CN102223907A

CN102223907A - Hla-dr阳性单核细胞选择去除器及抗氧化剂用于制造该选择去除器的用途

Info

Publication number: CN102223907A
Application number: CN2009801472948A
Authority: CN
Inventors: 加盐裕美子; 樱井正美; 助川威
Original assignee: Asahi Kasei Kuraray Medical Co Ltd
Current assignee: Asahi Kasei Medical Co Ltd
Priority date: 2008-11-25
Filing date: 2009-11-24
Publication date: 2011-10-19
Anticipated expiration: 2029-11-24
Also published as: JPWO2010061580A1; EP2361644A1; CN102223907B; EP2361644B1; EP2361644A4; WO2010061580A1; ES2460669T3; JP5484354B2

Abstract

本发明提供抗氧化剂用于制造HLA-DR阳性单核细胞选择去除器的用途，所述HLA-DR阳性单核细胞选择去除器从含抗凝血剂的血液中选择性去除HLA-DR阳性单核细胞，其中，所述HLA-DR阳性单核细胞选择去除器具备由表面未改性的聚酯无纺布构成的细胞去除过滤器，所述细胞去除过滤器填充有含抗氧化剂的填充液且经辐射线灭菌，所述抗凝血剂为选自由柠檬酸和其盐组成的组中的至少1种，所述抗氧化剂为选自由焦亚硫酸钠、焦亚硫酸钾、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、次磷酸、抗坏血酸和抗坏血酸衍生物组成的组中的至少1种。

Description

HLA-DR阳性单核细胞选择去除器及抗氧化剂用于制造该选择去除器的用途

技术领域

本发明涉及HLA-DR阳性单核细胞选择去除器及抗氧化剂用于制造该选择去除器的用途。

背景技术

使用白细胞去除过滤器选择性去除白细胞的技术被不断开发和改良，用于治疗全身性红斑狼疮、类风湿关节炎、多发性硬化症、溃疡性结肠炎及克罗恩病等自身免疫性疾病以及白血病等。目前，开发了使用无纺布等作为过滤器的白细胞去除器。

成为白细胞去除疗法的对象的疾病与各种免疫细胞所导致的免疫反应密切相关。在免疫反应中承担重要作用的T细胞通过存在于其表面的抗原受体与抗原的结合而开始活动，但T细胞的反应中必须有抗原呈递细胞的存在。T细胞通过抗原呈递细胞上的主要组织相容性抗原(MHC抗原)与抗原的组合而发生反应。

人类的MHC抗原被称作HLA抗原，白细胞中作为抗原呈递细胞的组分中表达有HLA-DR抗原。开始活动的T细胞通过其他白细胞组分而受到抗原呈递，进而被活化，免疫反应进行。活化的白细胞引起肠上皮细胞的伤害或骨破坏，导致疾病的发病。

如此，作为HLA-DR抗原阳性细胞的抗原呈递细胞可以说是与免疫反应的最初阶段以及之后的反应都密切相关的重要免疫细胞。

另外，还已知，对于白细胞去除器的对象疾病的类风湿关节炎或溃疡性结肠炎的患者，与健康人相比，其HLA-DR抗原阳性细胞的比例更高(参照非专利文献1和2)。

作为使用白细胞去除过滤器选择性去除白细胞的技术，专利文献1中公开了通过在血液中添加大量的柠檬酸，适当减弱造血干细胞的粘着性，从而提高造血干细胞的回收率的方法。

另外，专利文献2公开了选择地去除单核细胞和/或单核细胞来源的巨噬细胞的过滤器装置。

现有技术文献

专利文献1：日本特开平11-322618号公报

专利文献2：日本专利第3812909号公报

非专利文献

非专利文献1：Mottonen M.et.al.，Immunology，2000，vol.100，p.238-244

非专利文献2：Sawada K.et.al.，Jpn.J.Apheresis.，1995，vol.14.No.1，p.48-50

发明内容

发明要解决的问题

包括抗原呈递细胞、T细胞在内的除淋巴细胞以外的白细胞组分，有粒细胞。粒细胞由于活性氧的产生而导致的细胞伤害性等，因而也与疾病的发病有关。粒细胞的活化与作为抗原呈递细胞的单核细胞、通过抗原呈递而被活化的淋巴细胞密切相关。认为通过控制白细胞的免疫反应开始阶段的抗原呈递，可以控制大部分的免疫反应。

