CN102250873A

CN102250873A - 提高突变频率和突变谱的植物诱变育种方法

Info

Publication number: CN102250873A
Application number: CN 201110174614
Authority: CN
Inventors: 石春鸿
Original assignee: BEIJING QINGSHEN GARDEN ENGINEERING CO LTD
Current assignee: BEIJING QINGSHEN GARDEN ENGINEERING CO LTD
Priority date: 2011-06-24
Filing date: 2011-06-24
Publication date: 2011-11-23
Anticipated expiration: 2031-06-24
Also published as: CN102250873B

Abstract

本发明“提高突变频率和突变谱的植物诱变育种方法”，属于植物诱变育种领域。其步骤如下：(1)诱变：对胚性细胞进行诱变处理，然后继代扩大培养，(2)诱导类减数分裂：对诱变处理、继代扩大培养得到细胞进行类减数分裂诱导，(3)自然加倍获得突变纯合体细胞，结合育种目标与突变性状筛选突变纯合体。可在较短时间内离体筛选大量材料，获得单细胞起源的纯合抗逆突变体，明显缩短了育种周期，使选择效率大大提高。

Description

提高突变频率和突变谱的植物诱变育种方法

技术领域

本发明涉及诱变育种技术，特别是一种提高突变频率和突变谱的植物诱变育种方法。

背景技术

用辐射诱变技术进行新品种选育，已有许多报道，这种方法育种虽有不少成功的先例，但方法费工费时，育种效率较低，特别是对于无性繁殖植物的诱变育种，由于隐性突变难以显现出来，因此获得目标突变个体的概率非常低。

无性繁殖植物诱变育种的特点：就一般而言，基因发生显性突变，当代就会表现出来，形成嵌合体。但γ射线诱发的基因突变一般隐性突变居多，显性突变仅为少量，用γ射线辐射诱变处理种子繁殖植物时，筛选隐性突变必须经过自交，使隐性突变在其后代中按一定比例达到纯合，在形成纯合系之后，突变性状才能显现，因此其突变性状也只能在M2代才能进行筛选。然而对于无性繁殖植物(如甘薯的营养器官或外植体)长成植株后，其无性第一代大量隐性突变不能显现，无性系第二代不经过雌雄配子结合，隐性突变的位点因不能纯合，故突变形状也不能表现出来。这是因为隐性突变基因被显性基因所掩盖。加之一般诱发的总突变率本来就很低(只有千分之几)，因此，对于无性繁殖植物的诱变育种效率往往难以提高。

诱发体细胞的类减数分裂现象，最早是由Huskings等(1 Huskings C L.Segregation andreduction in somatic tissues：1 Initial observation on Alliumcepa.The journal of Hereditty.1948，39：311-325)报道的，他们利用核酸的钠盐对洋葱的根进行处理并发现洋葱根尖细胞存在染色体减数现象，洋葱染色体数为2n＝16，分裂中的细胞染色体发生8∶8分离的情况(约占2％)，Mehra等(Mehra PN，Dhiman N.Induced meiotic reductionin root tips：1 Effect of purinederivatives.Cytologia 1986，51：439-448)用咖啡因处理

Pterotheca(同义词Crepis为还阳参属植物)的根尖细胞发现可诱导体细胞染色体减数发生，Ronchi等(R 0 nchi VN，GiorgctyL，TonclliM，MartiniG，1992 Plani Ccll，Tissue and organCulturc，R onchi VN，GiorgctyL，TonclliM，Marti几iG，I，92Plant Ccll，Tissue and organCulture，30：15～19)对胡萝卜胚性细胞系用细胞光度仪分析发现，在单个细胞中DNA含量总是存在着消减现象，表明胚性细胞系中总存在一定数量的单倍体细胞；通过细胞学显微观察发现，在细胞分裂相中，总有一定比例的细胞染色体为半数，因此，Ronchi等提出一个崭新的观点认为，体细胞类减数分裂可能为体细胞胚胎发生前基因组重组所必须，可能是体细胞胚胎发生的前提。(张丽华、陈一华、陈正华等，核酸类似物诱导蚕豆高频率类减数分裂，农业生物技术学报Joumal of Agricultural Biotechnology 2000，8(2)：147-150；陈一华、陈正华，植物离体培养细胞的类减数分裂，遗传HEREDITAS(Bci]ing)18(6)：32～361996。)用咖啡因等核酸类似物对蚕豆种子根尖进行处理，建立了高频率类减数分裂发生体系，观察了种子根尖体细胞类减数分裂的方式与类型，认为体细胞类减数分裂可以为人工所诱导。但众多学者虽都研究了这一现象，至今并见将体细胞类减数分裂诱导及其胚胎发生的体系用于培育新品种得报道。

