CN102250161A - 具有酪氨酸酶抑制活性的紫罗兰酮类衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类具有酪氨酸酶抑制活性的由通式(Ⅰ)和(Ⅱ)表示的紫罗兰酮类衍生物及其制备方法和用途。实验证明该类化合物可显著降低黑色素瘤细胞内酪氨酸酶的活性，降低细胞内黑色素的生物合成水平，抑制酪氨酸酶mRNA基因表达。具有应用于化妆品、医药品及食品领域，作为黑色素生成抑制剂、美白剂或食品添加剂。本发明还公开了从防己科古山龙属植物古山龙中制备该类化合物的方法。

Description

具有酪氨酸酶抑制活性的紫罗兰酮类衍生物及其制备方法和用途

技术领域：

本发明涉及从防己科古山龙属植物古山龙中分离制备得到的一类紫罗兰酮类衍生物，其制备，及其作为新的酪氨酸酶抑制剂，在医药、食品、日用化工领域中的应用。

技术背景：

随着人民生活水平和审美标准的提高，人们对拥有健康美白的肌肤要求日益增加。所以，近些年皮肤美白类化妆品市场的开发日趋重视，美白化妆品已成为护肤类化妆品的主流品种之一，其消费市场在不断扩大。研究表明，人类皮肤的颜色取决于黑色素的含量与分布，当黑色素过速增长和分布不均时，就会造成局部皮肤过黑及色素沉着，从而产生人体雀斑、褐斑等黑色素过度沉积等疾病。而酪氨酸酶是黑素生物合成途径中的主要限速酶。酪氨酸经酪氨酸酶催化氧化生成多巴，多巴醌，并进而氧化聚合生成黑色素。目前常用美白化妆品的主要机理是通过抑制酪氨酸酶活性或阻断酪氨酸氧化生成黑色素，从而减少黑色素的生成而达到美白皮肤的效果。因此美白剂对酪氨酸酶活性抑制率的高低成为衡量该美白剂美白效果的重要指标。

目前已有多种酪氨酸酶抑制剂用于改善或治疗皮肤色斑，并已商品化，但尚不能满足日益扩大的消费市场的需要，而且各自都存在一定的问题。其中，L-抗坏血酸的稳定性差，曲酸的效果也不理想。氢酮虽有一定效果，但其化学性质不稳定，容易氧化变色，引起皮肤永久性白斑，且具有很强的细胞毒性，而被许多国家禁止在化妆品中使用。维生素C和熊果苷是当前美白化妆品中比较常用的添加物。但是维生素C同样非常不稳定，无法直接添加到产品中，通常采用维生素C的衍生物。而熊果苷在近年来的研究中也发现其具有抑制酪氨酸酶活性，在活性剂量下不具细胞毒性，而被开发成为商品，然而其增白效果并不理想，同时不是非常稳定。所以，有效的黑色素生成抑制剂和增白剂有着广阔的消费市场。

而在当今社会化妆品回归“纯天然”的趋势下，天然的美白护肤已占据主流。所以筛纯天然的植物全美白剂是美白护肤品重要方向。近年来，从微生物和植物药中分离天然的酪氨酸酶抑制剂已得到人们的普遍关注。它不但用于色素增加性皮肤病(黄褐斑、雀斑等)的临床治疗，而且可用于化妆品使肤色增白。因此，寻找活性高、安全的酪氨酸酶抑制剂仍是目前研究的一个热点。

此外，果蔬鱼虾类保鲜是当前我国农、水产品面临的一个迫待解决的问题，由于其得不到及时有效的保鲜方法的处理，每年给国家经济带来巨大的损失。而研究表明，酪氨酸酶参与了许多果蔬鱼虾的褐变反应，是这些果蔬鱼虾变褐生斑的主要原因。因此，通过寻找酪氨酸酶的特效抑制剂用于果蔬鱼虾保鲜是一种可取的有效方法。

古山龙(Arcangelisia gusanlung H.S.Lo)，别名黄连藤，为防己科古山龙属植物，以藤茎及根入药。本属植物全球仅有3种，我国仅产1种，主要分布于海南、广东、广西等省区。古山龙味苦，具有清热利湿，解毒止痛的功效，主要用于治疗肠炎，疟疾，细菌性痢疾，扁桃体炎，支气管炎，血压，神经性头痛，湿疹，皮炎，阴道炎等。古山龙的化学研究始于19世纪80年代，主要含有原小檗碱类化学成分，药理活性研究几乎为空白。鉴于古山龙在民间的应用比较广泛，而且其资源丰富，具有一定的开发价值。