以往的白细胞去除疗法仅仅是将免疫细胞的各个组分去除。认为，只要能够选择性去除免疫反应中更密切相关的抗原呈递细胞，则白细胞去除的治疗效果的效率更为提高。为了提高白细胞去除的治疗效果的效率，尤其重要的是，选择性去除通过吞食作用(吞噬)摄入粒状的大抗原而进行抗原呈递的HLA-DR阳性单核细胞。

但是，可在临床上使用的HLA-DR阳性单核细胞选择去除器仍是未知的，专利文献1和2中也未公开能够择性去除HLA-DR阳性单核细胞选的装置。

鉴于上述事实，本发明要解决的课题在于，提供可在临床上使用的HLA-DR阳性单核细胞选择去除器。

用于解决问题的方案

本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现在含柠檬酸或其盐的抗凝剂的存在下使血液流入到具备与含抗氧化剂的填充液接触且经辐射线灭菌的细胞去除过滤器的去除器中，可以选择性去除HLA-DR阳性单核细胞，进而完成了本发明。

即，本发明提供以下的抗氧化剂用于制造HLA-DR阳性单核细胞选择去除器的用途、HLA-DR阳性单核细胞选择去除器和选择性去除HLA-DR阳性单核细胞的方法。

(1)一种抗氧化剂用于制造HLA-DR阳性单核细胞选择去除器的用途，所述HLA-DR阳性单核细胞选择去除器从含抗凝血剂的血液中选择性去除HLA-DR阳性单核细胞，

所述HLA-DR阳性单核细胞选择去除器具备由表面未改性的聚酯无纺布构成的细胞去除过滤器，

所述细胞去除过滤器填充有含抗氧化剂的填充液，且经辐射线灭菌，

所述抗凝血剂为选自由柠檬酸和其盐组成的组中的至少1种，

所述抗氧化剂为选自由焦亚硫酸钠、焦亚硫酸钾、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、次磷酸、抗坏血酸和抗坏血酸衍生物组成的组中的至少1种。

(2)上述(1)所述的抗氧化剂的用途，其中，所述填充液含有300ppm以上的焦亚硫酸钠。

(3)上述(1)或(2)所述的抗氧化剂的用途，其中，所述辐射线为γ射线或电子射线。

(4)一种HLA-DR阳性单核细胞选择去除器，其用于从含抗凝血剂的血液中选择性去除HLA-DR阳性单核细胞，

所述细胞去除过滤器填充有含抗氧化剂的填充液且经辐射线灭菌，

所述抗凝血剂为选自由柠檬酸和其盐组成的组中的至少1种，

(5)上述(4)所述的选择去除器，其中，所述填充液含有300ppm以上的焦亚硫酸钠。

(6)上述(4)或(5)所述的选择去除器，其中，所述辐射线为γ射线或电子射线。

(7)一种HLA-DR阳性单核细胞选择去除器，其具备：

与上游侧的第1流路和下游侧的第2流路连接的、填充有含抗氧化剂的填充液且经辐射线灭菌的细胞去除过滤器；和

与所述第1流路连接且可将含抗凝血剂的血液供给到所述细胞去除过滤器的、含有选自柠檬酸和其盐的至少1种抗凝血剂的容器。

(8)一种选择性去除HLA-DR阳性单核细胞的方法，其为使用具备由表面未改性的聚酯无纺布构成的细胞去除过滤器的选择去除器，从含抗凝血剂的血液中选择性去除HLA-DR阳性单核细胞的方法，其包含以下工序：

利用含抗氧化剂的填充液填充所述细胞去除过滤器的工序；

对填充有所述填充液的细胞去除过滤器进行辐射线灭菌的工序；和

将包含含柠檬酸或其盐的抗凝血剂的血液通液至所述过滤器装置进行过滤的工序，

所述抗凝血剂为选自由柠檬酸和其盐组成的组中的至少1种，

(9)上述(8)所述的方法，其中，所述填充液含有300ppm以上的焦亚硫酸钠。

(10)上述(8)或(9)所述的方法，其中，所述辐射线为γ射线或电子射线。

发明的效果

本发明能够提供可在临床上安全使用的HLA-DR阳性单核细胞选择去除器。

附图说明

图1表示本实施方式的选择去除器的一个例子的概略图。

附图标记说明

10选择去除器

20第1流路

30含有抗凝血剂的容器

40细胞去除过滤器

50送液泵

60第2流路

具体实施方式

以下详细地说明本发明的实施方式(以下称作本实施方式。)。需要说明的是，本发明并非限定于以下的实施方式，可以在其主旨范围内进行各种变形后实施。

本实施方式的抗氧化剂用于制造HLA-DR阳性单核细胞选择去除器的用途为，抗氧化剂用于制造从含抗凝血剂的血液中选择性去除HLA-DR阳性单核细胞的、HLA-DR阳性单核细胞选择去除器的用途，