体细胞类减数分裂的机理及其诱导：采用体细胞类减数分裂的诱导技术就可能使无性繁殖植物诱发产生的隐性突变能够在再生的无性后代中显现出来。体细胞类减数分裂多在离体培养下诱导发生，它属于体细胞无性系变异的一种类型。所谓体细胞无性系变异(somaclonalvariation)是指在离体培养中培养的外植体在脱分化增殖和再生过程中产生的可遗传的变异，已用这种方法进行了多种作物的新品种选育，如水稻、小麦、玉米、菊花、草莓等植物，都已有育种成功的报道。对其机理的研究，多数学者认为是由激素，特别是2，4-D等激素引起基因或染色体突变的结果。而且也有报道表明，有些单一性状的变异在有性繁殖后代中不会再发生分离，如凌定厚等在水稻体细胞无性系变异中，发现多种性状都产生了纯合遗传现象，在有性繁殖后代中没有发生分离，但他们并未揭示纯合遗传发生的机理，也并未将这种现象与细胞染色体类减数分裂联系起来。众所周知，减数分裂是高等植物在有性生殖过程中产生配子时发生的基本生物学现象，与雌雄配子发生过程相关联。但有报道表明，在离体诱导细胞脱分化以及体细胞胚胎发生的系统中，也存在着一定数量与配子形成类似的减数分裂现象(因这一过程不太规则，故称为“类减数分裂现象”)。

甘薯是一种高产、稳产、营养丰富、用途广泛的农作物，既是重要的粮食作物，又是良好的饲料作物，也是工业原料作物，又可作为观赏植物。近年来，甘薯作为天然绿色食品其独特的保健功能逐渐被人们认识，在许多发达国家，都将甘薯作为保健食品。随着甘薯用途的多样化，不同类型、不同用途甘薯新品种选育取得了明显进展，如高淀粉(工业用)甘薯品种、紫肉(高花青素)甘薯品种、桔红肉(高胡萝卜素)甘薯品种、高蛋白(饲用)甘薯品种、水果用甘薯品种、菜用甘薯新品种、观赏品种(金叶薯)选育都取得了明显进展。因此，甘薯的栽培面积日益扩大，种植区域也不断向北方延伸，在寒冷的北方筛选出抗逆性(抗寒、抗盐碱性强的)高产优质甘薯品种，显得十分重要；同时，对北方地区农村种植结构的调整尤为重要。如何通过诱变育种方法提高甘薯突变频率并获得更多的突变个体，从中筛选出具有目标抗性品质的新品种，目前也未见到报道。

发明内容

本发明根据无性繁殖植物的诱变育种过程中存在的问题，提供一种提高突变频率和突变谱的植物诱变育种方法，可在较短时间内离体筛选大量材料，获得单细胞起源的纯合抗逆突变体，明显缩短了育种周期，使选择效率大大提高。

提高突变频率和突变谱的植物诱变育种方法，其步骤如下：

(1)诱变：对胚性细胞进行诱变处理，然后继代扩大培养；

(2)诱导类减数分裂：对诱变处理、继代扩大培养得到细胞进行类减数分裂诱导；

(3)自然加倍获得突变纯合体细胞，结合育种目标与突变性状筛选突变纯合体。

步骤(2)诱导类减数分裂，指采用含40～60mmol/L嘌呤类核苷或尿嘧啶核苷的MS液体培养基浸泡诱变处理后的胚性细胞2小时、恢复20～40小时，继代扩大培养得到类减数分裂细胞。

步骤(1)诱变，指采用钴60-γ射线辐照处理胚性细胞，辐射剂量为出现愈伤组织细胞生长受抑制的剂量。

所述辐射剂量为20～30Gy，剂量率为每分钟10Gy/分钟。

所述植物指甘薯。

所述胚性细胞的制备包括植物材料脱分化，然后继代扩大培养；所述脱分化培养基为：MS+2，4-D 0.5-2mg/L+6-BA 0.5-2mg/L+1AA 0.5-2mg/L+NOA0.5-2mg/L、蔗糖3％。

所述继代扩大培养采用的培养基为：MS+2，4-D 0.05-0.2mg/L+6-BA 0.5-1mg/L+KT0.5-1mg/L+NOA0.5-1mg/L+IAA0.5-1mg/L+TDZ0.5mg/L。

所述脱分化培养基为：2，4-D0.5mg/L+6-BA 0.5mg/L+1AA 0.5mg/L+NOA 0.5mg/L，蔗糖3％。

步骤(2)中，选择经诱变处理、继代扩大培养后且处于旺盛分裂期的细胞进行类减数分裂诱导。

所述筛选突变纯合体指对突变纯合体施加低温，高温和/或高盐碱逆境选择压，然后筛选出逆境条件下能够存活下来的个体。

本发明将人们发现的体细胞离体培养繁殖过程中的类减数分裂现象结合人工辐射诱变技术，应用到诱变育种技术中，显著提高了无性繁殖材料育种过程中，对隐形突变个体的获得率。此前，没有见到这种提高突变育种效率和突变个体获得率的育种方法。

