CN102253167B - 一种基于水解过程的水溶性多糖分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种多糖分析方法，其主要特征是根据建立的葡萄糖传感器、还原性末端总数传感器、半乳糖传感器、木糖传感器等适合多糖水解过程中水解组分快速测定的传感器，记录标准水解条件下水溶性多糖水解过程中以上参数的变化曲线，形成该多糖标准的水解图谱。依据建设的各种多糖在标准条件下的水解谱图和相应的比对分析软件实现不同多糖的快速鉴别及定量分析。

Description

一种基于水解过程的水溶性多糖分析方法

技术领域：

本发明涉及生化分析领域，是一种基于多糖水解过程的水解图谱技术的实现多糖快速鉴别与定量分析的方法。

背景技术：

糖类是生物体内除蛋白质和核酸以外的又一类重要的物质，其蕴涵十分丰富的生物学信息，是细胞识别和信息遗传等重要生物学功能的参与者。1988英国学者Rademacher首次提出“糖生物学”学科(Glycobiology)概念，目前糖生物学已成为生命科学研究的前沿和热点。

多糖尤其水溶性多糖，在保健与医疗方面独特的生理活性和功能，推动了该领域的快速进展。随着科学仪器的飞速发展，有关多糖结构与功能关系方面研究备受关注。在研究领域，目前对多糖结构功能研究常用的大型仪器分析手段有：气质联用、紫外及红外光谱分析、核磁共振、高效液相、X射线晶体扫描、原子力显微技术等。大型仪器分析手段使多糖结构与功能研究取得飞速发展。但由于多糖结构特点的复杂性，单一仪器分析手段又具有一定局限性。气相色谱法测定糖类所遇到的主要困难是糖类本身没有足够的挥发性，必须将其转化为挥发性衍生物才能进行测定。高效液相色谱法(HPLC)由于使用通用的示差折光检测器灵敏度低而受到限制；若使用紫外或荧光检测器来提高分析灵敏度，糖类化合物须先经过标记衍生，操作繁杂；并且衍生反应的发生总伴随样品的损失，这对目前越来越高的分析要求不利。传统的电泳法及80年代后期迅速发展起来的高效毛细管电泳法能进行糖的分离检测，但重复性相对较差，该技术的稳定性能达不到实际要求。核磁共振(NMR)技术解决了糖苷键构型问题，但难以分辨非异头质子的位移，解析方法十分繁杂。弄清楚一个多糖的结构往往需要数种大型仪器与化学分析方法结合，同时花费专业研究人员几个月甚至整年的时间与精力。以上这些试验方法由于测试周期长，根本无法在生产过程中使用。生产领域多糖分析常常采用水解后测还原糖法、苯酚-硫酸比色和蒽酮-硫酸比色等方法，多糖含量仅代表氧化后糖残基的数量，这实际是一种粗略的方法，无法对多糖特点进行表征。目前有关多糖分析的专利“用于多糖的定性与定量方法”(中国200910031276.5)描述的是基于水解后的终产物特点进行多糖的表征分析的。本发明是基于传感器技术记录的多糖水解过程中变化图谱结合软件分析进行多糖的鉴别与分析。本发明依靠传感器技术(包括生物传感技术和光度传感技术)获得水溶性多糖水解过程信息，根据过程变化特点来推演多糖的特征，目前国内外未见相关报道。

发明内容：

基于水解过程的水溶性多糖分析方法其主要特征在于：建立适合多糖水解过程中水解组分快速测定的的传感器，主要有葡萄糖传感器、还原性末端总数传感器、半乳糖传感器、木糖传感器等；依据以上传感器记录水溶性多糖水解过程中以上参数的变化状况，绘制该多糖在该特定条件下的水解图谱；根据水解谱图的不同实现不同多糖的快速鉴别；将各种多糖的在标准条件下的水解图谱收录到数据库中，根据开发的比对软件实现多糖特征的快速比对分析、鉴别及定量分析。本发明具体内容如下：

1)多糖标准化水解。多糖水解方式主要为酸水解、酶水解及酸酶结合方式。水解谱图是通过传感器记录的水解过程信息。标准水解模式是多糖水解浓度固定及水解条件精准控制下进行的，保证了在同样条件下可图谱可重复性。

2)适合酶水解过程的葡萄糖传感器、还原性末端传感器、半乳糖传感器、木糖传感器是获取水解过程数据的关键。其中葡萄糖传感器、半乳糖传感器、木糖传感器等属于固定化酶传感器；还原性末端总数传感器属于光度传感器。专利权单位多年从事生物传感器研究与开发，有系列专利，传感器的稳定性和准确度保障了水解数据的可靠性。

3)水解过程图谱的获得及多糖水解图谱库建立。特定水解条件下水解过程的多参数变化曲线形成的图谱作为多糖鉴别分析与定量的主要依据。

4)基于水解图谱比对分析软件。比对分析软件是基于单参数特征及多参数相互关联的特征来进行软件设计。

5)辅助仪器解析。对于图谱相近的情况难以实现特征鉴别的可以同时进行仪器分析。仪器分析主要有气质联用、紫外及红外光谱分析、核磁共振、高效液相、X射线晶体扫描、原子力显微技术等手段。