所述抗凝血剂为选自由柠檬酸和其盐组成的组中的至少1种，

与以往的白细胞去除器相比，本实施方式中的HLA-DR阳性单核细胞选择去除器(以下有时仅记载为“选择去除器”。)，其HLA-DR阳性单核细胞的去除率特别地高，可用于从全血、血浆或红细胞制剂或者血小板制剂等血液来源制剂中选择性去除HLA-DR阳性单核细胞。

作为选择去除器使用的容器，只要是能够具备细胞去除过滤器的容器则无特别限定。

作为选择去除器并无特别限定，例如可举出以叠层状填充有细胞去除过滤器的容器、填充有卷绕成圆筒状的细胞去除过滤器的容器等。

选择去除器的容器形状并无特别限定，例如可举出圆柱状或者三棱柱状、四棱柱状、六棱柱状或八棱柱状等棱柱状等。

选择去除器的容器形状优选为圆筒状。作为优选的圆筒状选择去除器，可举出，特征在于血液的流向为从圆筒外周流向内侧、集中于最内侧并从血液流出口流出的容器。另外，还优选使用具有容器的截面积从血液的流入口至流出口变小的形状的容器等。

本实施方式中，选择去除器中还可设置用于在处理血液时或者洗涤选择去除器时使液体流入或流出的管、回路等。

作为选择去除器的容器的材质可以举出聚碳酸酯树脂等。

本实施方式的细胞去除过滤器由未将表面改性的聚酯无纺布构成。

通过使聚酯无纺布为叠层状的叠层体或者将聚酯无纺布卷绕成圆筒状，可制成细胞去除过滤器。

本实施方式的“未将表面改性的聚酯无纺布”是指为了使血液与聚酯直接接触而在无纺布的表面配置有聚酯，并且意味着未对聚酯无纺布的表面实施亲水化处理等。

亲水化处理例如可举出利用聚合物的涂布等。

本实施方式的聚酯无纺布中，由于聚酯无纺布的纤维径有助于其吸附、过滤的能力，因而优选使用具有有效平均纤维径的聚酯无纺布。

聚酯无纺布的纤维径过大时则接触效率降低、过小时则凝集块等堵塞物质的吸附量增加，从这一观点出发，聚酯无纺布的平均纤维径优选为0.5μm以上且50μm以下的范围内、更优选为1μm以上且40μm以下的范围内、进一步优选为1.5μm以上且35μm以下的范围内。

本实施方式的“平均纤维径”是指用以下方法求得的值。

从构成细胞去除过滤器的1张或多张聚酯无纺布中采样通过目视识别为实质上均一的部分。

在采样时，在聚酯无纺布中，将过滤血液时与血液透过的部分相对应的有效过滤截面积部分划分成边长为0.5cm的正方形，从中随机采样6个位置。进行随机采样时，例如通过在划分后的所有位置上指定序号，然后使用随机数表等的方法选择必要数量的区域来进行。对于采样的3个位置以上、优选5个以上的各区域，使用扫描型电子显微镜以放大倍率2500倍拍摄照片。

对采样的各区域的中央部分及其附近位置拍摄照片，直至拍于照片中的纤维总根数达到每个区域超过100根，测定纤维的直径。

直径是指相对于纤维轴呈直角方向的纤维的宽度。将所测定的全部纤维的直径之和除以纤维数得到的值作为平均纤维径。

其中，在纤维的宽度的测定中，不考虑这些情况下得到的数据：

由于多个纤维相互重叠而被其他纤维遮挡，从而无法测定纤维宽度的情况；多个纤维由于熔融等而变成较粗的纤维的情况；直径明显不同的纤维混存的情况等。

“由于多个纤维相互重叠而被其他纤维遮挡，从而无法测定纤维宽度的情况”是指，在扫描电子显微镜照片中被遮挡的情况；“多个纤维由于熔融等而变成较粗的纤维的情况”是指，熔融成纤维径为其他纤维的平均值的1.5倍以上的纤维等的情况；“直径明显不同的纤维混存的情况”是指，纤维径为其他纤维的平均值的2倍以上的情况。

从抑制堵塞、防止压力损失的上升、使流动顺畅的观点出发，聚酯无纺布的单位面积重量优选为20g/cm²以上且110g/cm²以下、更优选为60g/cm²以上且100g/cm²以下。