发明内容：

本发明的目的是提供一类具有酪氨酸酶抑制作用的紫罗兰酮类衍生物，提供了紫罗兰酮类衍生物从防己古山龙属植物古山龙中分离制备的方法，及其在美白护肤中的应用。

本发明从古山龙藤茎中提取分离得到的具有酪氨酸酶抑制作用的紫罗兰酮类衍生物，由以下通式(Ⅰ)和(Ⅱ)表示：

其中R₁，R₂为H或OH，R₃为H或者糖链(包括五碳糖，六碳糖，糖醛酸化，氨基化糖基，糖基数量为1～3个，糖链可为直链或支链)。C-6和C-9的绝对构型可以相同也可以不同。

对于结构通式(Ⅰ)：优选R₁，R₂为H，R₃为α-L-吡喃鼠李糖(1″→2′)-O-β-D-吡喃葡萄糖基，6位为S构型，9位为R构型时，化学名为(6S，9R)-3-oxo-α-ionyl-9-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1″→2′)-β-D-glucopyranoside，为化合物1，化学结构式为：

对于结构通式(Ⅰ)：优选R₁，R₂为H，R₃为α-L- 吡喃鼠李糖(1″→2′)-O-β-D-吡喃葡萄糖基，6位为R构型，9位为R构型时，化学名为(6R，9R)-3-oxo-α-ionyl-9-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1″→2′)-β-D-glucopyranoside，为化合物2，化学结构式为：

对于结构通式(Ⅱ)：优选R₁，R₂为H，R₃为α-L-吡喃鼠李糖(1″→2′)-O-β-D-吡喃葡萄糖基，6位为S构型，9位为R构型时，化学名为(6S，9R)-9-hydroxymegastigman-4-en-3-one9-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1″→2′)-β-D-glucopyranoside，为化合物3，化学结构式为：

对于结构通式(Ⅱ)：优选R₁，R₂为H，R₃为α-L-吡喃鼠李糖(1″→2′)-O-β-D-吡喃葡萄糖基，6位为R构型，9位为R构型时，化学名为(6R，9R)-9-hydroxymegastigman-4-en-3-one9-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1″→2′)-β-D-glucopyranoside，为化合物4，化学结构式为：

紫罗兰酮类衍生物的制备方法：使用古山龙属植物为原料，将古山龙属植物古山龙的藤茎粉碎，将其浸入提取溶剂中冷提或加热回流，然后过滤或通过离心等方法除去不溶物，再对所得提取溶液进行减压浓缩，之后采用经典的分离精致手段进行分离得到上述的紫罗兰酮类衍生物。

用于提取的溶剂可采用通常用于植物提取的溶剂，例如，可单独或组合使用甲醇、乙醇等低级醇、丙酮和乙酸乙醋等有机溶剂及水。提取方法可采用常规方法，一般提取温度为20-100℃，较好为50-80℃，总提取时间为1-48小时，较好为5-15小时。提取液通过过滤除去不溶物，减压浓缩得提取物。将提取物分散于等体积的水中，依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取。取正丁醇萃取部分，真空减压干燥，得正丁醇萃取物。随后，用正相、反相、凝胶制备高效液相色谱法，采用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇、水等常用溶剂以单一或不同组合配比作为洗脱剂，分离精制得到化合物Ⅰ和Ⅱ，及分别得到化合物1-4。

通过对化合物Ⅰ和Ⅱ酪氨酸酶抑制活性的测定，发现该化合物表现出酪氨酸酶抑制活性，并成剂量依赖性；同时以曲酸作为对照品，发现化合物Ⅰ和Ⅱ对酪氨酸酶的抑制作用更强。在细胞实验中，发现化合物Ⅰ和Ⅱ对黑色素瘤细胞有显著的生长抑制作用，并且可降低细胞内酪氨酸酶的活性，同时又可降低细胞内黑色素生物合成的水平，RT-PCR发现化合物Ⅰ和Ⅱ通过抑制酪氨酸酶的mRNA表达来抑制酪氨酸酶的活性。

紫罗兰酮类衍生物可用于美白或祛斑的化妆品或药物，包括所优选的任何一个化合物1-4都可作为黑色素生成抑制剂或美白剂。并且，可用上述的酪氨酸酶抑制剂制成组合物，该组合物含有上述化合物1-4和任何一种或一种以上的酪氨酸酶抑制剂，并含有药学上所允许的药用辅料或常规的化妆品基质制成药品或化妆品，用作抑制黑色素生成或美白的医药品、化妆品、皮肤外用剂等。所述的化妆品和药物是制成片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂、软膏剂或乳剂等。