本发明的育种方法的完整技术路线主要包括：(1)制备胚性细胞-(2)诱变-(3)诱导类减数分裂-(4)筛选突变纯合体，四个环节，对于提高突变频率和突变个体的获得率，对胚性细胞进行诱变和诱导类减数分裂两步是必不可少的环节。

该技术路线可适于多种植物的诱变育种，只是针对不同植物的诱变育种时，本领域技术人员根据其掌握的常识结合本发明的描述，可以调整制备胚性细胞，诱变，诱导类减数分裂所采用的具体方式，试剂和参数，然而都可以实现本发明的目的--提高诱变育种中的突变个体的获得率，缩短育种周期。

本发明中优选采用嘌呤类核苷和/或尿嘧啶作为类减数分裂诱导剂。通过实验发现，诱导剂处理浓度，处理时间和恢复时间均影响诱导率。本发明的试验发现，采用40～60mmol/L的嘌呤类核苷或尿嘧啶对诱变处理后的细胞进行处理2～3小时、恢复20～40小时的有丝分裂和类减数分裂诱导率最高，分析原因可能是，获得高频率的处于旺盛分裂期的细胞是获得高频率的类减数分裂的前提。

本发明的诱变育种方法中，优选采用钴60-γ射线辐照处理胚性细胞，辐射剂量为出现愈伤组织细胞生长受抑制的剂量，这样的剂量能够获得最多的突变，选择的机率多，有可能选到所期望的突变苗。对于不同的植物，可能选择不同的

对于本发明的优选实施例中，统计试验发现所述60-γ射线的辐射剂量为20～30Gy能够获得较多的突变又不至于抑制细胞的生长。

为了获得较好的诱变效果，必须诱导体细胞脱分化，建立胚性细胞团大量发生，本领域技术人员可根据现有技术制备获得大量的胚性细胞。本发明的甘薯诱变育种中，提供了一种诱导效果非常好的新的脱分化培养基配方：MS+2，4-D 0.5-2mg/L+6-BA 0.5-2mg/L+1AA0.5-2mg/L+NOA0.5-2mg/L、蔗糖3％的诱导培养基上15-20天。能够获得高达68％的胚性细胞。

还提供了胚性细胞和诱变处理后的细胞均适用的继代培养的培养基配方：MS+2，4-D0.05-0.2mg/L+6-BA 0.5-1mg/L+KT 0.5-1mg/L+NOA0.5-1mg/L+IAA0.5-1mg/L+TDZ0.5mg/L蔗糖3％的培养基，进行继代培养15-20天，

在本发明所建立的体细胞类减数分裂诱导体系中，注意到材料状态、诱导剂的浓度、材料处理的时间、和被处理材料的恢复时间4个因素都会影响到类减数分裂效率，只有在这4个因素相互之间调整到最佳状态时，才能获得高频率的处于旺盛分类期的有丝分裂细胞及类减数分裂频率才能达到较高水平，在本发明中获得的类减数分裂频率可达50％左右(观察到的减数分裂相的细胞数/观察有丝分裂相细胞总数)。因此，用于类减数分裂诱导的细胞，优选选择处于旺盛分裂期的诱变细胞。

综上所述，本发明与现有技术的不同之处在于，将体细胞类减数分裂诱导及其胚性发生的体系与体细胞诱变相结合，使隐性突变达到纯和，并进行种质创新。

为了提高无性繁殖植物的突变频率和突变谱，以进一步提高育种效率，本发明利用较为成熟的诱变因子-不同剂量的钴60-γ射线辐照处理，其总剂量优选为20～30Gy，剂量率为10Gy/分钟。而经过辐射诱变打破原有遗传背景，创造新的遗传基因突变，这已被国内外学者公认成为重要的育种手段之一。且鉴于这一技术诱发的隐性突变居多，为此，本发明采用较高浓度激素促进体细胞脱分化，结合采用核苷酸及其类似物等处理体细胞，诱发体细胞类减数分裂，使经γ射线辐照产生的隐性突变，在减数分裂细胞的染色体加倍中达到纯合，由于胚状体为单细胞来源，这些来源于胚状体的植株产生的隐性突变性状便可在其以无性繁世代中表现出来，从而增加突变表型。一般激素引起的细胞无性系变异的频率也不过1-5‰。而加上γ射线辐照诱发、以及体细胞类减数分裂诱导，突变频率提高了一个数量级，使选择效率大大提高(用本发明所述的方法能显著提高突变频率，可达到10％以上)。且可在较短时间内离体筛选大量材料，获得单细胞起源的纯合抗逆突变体。