本实施方式的“细胞去除过滤器在容器中的填充密度”是指将细胞去除过滤器填充于容器中时的每一定体积的重量，细胞去除过滤器在容器中的填充密度优选为0.01g/cm³以上且0.5g/cm³以下。从提高与血液样品的接触效率、抑制堵塞、防止压损的上升、使流动顺畅的观点出发，该填充密度更优选为0.03g/cm³以上且0.3g/cm³以下。

本实施方式的细胞去除过滤器中填充有含抗氧化剂的填充液。

本实施方式中的“抗氧化剂”是指，具有易于向其他分子等给予电子的性质的原子、分子或离子，抗氧化剂具有抑制细胞去除过滤器的受到氧的作用而导致的变化的性质。

抗氧化剂为选自由焦亚硫酸钠、焦亚硫酸钾、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、次磷酸、抗坏血酸、和抗坏血酸衍生物组成的组中的至少1种。

作为抗坏血酸衍生物并无特别限定，例如可举出5-甲基-3，4-二羟基涤特纶(5-methyl-3，4-dihydroxytetoron，MDT)等。

抗氧化剂可使用1种也可混合使用2种以上。

从处理性、安全性的观点出发，抗氧化剂优选焦亚硫酸钠。

本实施方式中的“细胞去除过滤器填充有填充液”是指，填充液保持与细胞去除过滤器接触、细胞去除过滤器浸渍于填充液中的状态。

本实施方式中的“填充液”是指，在选择去除器的制造阶段填充于选择去除器内部的液体，在填充液中添加有抗氧化剂。

含抗氧化剂的填充液可如下制作：将抗氧化剂直接添加于水或生理食盐水等生理溶液等填充液中进行溶解，或者将抗氧化剂预先溶解于少量的醇等溶剂中并将所得溶液添加于填充液中，从而制作而成。

对于含抗氧化剂的溶液中的抗氧化剂的浓度，由选择去除器所使用的抗氧化剂的种类和灭菌条件决定其最佳浓度，优选为100ppm以上且1000ppm以下、更优选为300ppm以上且1000ppm以下。

本实施方式中的“辐射线灭菌”是指，将填充有填充液的细胞去除过滤器中存在的微生物杀灭或去除。

本实施方式中的“辐射线”是指，包括α射线、β射线、中子束或电子射线等粒子束，X射线或γ射线等电磁波在内的电离辐射线，从常用于医疗用具的灭菌的观点出发，辐射线优选为电子射线或γ射线。

电子射线为带电粒子束，带电粒子束对照射对象物质的原子的轨道电子或被分子束缚的电子直接作用电力，引起电离。

γ射线借助与照射对象物质的原子或原子核的相互作用而产生带电粒子束，二次产生的带电粒子束具有电离作用。

本实施方式的利用电子射线和γ射线的微生物的灭菌效果是通过电离作用产生的自由基损伤微生物的DNA链，从而阻碍细胞分裂能力，基本的灭菌原理是相同的。

辐射线灭菌所使用的辐射线的照射剂量根据选择去除器中存在的细菌的种类、细菌的数量或者想获得的无菌性保证水平等而不同，可以通过测定D值或者实施有效性检查等而分别决定，优选通常使用的10kGy以上且100kGy以下，其中优选10kGy以上且50kGy以下、特别优选15kGy以上且40kGy以下。

本实施方式的“D值”是指将特定微生物数量的90％杀死或者使特定微生物数量减少至1/10的灭菌处理单位(时间或吸收剂量等)。

与γ射线相比，电子射线由于在短时间内完成一定剂量的照射，因而单位时间的照射剂量(剂量率)高，自由基的产生量一般较少，因此有能够降低照射对象物质的氧化劣化的倾向。认为其原因在于，剂量率高时，则氧在表面被消耗，还没有扩散到内部时即被完全消耗。

认为电子射线灭菌时的聚酯的分解可能比γ射线灭菌时减少，但并不是不产生自由基。

通过使用本实施方式的HLA-DR阳性单核细胞选择去除器，能够从含抗凝血剂的血液中选择性去除HLA-DR阳性单核细胞。通过选择性去除HLA-DR阳性单核细胞，与以往的白细胞去除的治疗效果相比，效率更为提高。