化合物Ⅰ和Ⅱ具有强烈的酪氨酸酶抑制作用，进一步地在制备药品、化妆品或食品添加剂中应用，其用量可视不同的用途而不同。

本发明的有益效果是：本发明提供了一类从古山龙中提取的天然化合物Ⅰ和Ⅱ的酪氨酸酶抑制剂。通过对其抑制活性的测定，证明化合物Ⅰ和Ⅱ对酪氨酸酶的抑制活性比曲酸和熊果苷的活性更好或可以相媲美，并且具有较好的稳定性。化合物Ⅰ和Ⅱ对于黑色素瘤细胞具有显著的生长抑制作用，并可显著降低黑色素瘤细胞内酪氨酸酶的活性，降低细胞内黑色素的生物合成水平。而细胞毒实验表明该类化合物的毒性小。含有该类化合物的组合物，用作抑制黑色素生成或美白的化妆品、医药品、皮肤外用剂等，具有黑色素生成抑制作用和美白作用。

附图说明：

图1：实施例3中化合物1-4对B16F10黑素瘤细胞活力的影响。

图2：实施例4中化合物1-4对B16F10黑素瘤细胞酪氨酸酶活性的影响。

图3：实施例5中化合物1-4对B16F10黑素瘤细胞黑色素合成的影响。

图4：半定量RT-PCR检测实施例6中化合物1-4对酪氨酸酶基因表达量的变化。

具体实施方式：

以下是本发明的具体实施方式，是对本发明的进一步详细说明，并不意味着对本发明的任何限制。

实施例1：通式(Ⅰ)和(Ⅱ)表示的新的紫罗兰酮类衍生物的制备

其中R₁，R₂为H或OH，R₃为H或者糖链(包括五碳糖，六碳糖，糖醛酸化，氨基化糖基，糖基数量为1～3个，糖链可为直链或支链)。C-6和C-9的绝对构型可以相同也可以不同。

干燥的古山龙藤茎18kg粉碎，用5倍量甲醇加热回流提取三次，每次2小时，合并提取液，过滤除去不溶物，滤液减压浓缩得总浸膏880g，将其悬浮于等体积水中，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取。正丁醇萃取物(630g)用水溶解，过滤后滤液经大孔吸附树脂HPD-20分离，以乙醇-水(0∶100，1∶9，3∶7，6∶4，100∶0)梯度洗脱。乙醇-水(3∶7)进一步多次运用硅胶柱层析(二氯甲烷-甲醇)、凝胶柱层析(甲醇)以及HPLC(40％甲醇-水)制备分离纯化，得到化合物1(82mg)、2(51mg)、3(42mg)4(30mg)。通过理化常数、化学手段和现代波谱学手段(IR、UV、MS、NMR、CD)鉴定了它们的结构。

化合物1

白色无定形型粉末，HRESIMS给出其准分子离子峰m/z 539.2484([M+Na]⁺，理论值：539.2468)及m/z 1055.5081([2M+Na]⁺)，可确定其分子式为C₂₅H₄₀O₁₁，不饱和度为6。¹H、¹³C NMR和HSQC进一步证实了化合物1含有25个碳。UV显示λ_max＝241.5nm，提示1的结构中含有α，β-不饱和酮的结构片段，IR显示相似的结构信息(1653cm^-1)。

¹H NMR(CD₃OD，600MHz)中显示高场区可见4个甲基质子信号：δ0.98(3H，s，H-11)、1.03(3H，s，H-12)、1.31(3H，d，J＝6.6Hz，H-10)、1.96(3H，s，H-13)，低场区有1个单峰烯氢质子信号δ5.89(1H，s，H-4)和1对反式偶合的烯氢质子信号δ5.64(1H，dd，J＝15.6，9.6Hz，H-7)、5.79(1H，dd，J＝15.6，6.6Hz，H-8)。¹³CNMR和HSQC NMR显示25个碳信号，除了2个糖的结构片段以外，还有4个甲基[δ21.2(C-10)、24.2(C-13)、27.6(C-11)、28.2(C-12)]、1个亚甲基[δ48.6(C-2)]、2个次甲基[δ56.9(C-6)、76.6(C-9)]、1个季碳[δ37.1(C-1)]、4个烯碳(δ126.3(C-4)、128.9(C-7)、138.6(C-8)、166.2(C-5))以及1个α，β-不饱和酮羰基碳信号(δ202.2)。