本发明的有益效果总结：

1.本发明获得的突变效率高于一般诱变育种：因通过辐射育种诱导出大量变异(包括显性、隐性突变)，同时，通过离体培养，也诱导了体细胞无性系变异，突变来自双重的作用因子。

2.本技术对无性繁殖和种子繁殖植物都会使显、隐性突变同时显现：由于类减数分裂的诱导，可大大地加速育种程序，提高育种效率。对无性繁殖植物而言，可能在其繁殖的无性后代中，显性及隐性突变同时显现，大大地提高了突变频率，提高选择几率，而一般辐射育种是不可能达到这种效果的。对种子植物而言，由于诱导类减数分裂的效果，可能产生纯合遗传，即不仅可能提早一年(在M1代)选择出目标性状，而且后代也不会再分离。可在短时间内筛选有利的突变体。

3.筛选是在细胞水平上进行，其优点是大大地节约了人力物力：一般筛选是在个体水平上进行，不仅费时，而且费工，占据很大面积，而且选择效率低下，容易受到多种因素的干扰。而离体培养筛选条件控制严格，不仅省时、省力，而且筛选效果可靠，结果可信。

4.胚胎发生是单细胞事件，来自胚状体的植株不会是嵌合体：由于植株来源于单细胞，无性繁殖的个体间，大都携带有突变的抗逆基因、无性后代应该是均匀一致的。而一般诱变育种，无性繁殖植物变异的出现都是以嵌合状态存在，经无性繁殖后，则会发生无性分离现象，无性后代是不均匀一致的，往往难以应用。

附图说明

图1.本发明诱变育种方法的流程示意图。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明做进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。

实施例1：甘薯胚性细胞团大量发生

1.1.材料和方法

1.1.1.甘薯无菌苗的诱导材料：

MS培养基，Murashige T and Skoog F A revised medium for rapid growth and bioassayswith tobacco tissue cultures.(1962)Physiol Plant 15(3)：473-497.

试剂：

2，4-D：(2，4-二氯苯氧乙酸)北京普博欣生物科技有限责任公司

BA：(6-苄基腺嘌呤)北京九州同业生物科技有限公司

1AA：(吲哚乙酸)北京九州同业生物科技有限公司

NOA：(萘氧乙酸)北京九州同业生物科技有限公司

NAA(α-萘乙酸)北京九州同业生物科技有限公司

KT、(激动素)北京九州同业生物科技有限公司

多效唑：北京九州同业生物科技有限公司

GA3(赤霉素)北京九州同业生物科技有限公司

TDZ(塞苯隆)北京普博欣生物科技有限责任公司

以甘薯的薯块为材料，去皮后，进行表面灭菌，先放入0.1％的洗衣粉溶液中漂洗15分钟，自来水连续冲洗3小时，用70％的酒精消毒半分钟，然后在0.1％HgCl2溶液中消毒8分钟，取出用无菌水冲洗5次后，用无菌滤纸吸干，然后切块进行培养。待生出无菌苗后。剥取长约1-2mm的茎尖分生组织，取生长旺盛、长约2cm的茎尖，在无菌条件下用刀切割成3-5毫米左右的叶块，置入以下其中一种培养基中培养，诱导愈伤组织。

培养基配方是：

MS+2，4-D 2mg/L+6-BA 2mg/L+1AA 2mg/L+NOA2mg/L

MS+2，4-D 0.5mg/L+6-BA 0.5mg/L+1AA 0.5mg/L+NOA 0.5/L。

1.1.2.培养条件：材料接种后，在25℃、黑暗下培养3～4周后，将诱导得到的愈伤组织转移到培养瓶中，愈伤组织和茎尖培养条件为25-28℃及每日12h、2000lx光照。

1.2.结果

1.2.1.甘薯胚性愈伤组织的形成和胚性细胞培养

茎尖组织培养15～20天后，大多数开始形成白色的非胚性愈伤组织。培养6～7周后，在这些非胚性愈伤组织的表面开始形成亮黄色、结构致密、有光泽的胚性愈伤组织。培养8～9周后，选取生长状态良好的胚性愈伤组织，置于含有2，4-D和多种激素的MS培养基中进行培养。观察发现，经过6～8次继代获得了增殖迅速、分散程度良好的胚性细胞系。

研究结果表明，茎尖组织培养15～20天后，不同激素配比的MS培养基上形成的甘薯胚性愈伤组织频率不同。在含有2，4-D2mg/L+6-BA 2mg/L+1AA 2mg/L+NOA2mg/L的MS培养基上培养15～20天，胚性愈伤组织诱导率为36％；在含有2，4-D0.5mg/L+6-BA 0.5mg/L+1AA0.5mg/L+NOA 0.5/L的诱导培养基上15-20天，胚性愈伤组织诱导率为68％。