本发明具有以下特点：

1、本发明的分析方法以多糖水解过程的多参数变化图谱为基础的。

2、本发明的标准化水解条件为精密控制的酸水解和酶水解条件。

3、本发明的多糖水解图谱是依据我方自主研制的适合水解过程的葡萄糖、半乳糖、木糖固定化酶传感器及还原性末端数光度传感器获得。

附图说明：

图1树舌多糖水解过程中葡萄糖、还原糖末端数双参数水解图谱；

图2平行测定树舌多糖水解过程中葡萄糖、还原糖末端数双参数水解图谱；

图3灵芝多糖水解过程中葡萄糖、还原糖末端数双参数水解图谱；

图4虫草胞外多糖水解过程中葡萄糖、还原糖末端数双参数水解图谱。

具体实施方式：

实施例

1)树舌、灵芝、虫草胞外多糖的提取

分别取培养了7天的树舌、灵芝、虫草发酵液，5000rpm，离心10min，并用4层纱布过滤，分离菌丝体。菌丝体洗涤两次，每次用磁力搅拌器搅拌2h，离心，并用4层纱布过滤，合并上清液。将上消夜倒入1.5倍体积的无水乙醇中，静置。树舌多糖和灵芝多糖成胶团状析出，因此可以用玻璃棒直接挑出，而虫草多糖沉淀后，倒出上清液，沉淀用10000rpm，离心10min，弃上消液。将多糖置于60℃烘箱中烘干，即得粗多糖样品。

2)多糖的水解

精密称取0.1000g样品，于试管中，加入10.0mL蒸馏水充分溶解，再加入10.0mL 0.08mol/LH₂SO₄，混匀，沸水浴5h。前半个小时每隔5min，以后每隔10min取0.50mL的水解液，将水解液迅速冷却并加入0.50mL0.08mol/L的NaOH，调整pH至7，终止水解反应，5h后即得一系列不同多糖水解过程的多糖水解图谱。

3)多糖水解过程的信息获得

应用生物传感分析仪SBA-40D型(山东省科学院生物研究所研制)、全自动还原糖测定仪SGD-IV型(山东省科学院生物研究所研制)实时记录水解过程的变化量，形成水解图谱。

4)水解图谱的比对分析

分析树舌多糖、灵芝多糖、虫草多糖的水解过程可知，前期水解液中还原糖、葡萄糖的含量迅速增加，而后期趋于平缓；在精密控制水解条件下，由图1、图2知同一种多糖的水解图谱是稳定可以重复的；比较树舌多糖、灵芝多糖、虫草胞内多糖、虫草胞外多糖的水解图谱之间区别非常明显。每一种多糖的水解图谱特征明显，同种多糖水解过程葡萄糖、还原糖测定数值稳定，从多糖水解过程中葡萄糖、还原糖末端数的双参数水解图谱可以实现不同来源的多糖的鉴别与分析。

Claims (7)

1.基于水解过程的水溶性多糖分析方法，其特征在于：建立适合多糖水解过程中水解组分快速测定的传感器，包括葡萄糖传感器、还原性末端总数传感器、半乳糖传感器、木糖传感器；依据以上传感器记录水溶性多糖水解过程中葡萄糖、还原性末端总数、半乳糖、木糖浓度参数的变化状况，绘制待测多糖在特定水解条件下的水解图谱；根据水解图谱的不同实现不同多糖的快速鉴别；将各种已知多糖的在标准水解条件下的水解图谱收录到数据库中，根据开发的比对分析软件实现多糖特征的快速比对分析、鉴别及定量分析。

2.基于权利要求1所述的多糖分析方法，其特征在于：该分析方法是建立在待测多糖水解图谱基础上的，根据特定水解条件下水解过程的多参数变化曲线形成的图谱作为多糖鉴别分析与定量的主要依据。

3.基于权利要求1所述的多糖分析方法，其特征在于：多糖水解图谱是通过传感器记录的水解过程信息，传感器包括葡萄糖传感器、还原性末端总数传感器、半乳糖传感器、木糖传感器；其中葡萄糖传感器、半乳糖传感器、木糖传感器属于固定化酶传感器；还原性末端总数传感器属于光度传感器。

4.基于权利要求1所述的多糖分析方法，其特征在于：多糖水解方式为酸水解或者酶水解两种方式中的一种。

5.基于权利要求1所述的多糖分析方法，其特征在于：标准水解条件采用酶解或酸解的水解方式，其中多糖水解浓度、温度、酸碱度水解条件有系统规定前提下，并在精密水解装置精准控制下进行的。

6.基于权利要求1所述的多糖分析方法，其特征在于：待测多糖在标准水解条件下的水解图谱是可重现的。

7.基于权利要求1所述的多糖分析方法，其特征在于：比对分析软件是基于单参数特征及多参数同一水解过程相互关联的特征来进行软件设计的。

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