本实施方式中的“HLA-DR阳性细胞”是指，人血液成分白细胞中的、细胞表面表达有HLA-DR抗原的血细胞。

本实施方式中的“HLA-DR阳性单核细胞”是指为单核细胞的HLA-DR阳性细胞，“HLA-DR阳性B细胞”是指为B细胞的HLA-DR阳性细胞。

本实施方式中的“含抗凝血剂的血液”是指，在从人体采集的新鲜血液中混合抗凝血剂后的血液。

本实施方式中的“能够选择性去除HLA-DR阳性单核细胞”是指，所去除的HLA-DR阳性单核细胞在所去除的白细胞中所占的比例为12％以上。

本实施方式中的抗凝血剂为选自由柠檬酸或其盐组成的组中的至少1种。

作为抗凝血剂并无特别限定，例如可举出柠檬酸钠溶液、ACD-A液、CPD液等。ACD-A(acid-citrate-dextrose)液是由柠檬酸钠、柠檬酸和葡萄糖组成的溶液；CPD(citrate-phosphate-dextrose)液是指柠檬酸钠、柠檬酸、葡萄糖和磷酸二氢钠二水合物组成的溶液。

抗凝血剂可使用1种，还可混合使用2种以上。

优选的是，本实施方式的HLA-DR阳性单核细胞选择去除器具备：与上游侧的第1流路和下游侧的第2流路连接的、填充有含抗氧化剂的填充液且经辐射线灭菌的细胞去除过滤器；与所述第1流路连接且能够将含抗凝血剂的血液供给至所述细胞去除过滤器的、含有选自由柠檬酸和其盐组成的组中的至少1种抗凝血剂的容器。

选择去除器10例如为图1所记载的构成。第1流路20为连接含抗凝血剂的容器30和细胞去除过滤器40的流路。第1流路20安装于送液泵50上，可以将从患者采集的血液送液至细胞去除过滤器40。储存于容器30中的抗凝血剂被供给至第1流路20、与流过第1流路20的血液相混合。然后，该含抗凝血剂的血液被导入到细胞去除过滤器40进行过滤。第2流路60为将通过细胞去除过滤器过滤后的血液导出至细胞去除过滤器外的流路。

本实施方式的从含抗凝血剂的血液中选择性去除HLA-DR阳性单核细胞的方法为，通过使用具备由表面未改性的聚酯无纺布构成的细胞去除过滤器的选择去除器，从而能够从血液中选择性去除HLA-DR阳性单核细胞的方法，其包含以下工序：

利用含抗氧化剂的填充液填充所述细胞去除过滤器的工序；

对所述填充有填充液的细胞去除过滤器进行辐射线灭菌的工序；和

将包含含柠檬酸或其盐的抗凝血剂的血液通液至所述过滤器装置进行过滤的工序。

本实施方式的第一工序为，通过向选择去除器内通液填充液而填充细胞去除过滤器的工序。

本实施方式的第二工序为，在填充液的存在下对通过第一工序而填充有填充液的细胞去除过滤器进行辐射线灭菌的工序。

辐射线灭菌的方法并无特别限定，例如可举出对HLA-DR阳性单核细胞选择去除器进行包装后实施照射的方法等。

对辐射线灭菌装置并无特别限定，例如可举出JS9500型辐射线灭菌装置(AECL公司)等。

本实施方式的第三工序为将含抗凝血剂的血液通液至通过第二工序进行了辐射线灭菌的细胞去除过滤器中进行过滤的工序。

通过用细胞去除过滤器对血液进行过滤，可以将HLA-DR阳性单核细胞捕获于细胞去除过滤器中，从而选择性去除HLA-DR阳性单核细胞。

本实施方式中，在第三工序中进行通液血液之前将填充液中的抗氧化剂去除，优选预先对细胞去除过滤器进行洗涤。洗涤所使用的溶液只要是生理性溶液则可以使用各种溶液。另外，为了抑制对血液凝固因子的刺激，可以使用在生理性溶液中添加有抗凝血剂的溶液，其中可优选使用生理食盐水或在生理食盐水中添加有抗凝血剂的溶液。

通过使用本实施方式的选择去除器，可以制造从血液中将HLA-DR阳性单核细胞选择性去除的血液。

本实施方式中，制造选择性去除了HLA-DR阳性单核细胞的血液的方法包含以下工序：

利用含抗氧化剂的填充液填充细胞去除过滤器的工序、

对填充有填充液的细胞去除过滤器进行辐射线灭菌的工序；和

将包含含柠檬酸或其盐的抗凝血剂的血液通液至过滤器装置进行过滤的工序。

本实施方式的抗氧化剂用于制造HLA-DR阳性单核细胞选择去除器的用途中，所述含抗氧化剂的填充液优选为含300ppm以上焦亚硫酸钠的填充液。

本实施方式的抗氧化剂用于制造HLA-DR阳性单核细胞选择去除器的用途中，所述辐射线优选为γ射线或电子射线。

本实施方式中，对于HLA-DR阳性单核细胞选择去除器在临床上的使用状况，可以考虑以下状况，但并无特别限定。

以类风湿关节炎患者或溃疡性结肠炎患者为对象在临床上使用时，优选每周用HLA-DR阳性单核细胞选择去除器对3L血液处理一次，共计重复5次。

本实施方式中，对3L血液进行处理是指如下进行处理。

首先，向与采血回路、送液泵、返血回路连接的HLA-DR阳性单核细胞选择去除器内流入1L与采血回路连接的生理性溶液。接着，使500mL添加有抗凝血剂的生理性溶液流入HLA-DR阳性单核细胞选择去除器。