¹H-¹H COSY NMR提示1中有3个自旋体系：C-6-C-10，C-1′-C-6′和C-1″-C-6″，而HMBC确定了这些片段的连接及取代基的位置：Me-11和Me-12与C-1、C-2、C-6相关，表明C-11、C-12、C-2和C-6都与C-1相连；H-4与C-2和C-3相关，而H-2与C-3相关，说明C-3与C-2和C-4相连；Me-13与C-4、C-5、C-6相关，提示C-5与C-4、C-6、C-13相连，同时说明了1中含有1个环己烷的结构片段。而¹H-¹H COSY提示了C-7-C-10结构片段与环己烷的C-6位相连。综合以上结构信息，表明1的母核为3-oxo-α-ionol moiety。

MS/MS结构信息：由准分子离子峰m/z 539的MS²得到m/z 393([M+Na-146]⁺)，而m/z 393的MS²得到m/z 231[M+Na-146-162]⁺，说明了1中含有1分子葡萄糖和1分子鼠李糖，而且鼠李糖连接在末端。以上结构由酸水解进一步确认：将化合物1酸水解，水层通过GC分析得出1分子D-葡萄糖和1分子L-鼠李糖。而¹H，¹³C NMR和HSQC NMR显示1中含有1个β-D-吡喃葡萄糖(J＝7.8Hz)和1个α-L-吡喃鼠李糖(J＝1.2Hz)。HMBC提示了糖的连接位置：葡萄糖的端基氢δ4.43(1H，d，J＝8.0Hz)与δ76.6(C-9)有远程相关，提示葡萄糖连接在苷元的C-9位，而鼠李糖的端基氢δ5.24(1H，d，J＝1.2Hz)与葡萄糖的2位碳δ78.8有相关信号，说明鼠李糖连接与葡萄糖的2位。

化合物1的绝对构型通过NMR和CD确定：首先，H-7和H-8间的偶合常数(J＝16Hz)提示双键C-7-C-8为E构型。CD谱显示1在244nm处有负Cotton效应(Δε-188.9mdeg)，与physanoside B相似，说明C-6为S构型。而文献报道发现，C-9和C-10的特征¹³C NMR化学位移，对于Δ^7，8-types of 9-hydroxymegastigamane9-O-β-D-glucopyranosides类紫罗兰酮类化合物的9位的绝对构型起着决定性的作用：9R(ca.δ₉ 77.3-79.1，δ₁₀ 21.2-21.8)和9S(ca.δ₉ 74.7-76.3，δ₁₀ 22.3-22.6)，由此可确定化合物1为9R(δ₉ 76.6、δ₁₀ 21.2)。综合以上结构信息，最终得出化合物1的结构为(6S，9R)-3-oxo-α-ionyl-9-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1″→2′)-β-D-glucopyranoside。为一新化合物，命名为古山龙酮苷A(Gusanlungionoside A)。

化合物2

白色无定形粉末，UV和IR显示着与化合物1相似的结构信息。HRESIMS给出其准分子离子峰m/z 539.2484([M+Na]⁺，理论值：539.2468)及m/z 1055.5081([2M+Na]⁺)。¹H，¹³C NMR，HSQC，¹H-¹H COSY和HMBC提示化合物2具有同1相同的平面结构。MS，¹H，¹³C NMR和酸水解同样得出1个β-D-吡喃葡萄糖和1个α-L-吡喃鼠李糖的结构片段。而化合物2的¹³C NMR显示C-9(δ76.9)和C-10(δ21.2)，提示2的9位为R构型。CD谱显示2在244nm处有正Cotton效应(Δε+126.8mdeg)，与eriojaposide A和(6R，9S)-3-oxo-α-ionol β-D-glucopyranoside相似，说明C-6为R构型。由此得出化合物2的结构为(6R，9R)-3-oxo-α-ionyl-9-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1″→2′)-β-D-glucopyranoside。