即在MS+2，4-D0.5-2mg/L+6-BA 0.5-2mg/L+1AA 0.5-2mg/L+NOA0.5-2mg/L的诱导培养基上15-20天，

且以0.5mg/L 6-BA+1.0mg/L 1AA，2，4-D在1.0mg/L以下时，无论愈伤组织诱导率还是芽的分化率都很高。

1.2.2.胚性愈伤组织的继代培养：将生长旺盛的胚性愈伤组织转入到MS+2，4-D 0.05-0.2mg/L+6-BA 0.5-1mg/L+KT 0.5-1mg/L+NOA0.5-1mg/L+IAA0.5-1mg/L+TDZ0.5mg/L的培养基上，继代培养10-15天，使甘薯胚性细胞大量发生。试验发现，在脱分化过程中，胚性愈伤组织在继代培养时激素水平要适当降低。本发明发现过高的激素水平反而对胚性愈伤组织形成有抑制作用。

1.2.3.诱导完整植株再生：为了使甘薯小植株再生，将直径1-2mm左右的胚性细胞团直接转移到含有KT、多效唑、GA3等激素不同配比的培养基中，以MS+KT 0.5mg/L+多效唑0.5-1.0mg/L+NOA 0.5mg/L+GA3 0.5-1.0mg/L、蔗糖3％的培养基中成苗最佳，能使苗长大。然后转入加有NAA的培养基中生根，即1/2MS+KT0.05mg/L+NAA0.5mg/L、蔗糖2％的培养基中生根较好，可达到90％。

1.2.4.再生植株的扩大繁殖：

将无菌苗切成带芽小段，然后转入到1/2MS芽分化较好，具体是MS+0.5mg/L NAA+1.0mg/LKT。

如添加AgNO3，最佳含量为1-2mg/L，可以诱导出大量不定芽，在MS培养基中多次继代培养，实现扩大繁殖。

实施例2：⁶⁰Co-γ射线辐照处理甘薯茎段及胚性细胞

2.1.材料和方法

2.1.1.辐照处理材料的准备：用本发明所建立的甘薯胚性细胞系为材料，选择发育良好，处于旺盛分裂状态(愈伤组织颗粒状、致密、色泽鲜黄、质地幼嫩)的愈伤组织，转将其入到新鲜的继代培养基(MS+2，4-D 0.05-0.2mg/L+6-BA 0.5-1mg/L+KT0.5-1mg/L+NOA0.5-1mg/L+IAA0.5-1mg/L+TDZ0.5mg/L)中。在转入继代培养基10-15天后进行辐照处理。

2.1.2.辐照处理方法：将离体培养的胚性愈伤组织送到中国农业科学院原子能所进行⁶⁰Co-γ射线辐照处理，辐射剂量为10、20、30、40、60Gy，每处理用4瓶愈伤组织。辐照后，将胚性细胞继续培养20-30天，再转移到新鲜的继代培养基中，进行扩大繁殖。

2.2.结果

2.2.1.突变处理的结果：甘薯愈伤组织经射线辐照后会产生损伤，根据经验应该有20～30天的修复期，为此应将愈伤组织转移到新鲜培养基上进行恢复培养1次。培养25天后将愈伤组织称重。结果表明，当辐照剂量为10Gy时生长受到影响，30Gy，50Gy剂量辐照，愈伤组织生长受到显著抑制，差异显著，经多重比较检测(LSD测验)显示30Gy以上处理的生长速度与无辐照处理的对照差异显著。

辐照胚性愈伤组织时，以出现愈伤组织细胞生长受抑制的剂量较为合适，这样的剂量得到的个体较多，选择的机率多，有可能选到所期望的突变苗。剂量太大，细胞损伤增大，对今后成苗有一定影响，不易选到健壮的突变苗。本发明优选20-30Gy辐照剂量范围可有效地诱发突变，兼顾突变率与细胞生长率。

2.2.2.辐照的胚性愈伤组织虽受到抑制，但还要其发育成苗

辐照前愈伤组织重量平均为：0.035克，未辐照的胚性愈伤组织经20经天后为0.102克胚性愈伤组织用20Gy剂量辐照经20经天后，取20块胚性愈伤组织称重，重量分别是0.030、0.055、0.050、0.055、0.052、0.070、0.060、0.056、0.045、0.042、0.041、0.040g、0.040、0.039、0.036、0.033、0.031、0.029、0.028、0.021g，单个愈伤组织的平均重量是0.0426g。在这些个体中，重量在0.03g以上的愈伤组织均有可能诱导出苗，这样才可能选出突变个体；重量小于0.03g的愈伤组织，生长受到严重抑制，在诱导苗分化时会出现困难，不易诱导出幼苗，也难以选出突变个体。

