CN102229919A - 一种利用废渣固态发酵生产脂肪水解酶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用废渣固态发酵生产脂肪水解酶的制备方法,属于微生物发酵领域。发明将黑曲霉RFW-5接种到发酵培养基中,在接触空气条件下,于温度35~42°C,环境相对湿度75~80%固态发酵,培养3天达到产酶高峰。用pH为7.0,100mM的磷酸缓冲液浸提培养物,离心,上清液即脂肪水解酶溶液。经滴定法测定酶活,脂肪水解酶活达到32.3单位/克干固体。本发明制备的脂肪水解酶所用原料价廉,酶产率高,发酵周期短,工艺简单,具有很高的工业化开发价值;并且为高浓度油脂污水的处理提供了一条新途径。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用废渣固态发酵生产脂肪水解酶的制备方法,更确切地说是涉及一种采用黑曲霉菌RFW-5作为菌种对废渣进行固态发酵生产脂肪水解酶的方法。
背景技术
来自屠宰场,奶制品加工厂和餐饮业污水中含有大量难生物降解的油脂。高浓度的油脂会对后续处理产生一系列问题,如降低传质效率、丝状细菌大量繁殖进而导致沉降困难、污泥上浮、堵塞管网和产生恶臭气体等。
脂肪水解酶是一种酶制剂,它的主要作用是水解脂肪,将脂肪水解为甘油和脂肪酸。大量学者(如巴西的Denise M.G. Freire、Magali C. Cammarota、Daniela R. Rosa等人)研究发现,利用脂肪水解酶处理油脂污水会提高整个反应系统的去除效率,进而得到较好的出水。巴西的学者Denise M.G. Freire,利用棕榈油饼废弃物为底物,经从环境中分离的黑曲霉菌(Penicillium sp. fungus)在温度35°C、环境相对湿度75%条件下发酵,得到了20U/g的酶活。然后将发酵物以0.1%(w/v)的接种量接种到1200mg/L的油脂污水中,30°C处理24小时后,游离脂肪酸浓度比初始时高了8倍。将经发酵物处理过的油脂污水用厌氧反应器继续处理,发现COD去除率90%左右,而该厌氧反应器对原水的COD去除率只有32%。因此,脂肪水解酶在油脂污水的生物降解中有重要应用。
目前商业化的脂肪水解酶使用液体深层发酵获得的比较多,虽然纯度高,但价格昂贵限制了其广泛应用。与液体深层发酵相比,通过固态发酵生产脂肪水解酶可能更为合适(Mitchell et al., 2002; Pandey, 2003)。固态发酵(SSF)过程中使用的水较少,从而有以下优点:首先,发酵罐的体积大幅度缩小,容积利用率更高;发酵结束后,产品浓度高,产物干燥后就可以直接使用;污水产生量少,进而处理费用低(Castilho et al., 2000)。微生物,特别是丝状真菌,固态发酵(SSF)条件与它们的自然生境相似,所以可以获得最大数量的酶。另外,固态发酵所用培养基可以是糠,麸和其它来自于植物的复合物质。因此,发酵培养基几乎不需要其它添加的营养物质。上面所述的物质都是工农业废弃物,所以廉价充足。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足,提供一种利用废渣固态发酵生产脂肪水解酶的制备方法。
利用废渣固态发酵生产脂肪水解酶的制备方法是:将黑曲霉RFW-5接种到发酵培养基中,在接触空气条件下,于温度35~42°C,环境相对湿度75~80%固态发酵,培养3天达到产酶高峰,用pH为7.0,100mM的磷酸缓冲液浸提培养物,离心,上清液即脂肪水解酶溶液;所述的的发酵培养基组成为:重量百分比为10.0~14.0%的豆饼,重量百分比为8.0~11.0%的甘蔗渣,重量百分比为10.0~14.0%的花生饼,补充溶液61.0~72.0 %L/kg。
