求1至6的任一项的MRI造影剂，其中，所述第一开口是环糊精的最小开口。
8.根据权利要求1至7的任一项的MRI造影剂，其中，所述配位配体对应于式V：
Figure FPA00001390355000021
9.根据权利要求1至7的任一项的MRI造影剂，其中，所述配位配体对应于式XI：
Figure FPA00001390355000022
10.根据权利要求1至7的任一项的MRI造影剂，其中，所述配位配体对应于式I：
Figure FPA00001390355000023
其中，R和R’独立地为氢或烷基链，
Z是NR或O，
Y是CO2 -、PO3 2-或SO3 2-。
11.根据权利要求2的MRI造影剂，其中，所述可裂解的、生物可代谢的部分X包含肽序列。
12.一种获取图像的方法，包括：
a)向组织、细胞或患者施用权利要求1至11的任一项的造影剂，和
b)获取所述细胞、组织或患者的磁共振图像。
13.根据权利要求12的方法，包括施用包含所述造影剂和药学上可接受的载体的组合物。
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