实施例3：甘薯胚性细胞类减数分裂的诱导

3.1材料和方法：

3.1.1.材料：

本发明采用的试材之一是金叶薯，金叶薯是近年来新开发出的一年生地被植物，因其金黄透亮的色彩十分夺目，在夏日尤其突出，而且能对鲜花起到很好的衬托作用。

经实施例1记载的脱分化处理，和实施例2记载的辐照诱变处理后得到金叶薯的胚性细胞，以用于本实施中进行类减数分裂诱导实验。

3.1.2.方法

用嘌呤类核苷处理下有丝分裂指数的最佳条件

以未经药物处理的甘薯胚性细胞为对照，镜检时观察有丝分裂指数(100个细胞中进行分裂的细胞所占百分率)及体细胞类减数分裂频率(100个分裂细胞中发生类减数分裂的细胞数)。

考虑甘薯胚性细胞的有丝分裂指数受嘌呤类核苷浓度、受处理时间、以及复时间的影响。

本发明对这3个因素进行了优化。

方法为：先将嘌呤类核苷溶于MS液体培养基中，配成系列不浓度的溶液。尿嘧啶核苷先用10mmol/L NaOH溶解，然后用1N HC1将pH调至7.0-7.5，以免溶液产生沉淀，然后按不浓度加入到MS液体培养基中。取胚性细胞团在系列梯度的药物溶液中按设置时间(HT表示处理时间)浸泡，处理后用MS液体培养基冲洗，置于浅层MS液体培养基上进行恢复，同时，设置了不同的恢复时间(RT表示恢复时间)，

将诱变处理后得到的胚性细胞浸泡于不同浓度X的腺嘌呤核苷及尿嘧啶核苷溶液中处理Y个小时，恢复Z个小时。采用以下三个因素进行组合处理：

X，嘌呤类核苷或尿嘧啶核苷浓度：0、20、40、60、80、100mmol/L，本实施例采用的腺嘌呤核苷。

HT处理时间设为2-8小时，

RT恢复时间分别为0、5、10、20、40、80小时。

观察有丝分裂指数及类减数分裂频率。

(3)细胞学观察方法：

甘薯的染色体很小，而且数量较多(2n＝90)，同时又是六倍体植物，减数分裂行难以观察，本试验除用醋酸洋红压片法外，同时经过简易水解(浓盐酸∶纯酒精＝1∶1)进行压片后，还采用石碳酸品红法再染色，可直接用于减数分裂相的观察、分析。

1)取样与预检：最适取样时间是在上午的9:30-12；00，取样后立即固定。首先取不同恢复时间的胚性细胞，用卡诺固定液(酒精∶冰醋酸3∶1)固定，或用固定液冰醋酸∶氯仿∶纯酒精1∶3∶6固定。

固定12-24小时后，换到70％的乙醇中保存。

镜检时观察计算有丝分裂频率(进行有丝分裂细胞数在所观察的细胞数的百分率)及体细胞类减数分裂频率(发生类减数分裂的细胞数占选取的有丝分裂细胞中的比例)。进行预检，选用经固定2小时以上，大小合适的胚性愈伤，用镊子或解剖针先取出一枚材料，置于载玻片上，加醋酸洋红一滴，用镊子挤碎，分散细胞，加盖片初压，初步观察是否有分裂相。

2)醋酸洋红制片：经预检确定有分裂相，在醋酸洋红中浸泡6-12小时以上的细胞，取一块置于载玻片上，加45％外的冰醋酸盖片，置于酒精灯火焰上微烤，趁热压片。显微镜下观察可见染色体分散呈红色，细胞质淡红色。从盖片一侧滴加浓盐酸∶纯酒精＝1∶1水解液，经一分钟左右，迅速用滤纸片吸去水解液，立即用45％冰醋酸渗洗2-3次。

3)加石碳酸品红再染色：加石碳酸品红液后，在火焰上再微烤一次，复压片。此时，镜下观察可见染色体分散清晰，呈紫红色，细胞质无色透明。

3.2结果与分析

3.2.1.对仅仅经过脱分化的胚性细胞观察细胞类减数分裂，在100个细胞有丝分裂相，其中有9个细胞染色体异常，典型的类减数分裂细胞有4个，即占4％。类减数分裂诱导频率偏低。

在未经核酸类似物处理的甘薯胚性细胞中，细胞虽然处于旺盛的有丝分裂状态，但仅观察到3-5％体细胞类减数分裂现象。

3.2.2为诱导体细胞类减数分裂优化了条件使诱导率显著提高：

3.2.1.1嘌呤类核苷的浓度分别配制成0、20、40、60、80、100mmol/L，不同处理时间为2小时、8小时。不同恢复时间为10、20、40、80小时。

处理方法第一步：培养分裂旺盛的胚性细胞；

第二步：诱导体细胞类减数分裂；

第三步：细胞自然加倍获得纯合体细胞胚，并使之发育成完整植株。

结果显示：诱导得到的细胞用于统计不同浓度处理的有丝分裂指数表明：镜检时观察到有丝分裂指数(分裂的细胞占观察细胞百分率)在腺嘌呤核苷20-60mmol/L时较高，而且稳定，没有太大变化，在这种条件下可观察到大量的类减数分裂细胞。浓度再加大，则会减少分裂细胞的数目，恢复时间与浓度呈正相关，浓度越大恢复时间越长，分裂细胞越少，以致无法进行类减数分裂频率统计，具体如下：