化合物3和4

均为白色无定形粉末，UV和IR显示着与化合物1和2相似的结构信息。HRESIMS给出3和4的准分子离子峰均为m/z 541.2653([M+Na]⁺)，提示它们具有相同的分子式C₂₅H₄₂O₁₁，与1和2相比多了2个质子氢，即少了1个不饱和度。由¹H和¹³C NMR得出3和4具有同1和2相似的结构片段，唯一的区别就是C-7/C-8间的双键被还原成一对亚甲基信号。以上信息通过¹H-¹H COSY和HMBC得到了进一步确认。同样的，由C-9和C-10的特征化学位移可以确定其9位的绝对构型为R。CD谱显示4在210nm处有正Cotton效应(Δε+25.9mdeg)，与byzantionoside B(6R)相似，而3在210nm处有负Cotton效应(Δε-15.6mdeg)，说明3为6S而4为6R构型。由此化合物3和4的结构分别鉴定为(6S，9R)-9-hydroxymegastigman-4-en-3-one

9-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1″→2′)-β-D-glucopyranoside和(6R，9R)-9-hydroxymegastigman-4-en-3-one

9-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1″→2′)-β-D-glucopyranoside。

实施例2：酪氨酸酶抑制活性的测定

测定原理：在酪氨酸酶的作用下，左旋多巴(L-DOPA)氧化为棕褐色的多巴色素(DOPAchrome)。

试验样品：取实施例1制得的化合物1-4，酪氨酸酶购自Sigma公司从蘑菇中提取。

对照品：曲酸

试验方法：首先将底物L-DOPA溶解在磷酸缓冲液(25mM，pH 6.8)中达到0.1mg·mL^-1浓度。然后向96孔板中分别加入40μL上述底物溶液，80μL磷酸缓冲液(25mM，pH 6.8)，以及40μL待测样品，混匀。加入40μL酪氨酸酶的磷酸缓冲溶液(500U·mL^-1，25mM，pH 6.8)。在25℃下温孵10min，然后在490nm下测定每孔的吸光度。

根据在490nm下的吸光度计算化合物对酪氨酸酶的抑制率(％)，并将酶活性抑制率(％)达到50％时抑制剂的浓度测定为IC₅₀值。抑制率(％)可以根据下式进行计算：

抑制率(％)＝[(A_test sample-A_blank)/A_control)×100]％

上式中，A_control表示模型组(底物中加入了酪氨酸酶，而没有加待测样品的测活体系)在490nm下的吸光度；A_blank表示空白组(底物中加入了待测样品，而没有加酪氨酸酶的测活体系)在490nm下的吸光度；A_test sample表示样品组(底物中加入了待测样品和酪氨酸酶的测活体系)在490nm下的吸光度。

结果：见表1

表1  化合物1-4的酪氨酸酶抑制活性

结论：由表2可以看出，化合物1-4在体外实验中表现出较强的酪氨酸酶抑制活性，呈剂量依赖性，而且它们的抑制活性均强于对照品曲酸。

实施例3.对B16F10黑素瘤细胞活力的影响

测定原理：采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)

试验样品：取实施例1制得的化合物1-4，B16F10细胞购自Korean Cell Line Bank。

试验方法：B16F10细胞接种于96孔板，2×10³个细胞/孔，用DMEM培养基(10％FBS，100U·mL^-1青霉素和100μg·mL^-1链霉素)培养。16小时后换上含有100nM的α-MSH，并加入不同浓度的化合物。48小时候弃去培养基，加入100μL 5g·L^-1的MTT，4小时后弃去上清液，加入150μL DMSO，酶标仪上检测吸光度值，测定波长为570nm，参考波长为630nm。结果见图1。

结论：当化合物1-4浓度低于200μg.mL^-1时对B16F10细胞活力没有明显影响。

实施例4.对B16F10黑素瘤细胞酪氨酸酶活性的影响

试验样品：取实施例1制得的化合物1-4，B16F10细胞购自Korean Cell Line Bank。

对照品：熊果苷

试验方法：B16F10细胞接种于6孔板，4×10⁵ cells个细胞/孔，用DMEM培养基培养。培养16小时后加入100μg·mL^-1的待测样品或熊果苷处理30min，然后换上含有250nM的α-MSH。温孵48小时后弃去培养基，冷的PBS洗两次，每孔加0.2mL含1％(v/v)TritonX-1001％的PBS(pH 6.8)。冰浴中超声破碎，取100μL细胞提取物加入96孔板，再加入100μL L-DOPA(2mM)，37℃孵育60min，于490nm处测定各孔吸光度值。结果见图2。

结论：化合物1-4处理B16F10细胞48小时后，显著降低了细胞内酪氨酸酶活性(p＜0.05)。100μg·mL^-1的化合物1-4对细胞内酪氨酸酶的抑制活性与熊果苷的作用效果相当。