接着，将采血回路连接于患者的肘静脉等，将返血回路连接于患者的其他肘静脉等。在采血回路的分支处连接与加入有抗凝剂的生理性溶液相连的导管。

以50mL/min的流速启动送液泵1小时，使3L添加有含抗凝血剂的生理性溶液的血液通入选择去除器。3L血液通过完后，将生理性溶液与采血回路连接，使500mL生理性溶液流入选择去除器后，将血液返回至患者。

作为含抗凝血剂的生理性溶液的添加方法并无特别限定，例如可举出，以相对于1容量的含4％(w/v)柠檬酸钠的生理性溶液，血液为5～40容量的方式启动泵，从而在血液中添加生理性溶液的方法等。

采血回路由可连接于肘静脉等的血液的导入部及连接血液导入部和选择去除器的导管构成，具有与连接于含抗凝血剂的生理性溶液的导管的分支。在连接于含抗凝血剂的生理性溶液的导管上连接有可与采血回路分开控制的送液泵。

本实施方式的“血液的导入部”是指将血液导入至导管的部分。

作为血液的导入部并无特别限定，例如可举出穿线针(spike needle)、采血针等。

导管只要是能够送液血液和生理性溶液等且可对生物体安全地进行送液的导管，则可以使用任意的导管。另外，导管的材质只要是不会由于血液和生理性溶液等溶液而溶出有害物质的材质，则可以使用任何一种材质。

作为导管并无特别限定，例如可举出氯乙烯、硅、聚丙烯、聚乙烯等。从强度的观点出发，导管优选使用氯乙烯，作为氯乙烯的具体例子可举出LC-3000N(旭化成可乐丽医疗株式会社)。

送液泵只要是送液装置即可，可以利用使用了泵等的所有公知的装置。泵的构造优选使用滚柱泵(roller pump)、手指式泵(finger pump)等，优选可在20mL/min～300mL/min的流速范围内精度良好地进行送液的泵。作为泵的具体例子，可举出plusauto LC(旭化成可乐丽医疗株式会社)。

本实施方式中的“生理性溶液”是指与体液基本等渗的溶液，按照活细胞或组织尽可能维持正常生理机能的方式调制的溶液。

作为生理性溶液并无特别限定，例如可举出生理食盐液(包含生理食盐水)、林格液(Ringer’s solution)、乳酸林格液、醋酸林格液、台罗德氏液(Tyrode’s solution)等生理性盐类溶液；含葡萄糖、葡聚糖、肝素等糖类的溶液；含抗凝剂的溶液等。

作为生理性溶液，还优选使用对至少添加有1种以上的上述示例的生理性盐类溶液、含糖类溶液、含抗凝剂的溶液等的混合液进行稀释得到的溶液。

生理性溶液可使用1种，还可制成以任意比例混合有2种以上的混合液进行使用，其中可使用生理食盐液。

本实施方式中，通过用HLA-DR阳性单核细胞选择去除器对从患者采集的血液进行处理，可获得选择性去除了HLA-DR阳性单核细胞的血液制剂。

作为从患者采集的血液并无特别限定，例如可举出全血、血浆或者红细胞制剂或血小板制剂等血液来源制剂等。

实施例

以下通过实施例和比较例进一步具体地说明本实施方式，本实施方式并非仅限定于这些实施例。

[实施例1]

将聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)无纺布(平均纤维径2.3μm、单位面积重量90g/m²、厚度0.45mm)剪切成直径6.8mm的圆状，重叠11张而制成细胞去除过滤器，将该细胞去除过滤器层叠在直径6.8mm、容器容量1mL的聚乙烯制的柱中(Movicol(注册商标)、モビテツク公司)(填充密度0.14g/cm³)。用焦亚硫酸钠水溶液(焦亚硫酸钠：林纯药)填充柱内，将该柱放入纸壳箱中进行包装，并照射25kGy的γ射线进行灭菌处理。将所得的圆柱作为选择去除器。水溶液中焦亚硫酸钠的浓度为800ppm。