表1.腺嘌呤核苷诱导的甘薯胚性细胞染色体减数(45∶45)频率

60mmol/L嘌呤核苷处理2小时，20小时恢复观察表明，这是诱导有丝分裂细胞类减数分裂的最佳条件，获得了高达45.6％的体细胞类减数分裂频率。

而80mmol/L嘌呤核苷处理8小时后进行20小时恢复处理也还有胚性细胞分裂发生，总体来看，8小时处理的情况下有丝分裂频率均低于2小时处理的材料(仅14％)，对应的类减数分裂频率为8.2％，因此，以采取较短的处理时间为宜。此外，本实验还对处理后的恢复时间进行优化的结果表明，以40mmol/L浓度的嘌呤核苷处理2小时和8小时，观察了不同恢复时间的有丝分裂频率。结果发现，嘌呤核苷在40mmol/L浓度下，处理2小时，恢复时间可以在10-40小时之问，恢复时间再长，则有丝分频率数有降低的趋势。因此，本发明确定用60mmol/L嘌呤核苷处理2小时后，恢复20小时的处理为筛选出的体细胞类减数分裂诱导的最佳组合方案。

3.2.1.2尿嘧啶的浓度设置0、20、40、60、80、100mmol/L等处理，处理时间设3小时及6小时两种处理，并采用不同恢复时间(0、10、20、40小时)。

尿嘧啶的处理与嘌呤核苷处理的结果类似，在处理3小时、恢复20-40小时的情况下，用40-60mmol/L尿嘧啶处理，有丝分裂指数处于平稳状态，处理浓度再大则有丝分裂指数明显下降，也就无法观察到类减数分裂频率。

处理6小时，恢复20小时和处理3小时的结果相似。但如果再加长恢复时间则60mmol/L以上浓度的处理中有丝分频率便会明显下降。在尿嘧啶诱导下所得到的细胞类减数分裂最高频率达36.7％，该处理的尿嘧啶浓度为40-60mmol/L，处理时间为3小时，恢复时间为20小时为最佳组合方案。

表2.腺嘌呤核苷及尿嘧啶核苷诱导的甘薯胚性细胞染色体减数(45∶45)频率最高的处理

3.2.2再生小植株的形态学变异显著提高

为了比较变异频率，只能从形态学的角度来分析，有些是遗传性变异，但有些可能是生理学上的变异。无论是哪一种变异，从肉眼可见的植株形态学比较看来，都说明经过体细胞类减数分裂的材料变异频率都是最高，而且变异谱都是最广的。

再生小植株的培养方法同实施例1的1.2.3，1.2.4节。

如下的结果中“I”代表来自胚状体的组培苗、

“II”⁶⁰Co-γ射线辐照处理的苗、

“III“代表来自经⁶⁰Co-γ射线辐照处理及类减数分裂处理的苗，括弧中数字分子代表每一性状的株数，分母代表观察株数。

(1)叶形变异：

I.无明显变异(0)

II.有裂叶(2/50)、长形叶(2/50)。50株中有2种性状、4株变异。

III.有裂叶(2/50)、长形叶(3/50)、宽大形叶(4/50)、白化叶(1/50)、小型叶(2/50)、深绿色叶(1/50)。50株中有6种性状、13株变异。