所述的黑曲霉RFW-5保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏日期:2010年12月10日;保藏编号:CGMCC No. 4450;分类命名:黑曲霉Aspergillus niger。所述的大豆饼为大豆油生产过程中产生的废渣,经脱水干燥加工成含水率在12%以下,再经粉碎处理能过20目筛的颗粒。所述的甘蔗渣为甘蔗在经人类食用后产生的甘蔗废渣,经脱水干燥加工成含水率在12%以下,再经粉碎处理能过100目筛的颗粒。所述的花生饼为花生油生产过程中产生的废渣,经脱水干燥加工成含水率在13%以下,再经粉碎处理能过20目筛的颗粒。所述的的补充溶液成份为:NaCl 3.0~5.0g,KH2PO4 0.1~0.3g,MgSO4·7H20 0.05~0.1g,K2HPO4 1.2~1.5g,(NH4)2SO4 0.8~1.0g,Tween80 15~20mL,食用油 4~5mL,蒸馏水1000mL。
本发明制备的脂肪水解酶所用原料价廉,酶产率高,发酵周期短,工艺简单,具有很高的工业化开发价值;并且为高浓度油脂污水的处理提供了一条新途径。
具体实施方式
实施例1:固态发酵生产脂肪水解酶实验1
本发明所用黑曲霉菌RFW-5是从环境中分离、筛选获得,目前已将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏日期:2010年12月10日;保藏编号:CGMCC No. 4450;分类命名:黑曲霉Aspergillus niger。
发酵培养基组成为:重量百分比为10.0%的豆饼,重量百分比为8.0%的甘蔗渣,重量百分比为10.0%的花生饼,补充溶液72.0 %(L/kg)。大豆饼为大豆油生产过程中产生的废渣,经脱水干燥加工成含水率在12%,再经粉碎处理能过20目筛的颗粒;甘蔗渣为甘蔗在经人类食用后产生的甘蔗废渣,经脱水干燥加工成含水率在12%,再经粉碎处理能过100目筛的颗粒;花生饼为花生油生产过程中产生的废渣,经脱水干燥加工成含水率在13%,再经粉碎处理能过20目筛的颗粒;补充溶液成份为:NaCl 3.0g,KH2PO4 0.1g,MgSO4·7H20 0.05g,K2HPO4 1.2g,(NH4)2SO4 0.8g,Tween80 15mL,食用油 4mL,蒸馏水1000mL。
固态发酵操作方法如下:按发酵培养基所述的原料比配制培养基,培养基分装于100mL的三角瓶中,每瓶30g,于121°C高压灭菌30分钟;接种黑曲霉菌RFW-5,于温度35°C,环境相对湿度75%、接触空气条件下,静置培养3天;用pH为7.0,100mM的磷酸缓冲液浸提培养物(在200rpm,37°C振摇30min),1600×g离心2min,上清液即脂肪水解酶溶液。
脂肪水解酶酶活测定采用滴定法。测定方法具体如下:取18mL的含有5%(w/v)阿拉伯胶和5%(w/v)橄榄油的pH 7.0、100mM的磷酸缓冲溶液于100mL三角瓶中,加入2mL脂肪水解酶液。置于200rpm,37°C摇床中振摇15min。通过添加20mL丙酮和乙醇 (1:1 v/v)的混合物终止反应。然后再次将其放入200rpm、37°C摇床中振摇10min以使游离脂肪酸分离出来。添加2低酚酞试剂,然后使用0.01mol/L的NaOH滴定至红色pH 10.0。空白对照为先将2mL脂肪水解酶液加入到20mL丙酮和乙醇 (1:1 v/v)的混合物中,再将该混合物加入到含有相同底物的100mL三角瓶中。1单位酶活定义为:实验条件下,每分钟能催化产生1μmol脂肪酸的酶数量。
经测定本次固体发酵实验获得的脂肪水解酶酶活为27.5单位/克干固体。
实施例2:固态发酵生产脂肪水解酶实验2
本发明所用黑曲霉菌RFW-5是从环境中分离、筛选获得,目前已将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏日期:2010年12月10日;保藏编号:CGMCC No. 4450;分类命名:黑曲霉Aspergillus niger。
发酵培养基组成为:重量百分比为14.0%的豆饼,重量百分比为11.0%的甘蔗渣,重量百分比为14.0%的花生饼,补充溶液61.0 %(L/kg)。大豆饼为大豆油生产过程中产生的废渣,经脱水干燥加工成含水率在12%,再经粉碎处理能过20目筛的颗粒;甘蔗渣为甘蔗在经人类食用后产生的甘蔗废渣,经脱水干燥加工成含水率在12%,再经粉碎处理能过100目筛的颗粒;花生饼为花生油生产过程中产生的废渣,经脱水干燥加工成含水率在13%,再经粉碎处理能过20目筛的颗粒;补充溶液成份为:NaCl 5.0g,KH2PO4 0.3g,MgSO4·7H20 0.1g,K2HPO4 1.5g,(NH4)2SO4 1.0g,Tween80 20mL,食用油 5mL,蒸馏水1000mL。