从健康人志愿者采集血液，向其中添加作为抗凝血剂的含有4％(w/v)柠檬酸钠水合物的柠檬酸钠液(Citramin(注册商标)、扶桑药品)，使得柠檬酸钠液为9.1％(v/v)，将所得的人新鲜血液(柠檬酸钠水合物的最终浓度为0.36g/100mL)作为过滤前样品。

通过通液生理食盐水(大塚生食注(注册商标)、大塚制药)对灭菌过的选择去除器进行洗涤，以0.18mL/分钟对过滤前样品过滤10分钟。将此时从出口流出的血液作为过滤后样品，用于以下的测定。

使用自动血球数测定装置(Sysmex SF-3000(东亚医用电子制))测定过滤前后的白细胞浓度，由下式(1)计算白细胞去除率。

式(1)：

白细胞去除率(％)＝[1-(过滤后白细胞浓度/过滤前白细胞浓度)]×100

[比较例1]

除了填充水(不含焦亚硫酸钠)作为填充液之外，通过与实施例1相同的方法获得白细胞去除器。

添加作为抗凝血剂的含有10mg/100mL甲磺酸萘莫司他的溶液，使得甲磺酸萘莫司他溶液(Futhan(注册商标)、鸟居药品、以下相同。)为12％(v/v)，将所得的人新鲜血液(甲磺酸萘莫司他的最终浓度为1.2mg/100mL)作为过滤前样品。使用上述白细胞去除器，利用与实施例1相同的方法对过滤前样品进行过滤。测定白细胞浓度，计算白细胞去除率。

[比较例2]

添加作为抗凝血剂的含有10mg/100mL甲磺酸萘莫司他的溶液，使得甲磺酸萘莫司他溶液为12％(v/v)，将所得的人新鲜血液(甲磺酸萘莫司他的最终浓度为1.2mg/100mL)作为过滤前样品。使用实施例1的选择去除器，利用与实施例1相同的方法对过滤前样品进行过滤。测定白细胞浓度，计算白细胞去除率。

[比较例3]

除了使用与比较例1同样地制作的白细胞去除器之外，利用与实施例1相同的方法对过滤前样品进行过滤。测定白细胞浓度，计算白细胞去除率。

[实施例2～4]

除了在与实施例1同样制作的柱内填充100ppm、300ppm或1000ppm的焦亚硫酸钠水溶液之外，利用与实施例1相同的方法计算白细胞去除率。

[实施例5]

将按照以12％(v/v)含有作为抗凝血剂的ACD-A液(含有0.8％柠檬酸、2.2％柠檬酸钠、2.2％葡萄糖溶液，テルモ社)的方式添加了ACD-A液的人新鲜血液作为过滤前样品。使用实施例1的选择去除器，利用与实施例1相同的方法对过滤前样品进行过滤。测定白细胞浓度，计算白细胞去除率。

将实施例1～5和比较例1～3的结果示于表1。

本实施方式中使用的HLA-DR阳性单核细胞的选择性去除的试验方法如下所述。

[试验例1]

使过滤前、过滤后样品分别与进行了荧光标记的抗HLA-DR抗体(BECTON，DICKINSON AND COMPANY.)反应，利用流式细胞仪(FACS Calibur、BECTON，DICKINSON AND COMPANY.)进行分析。将与抗HLA-DR抗体反应的细胞作为HLA-DR阳性细胞，计算各样品的HLA-DR阳性细胞浓度。

通过下式(2)计算各实施例和比较例中所去除的HLA-DR阳性细胞在所去除的白细胞中所占的比例。

式(2)：

所去除的HLA-DR阳性细胞在所去除的白细胞中所占的比例(％)＝(过滤前HLA-DR阳性细胞浓度-过滤后HLA-DR阳性细胞浓度)/(过滤前白细胞浓度-过滤后白细胞浓度)×100

在实施例1～5中所去除的HLA-DR阳性细胞在所去除的白细胞中所占的比例分别为20.8％、17.2％、19.5％、26.9％、15.7％。此外，在比较例1～3中分别为7.5％、7.5％、16.0％。

对于计算出的比例，将以比较例1的值为1.0时的结果示于表1。

[表1]

[试验例2]

与试验例1同样地，使样品分别与进行了荧光标记的抗HLA-DR抗体、抗CD 14抗体(BECTON，DICKINS ON AND COMPANY.)反应，利用流式细胞仪进行分析。将与抗HLA-DR抗体和抗CD 14抗体反应的细胞作为HLA-DR阳性细胞，计算各样品的HLA-DR阳性单核细胞浓度。