(2)茎杆变异：

I.有多节类型(1/50)株中有1种性状、1株变异。

II.有多节类型(1/50)、速生类型(1/50)。50株中有2种性状、4株变异。

III.有多节类型(2/50)、矮化类型(3/50)、速生类型(3/50)、多分枝类型(3/50)。50株中有4种性状、11株变异。

由以上结果显示，按此方法进行新品系选育，能显著提高甘薯突变频率和突变谱。

实施例4：甘薯抗寒突变体的筛选与鉴定

4.1.处理材料的突变体抗寒性筛选

4.1.1.材料与方法

材料：

对照材料为：非离体培养材料甘薯芽丛组织

实验材料为：和根据实施例1、2、3的操作获得甘薯突变纯合胚状体细胞。

将离体培养的胚状体和芽丛样品迅速放入4℃下预冷。

设置4、2、0、-2、-4℃，共计5个温度处理，甘薯不同处理置于5个温度下，处理时间设为6、12、24小时，一共15个处理。

处理结束后再放回4℃下解冻。

解冻后，连续8周每周目测植物的再生长情况。

经预定的目标温度后没有观察到再生长的发生，则在更低的温度下也不会有再生长的发生，最低存活温度(LST)即无再生长温度之前的那个温度。

4.1.2.抗寒突变体筛选结果

非离体培养材料在0℃条件下12小时大都会死亡。

在不同低温处理下，甘薯离体培养材料显示均有一定的抗寒性，在0℃条件下6小时均能耐受，而24小时则大部分死亡。

而经过类减数分裂处理的胚性愈伤组织还能恢复生长，并再生小植株。有个别经6小时-2℃低温处理的胚性愈伤组织，还能恢复生长。对抗寒胚性愈伤组织进行扩大繁殖。

4.2.处理材料的突变体抗盐碱性筛选

4.2.1.材料和方法

对照材料为：非离体培养材料甘薯芽丛组织

实验材料为：和根据实施例1、2、3的操作获得甘薯突变纯合胚状体细胞。甘薯抗盐碱突变体的筛选与鉴定的具体操作是用离体培养甘薯材料进行的。

鉴于沿海地区多为中性的氯化钠(NaCl)，而日益扩大的内陆盐碱地中，很大一部分是苏打盐碱土，即含Na₂CO₃(苏打)和NaHCO₃(小苏打)的盐碱土，这些地区不仅土壤的盐度增加，而且造成pH值升高。因此，本发明采用盐和碱的胁迫对胚性细胞进行筛选(将离体培养的胚状体和芽丛样品转入含盐(NaCl)、含NaHCO₃(小苏打)的培养基中进行胁迫处理。

即在苗再生培养基中做成六种处理：，两种盐分分别三个浓度：NaCl 0.1％、0.3％、0.6％；NaHCO₃ 0.1％、0.3％、0.6％的6个胁迫处理，连续8周每周目测植物的再生长情况。得到的苗极为耐盐碱突变体，对应的最大盐浓度的苗即为最大盐碱的耐受性突变体。

测定不同浓度盐胁迫下胚性愈伤组织相对生长量、干物质累积、游离脯氨酸含量。

4.2.2.抗盐碱突变体筛选结果

处理的胚性愈伤组织在筛选培养基上，表现出较好的耐盐性，其中对照在0.4％NaCl培养基中20天后全部死亡；而12株经本发明记载的辐照及类减数分裂处理的胚性愈伤组织有些是边死亡边增殖，最终达到生长基本正常，其中有7株在0.4％NaCl培养基中仍可缓慢生长。测定不同浓度盐胁迫下胚性愈伤组织干物质累积、游离脯氨酸含量均有显著提高，说明获得了抗盐胁迫的突变个体。

Claims

1.提高突变频率和突变谱的植物诱变育种方法，其步骤如下：

(1)诱变：对胚性细胞进行诱变处理，然后继代扩大培养，

(2)诱导类减数分裂：对诱变处理、继代扩大培养得到细胞进行类减数分裂诱导，

2.根据权利要求1所述的植物诱变育种方法，步骤(2)诱导类减数分裂，指采用含40～60mmol/L嘌呤类核苷或尿嘧啶核苷的MS液体培养基浸泡诱变处理后的胚性细胞2小时、恢复20～40小时，继代扩大培养得到类减数分裂细胞。

3.根据权利要求1所述的植物诱变育种方法，步骤(1)诱变，指采用钴60-γ射线辐照胚性细胞，辐射剂量为出现愈伤组织细胞生长受抑制的剂量。

4.根据权利要求3所述的植物诱变育种方法，所述辐射剂量为20～30Gy，剂量率为每分钟10Gy/分钟。

5.根据权利要求1～4任一所述的植物诱变育种方法，所述植物指甘薯。

6.根据权利要求5所述的植物诱变育种方法，所述胚性细胞的制备包括植物材料脱分化，然后继代扩大培养；所述脱分化培养基为：MS+2，4-D 0.5-2mg/L+6-BA 0.5-2mg/L+1AA 0.5-2mg/L+NOA0.5-2mg/L、蔗糖3％。

7.根据权利要求6所述的植物诱变育种方法，所述脱分化培养基为：2，4-D0.5mg/L+6-BA0.5mg/L+1AA0.5mg/L+NOA0.5mg/L，蔗糖3％。

8.根据权利要求6或7所述的植物诱变育种方法，所述继代扩大培养采用的培养基为：MS+2，4-D 0.05-0.2mg/L+6-BA 0.5-1mg/L+KT0.5-1mg/L+NOA0.5-1mg/L+IAA0.5-1mg/L+TDZ0.5mg/L。

9.根据权利要求8所述的植物诱变育种方法，步骤(2)中，选择经诱变处理、继代扩大培养后且处于旺盛分裂期的细胞进行类减数分裂诱导

10.根据权利要求1所述的植物诱变育种方法，所述筛选突变纯合体指对突变纯合体施加低温，高温和/或高盐碱逆境选择压，然后筛选出逆境条件下能够存活下来的个体。