固态发酵操作方法如下:按发酵培养基所述的原料比配制培养基,培养基分装于100mL的三角瓶中,每瓶40g,于121°C高压灭菌30分钟;接种黑曲霉菌RFW-5,于温度42°C,环境相对湿度80%、接触空气条件下,静置培养3天;用pH为7.0,100mM的磷酸缓冲液浸提培养物(在200rpm,37°C振摇30min),1600×g离心2min,上清液即脂肪水解酶溶液。
脂肪水解酶酶活测定采用滴定法。测定方法具体如下:取18mL的含有5%(w/v)阿拉伯胶和5%(w/v)橄榄油的pH 7.0、100mM的磷酸缓冲溶液于100mL三角瓶中,加入2mL脂肪水解酶液。置于200rpm,37°C摇床中振摇15min。通过添加20mL丙酮和乙醇 (1:1 v/v)的混合物终止反应。然后再次将其放入200rpm、37°C摇床中振摇10min以使游离脂肪酸分离出来。添加2低酚酞试剂,然后使用0.01mol/L的NaOH滴定至红色pH 10.0。空白对照为先将2mL脂肪水解酶液加入到20mL丙酮和乙醇 (1:1 v/v)的混合物中,再将该混合物加入到含有相同底物的100mL三角瓶中。1单位酶活定义为:实验条件下,每分钟能催化产生1μmol脂肪酸的酶数量。
经测定本次固体发酵实验获得的脂肪水解酶酶活为22.7单位/克干固体。
Claims (6)
1.一种利用废渣固态发酵生产脂肪水解酶的制备方法,其特征将黑曲霉RFW-5接种到发酵培养基中,在接触空气条件下,于温度35~42°C,环境相对湿度75~80%固态发酵,培养3天达到产酶高峰,用pH为7.0,100mM的磷酸缓冲液浸提培养物,离心,上清液即脂肪水解酶溶液;所述的的发酵培养基组成为:重量百分比为10.0~14.0%的豆饼,重量百分比为8.0~11.0%的甘蔗渣,重量百分比为10.0~14.0%的花生饼,补充溶液61.0~72.0 %L/kg。
2.根据权利要求1所述的一种利用废渣固态发酵生产脂肪水解酶的制备方法,其特征在于所述的黑曲霉RFW-5保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏日期:2010年12月10日;保藏编号:CGMCC No. 4450;分类命名:黑曲霉Aspergillus niger。
3.根据权利要求1所述的一种利用废渣固态发酵生产脂肪水解酶的制备方法,其特征在于所述的大豆饼为大豆油生产过程中产生的废渣,经脱水干燥加工成含水率在12%以下,再经粉碎处理能过20目筛的颗粒。
4.根据权利要求1所述的一种利用废渣固态发酵生产脂肪水解酶的制备方法,其特征在于所述的甘蔗渣为甘蔗在经人类食用后产生的甘蔗废渣,经脱水干燥加工成含水率在12%以下,再经粉碎处理能过100目筛的颗粒。
5.根据权利要求1所述的一种利用废渣固态发酵生产脂肪水解酶的制备方法,其特征在于所述的花生饼为花生油生产过程中产生的废渣,经脱水干燥加工成含水率在13%以下,再经粉碎处理能过20目筛的颗粒。
6.根据权利要求1所述的一种利用废渣固态发酵生产脂肪水解酶的制备方法,其特征在于所述的的补充溶液成份为:NaCl 3.0~5.0g,KH2PO4 0.1~0.3g,MgSO4·7H20 0.05~0.1g,K2HPO4 1.2~1.5g,(NH4)2SO4 0.8~1.0g,Tween80 15~20mL,食用油 4~5mL,蒸馏水1000mL。
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CN101392224A (zh) * | 2008-09-19 | 2009-03-25 | 南京工业大学 | 一株高产绿原酸水解酶的黑曲霉菌株及其应用 |
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CN102229919B (zh) | 2012-08-15 |
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