实施例5.对B16F10黑素瘤细胞黑色素合成的影响

试验样品：取实施例1制得的化合物1-4，B16F10细胞购自Korean Cell Line Bank。

对照品：熊果苷

试验方法：B16F10细胞(2×10⁵个细胞/孔)按照实施例4的方法进行处理。温孵48小时后弃去培养基，冷的PBS洗两次，每孔加0.5mL 1M NaOH，在90℃煮沸60min，冷却后于405nm处测定各孔吸光度值。结果见图3。

结论：化合物1-4处理B16F10细胞48小时后，显著降低了细胞内黑色素的含量(p＜0.05)。100μg·mL^-1的化合物1-4对细胞内黑色素合成的抑制活性比熊果苷的作用效果要强(p＜0.05)，可以与空白组的水平相当。

实施例6.半定量RT-PCR检测酪氨酸酶基因表达量的变化

试验样品：取实施例1制得的化合物1-4，B16F10细胞购自Korean Cell Line Bank。

试验方法：B16F10细胞(2×10⁵个细胞/孔)按照实施例4的方法进行处理。采用Trizol试剂盒提取总RNA。取20μL总RNA反转录合成cDNA。内参物GAPDH的引物序列为：5′-CACTCA CGG CAA ATT CAA CGG CAC-3′和5′-GAC TCC ACG ACA TAC TCA GCA C-3′，酪氨酸酶的引物序列为：5′-GGC CAG CTT TCA GGC AGA GGT-3′和5′-TGG TGC TTC ATG GGCAAA ATC-3′。基因特异性片断扩增的PCR程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s；55-60℃退火30s；72℃延伸1min，25个循环，最后一个循环结束后72℃延伸7min。1％琼脂糖凝胶电泳检测表达产物，分析酪氨酸酶基因及内参GAPDH的表达情况。凝胶照相后用Mini BIS image analysis system对扩增产物进行光密度分析，基因的表达水平以mRNA值/GAPDH mRNA值来表示。结果见图4。

结论：化合物1-4处理B16F10细胞48小时后，酪氨酸酶mRNA的表达量明显降低，达到正常组的水平。由此说明化合物1-4通过抑制酪氨酸酶mRNA的转录表达来抑制黑色素的合成。

Claims (10)

1.一种具有酪氨酸酶抑制作用的紫罗兰酮类衍生物，由以下通式(Ⅰ)和(Ⅱ)表示：

其其中R₁，R₂为H或OH，R₃为H或者糖链(包括五碳糖，六碳糖，糖醛酸化，氨基化糖基，糖基数量为1～3个，糖链可为直链或支链)。C-6和C-9的绝对构型可以相同也可以不同。

2.权利要求1所述的用途，其特征在于，化合物Ⅰ和Ⅱ在制备治疗由酪氨酸酶引起的皮肤变色、雀斑、斑点的药物中的应用。

3.权利要求1所述的用途，其特征在于，化合物Ⅰ和Ⅱ在制备抑制黑色素生物合成的化妆品中的应用。

4.根据权利要求1、2或3所述的用途，其特征在于，化合物Ⅰ和Ⅱ单独使用，或者与其它药学上可接受的药用辅料、药用载体或其它美白剂混合使用。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的药用载体选自软膏基质、乳化剂、表面活性剂、稳定剂。

6.根据权利要求1、2或3所述的用途，其特征是所述的化妆品或药物是制成片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂或乳剂。

7.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的美白剂选自熊果苷、曲酸衍生物、L-抗坏血酸及其衍生物及其盐、氢醌及其衍生物、甘草提取物、芦荟提取物中的一种或几种。

8.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所属的化合物Ⅰ和Ⅱ在药物或化妆品中的含量以重量百分比计，为0.01-10％。

9.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，化合物Ⅰ和Ⅱ在制备预防褐变的食品添加剂中的应用。

10.权利要求1的紫罗兰酮类衍生物的制备方法，其特征在于将古山龙属植物古山龙的藤茎粉碎；再用甲醇加热回流提取，将提取液浓缩后得到浸膏，将浓缩浸膏悬浮于水中，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取。正丁醇萃取物，以二氯甲烷、甲醇、乙醇和水中之一或不同组合作为溶解剂，以一次或多次使用硅胶、大孔吸附树脂、ODS、Sephadex-LH20作为固定相，以二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇和水中之一或不同组合作为洗脱溶剂，分离并纯化制备得到。

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