通过下式(3)计算各实施例和比较例中所去除的HLA-DR阳性单核细胞在所去除的白细胞中所占的比例。

式(3)：

所去除的HLA-DR阳性单核细胞在所去除的白细胞中所占的比例(％)＝(过滤前HLA-DR阳性单核细胞浓度-过滤后HLA-DR阳性单核细胞浓度)/(过滤前白细胞浓度-过滤后白细胞浓度)×100

在实施例1～5中，所去除的HLA-DR阳性单核细胞在所去除的白细胞中所占的比例分别为18.3％、12.2％、16.5％、28.4％、18.6％。在比较例1～3中分别为8.7％、8.7％、10.3％。

对于计算出的比例，将以比较例1的值为1.0时的结果示于表2。

[表2]

[试验例3]

与试验例1同样地使样品分别与进行了荧光标记的抗HLA-DR抗体、抗CD19抗体(BECTON，DICKINSON AND COMPANY.)反应，利用流式细胞仪进行分析。将与抗HLA-DR抗体和抗CD 19抗体反应的细胞作为HLA-DR阳性B细胞，计算各样品的HLA-DR阳性B细胞浓度。

通过下式(4)计算各实施例和比较例中所去除的HLA-DR阳性B细胞在所去除的白细胞中所占的比例。

式(4)：

所去除的HLA-DR阳性B细胞在所去除的白细胞中所占的比例(％)＝(过滤前HLA-DR阳性B细胞浓度-过滤后HLA-DR阳性B细胞浓度)/(过滤前白细胞浓度-过滤后白细胞浓度)×100

在实施例1～5中所去除的HLA-DR阳性B细胞在所去除的白细胞中所占的比例分别为24.6％、24.6％、24.6％、24.6％、24.8％。此外，在比较例1～3中分别为5.6％、5.6％、24.6％。

对于计算出的所去除的各组分在所去除的白细胞中所占的比例，将以比较例1的值为1.0时的结果示于表3。

[表3]

由表1～3的结果可知，在含焦亚硫酸钠的填充液的存在下对选择去除器进行γ射线灭菌，并在含柠檬酸和/或柠檬酸钠的抗凝血剂的存在下对血液进行处理的实施例1～5中，HLA-DR阳性单核细胞被选择性去除。

推测HLA-DR阳性单核细胞的选择性去除与柠檬酸和/或柠檬酸盐的钙螯合作用所导致的细胞的粘结能力降低有关。

另外认为，由于填充液的抗氧化作用使得无纺布表面的负电荷减少，结果，使得对HLA-DR阳性单核细胞的选择性增加。

本申请是基于2008年11月25日申请的日本专利申请(日本特愿2008-300176号)而完成的，其内容作为参照援引于此。

产业上的可利用性

本发明的HLA-DR阳性单核细胞选择去除器可用于选择性去除HLA-DR阳性单核细胞。

本发明的抗氧化剂用于制造HLA-DR阳性单核细胞选择去除器的用途、HLA-DR阳性单核细胞选择去除器和选择性去除HLA-DR阳性单核细胞的方法在全身性红斑狼疮、类风湿关节炎(包含恶性类风湿关节炎)、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、克罗恩病等自身免疫性疾病、白血病等治疗中具有产业上的可利用性。

Claims

1.一种抗氧化剂用于制造HLA-DR阳性单核细胞选择去除器的用途，该HLA-DR阳性单核细胞选择去除器从含抗凝血剂的血液中选择性去除HLA-DR阳性单核细胞，

所述抗凝血剂为选自由柠檬酸和其盐组成的组中的至少1种，

2.根据权利要求1所述的抗氧化剂的用途，其中，所述填充液含有300ppm以上的焦亚硫酸钠。

3.根据权利要求1或2所述的抗氧化剂的用途，其中，所述辐射线为γ射线或电子射线。

4.一种HLA-DR阳性单核细胞选择去除器，其用于从含抗凝血剂的血液中选择性去除HLA-DR阳性单核细胞，

所述抗凝血剂为选自由柠檬酸和其盐组成的组中的至少1种，

5.根据权利要求4所述的选择去除器，其中，所述填充液含有300ppm以上的焦亚硫酸钠。

6.根据权利要求4或5所述的选择去除器，其中，所述辐射线为γ射线或电子射线。

7.一种HLA-DR阳性单核细胞选择去除器，其具备：

与所述第1流路连接且可将含抗凝血剂的血液供给到所述细胞去除过滤器的、含有选自由柠檬酸和其盐组成的组中的至少1种抗凝血剂的容器。