CN102216772A

CN102216772A - 用于固体生物对象的分析的方法

Info

Publication number: CN102216772A
Application number: CN2009801461623A
Authority: CN
Inventors: K·爱迪生; M·马尔姆奎斯特
Original assignee: Individual
Current assignee: Ridgeview Instruments AB
Priority date: 2008-09-19
Filing date: 2009-09-08
Publication date: 2011-10-12
Anticipated expiration: 2029-09-08
Also published as: EP2331953A4; US8709828B2; US20110195434A1; EP2331953B1; JP5433698B2; CN102216772B; WO2010033069A1; EP2331953A1; DK2331953T3; JP2012503196A

Abstract

本发明涉及一种分析或诊断固体对象的方法。该方法基于实时检测预定义的探针（111）如何与存在于固体对象（112）上或固体对象（112）中的结构相互作用、与计算所记录的所述探针的结合曲线（131）就相互作用性质（141）而言如何分布组合。相互作用性质被输入到自动确定固体对象的状态的分类算法（151）。该方法对于像与抗体探针组合的组织切片的固体生物对象而言特别有利，所述抗体识别在所述组织切片上已知在疾病状态中是过表达的受体。

Description

用于固体生物对象的分析的方法

技术领域

本发明涉及用于分析或诊断目的的固体对象的分析领域。更特别地，本发明涉及一种对生物来源（origin）的一个或多个固体对象就所述对象中的预定义结构的存在与数量进行分析的方法。甚至更特别地，本发明涉及通过分析在来自有机体的组织中的预定义结构的存在和数量来诊断疾病或机能障碍。

背景技术

在现代社会中的很多功能中分析和诊断过程是至关重要的。最普遍的一种是以确定病人是否有特别疾病为目的在健康护理机构（例如医院）执行的诊断过程。例如，男性血液中的提高的前列腺特异抗原（PSA）浓度是病人中正在发生的前列腺癌症的指示。然而，这不够特异，并且需要更好的方法来分析PSA的不同修饰（modification）以基于分析结果而改进临床决定。其他分析或诊断过程包括但不限于基于对染色组织活检的目镜分析的癌症诊断、为了生产安全的食品而在宰杀之前对牲畜的诊断、以治疗患病动物为目的的兽医科学中的诊断过程、对人或动物中的肿瘤的靶向放疗、对食品或饲料中的病原体或毒素的检测、对经处理的食品或饲料中的营养补充物（例如维生素）浓度的确定、对环境中的危险化学品的检测、等等。

每当固体对象结构是复合物，多数当前所使用的方法必须使用高度特异的试剂以放大来自复合物样本中的一种成分的信号。这样的复合物结构可以是组织中或者体液中的细胞上的细胞表面。还有其他类型的复合物结构是其中各个蛋白质改变了构型或者可以通过转译后修饰所修饰的蛋白质复合物。

用于诊断的一种特别方法是免疫组织化学法（IHC）。诊断IHC过程被发展用于多种疾病，最著名地用于癌症。简言之，IHC是如下的方法：其中将薄的组织切片放置于显微镜玻璃载片上，接着是对选定的受体染色。由染色的组织切片制成图像，并且受过训练的操作者判断该组织是否包含指示疾病的染色模式（pattern）。尽管IHC被全世界使用并且改进了诊断像癌症的严重疾病的可能性，但是一般的IHC方法学仍遭受差的可重复性和长的组织制备协议（protocol）（如由Allen M Gown在Modern Pathology 2008 May;21 Suppl 2:S8-S15中发表的报告“Current issues in ER and HER2 testing by IHC in breast cancer.”中显而易见的，该报告通过引用并入本文）。

免疫组织化学法是用于分析组织切片的主要方法之一。在大多数主要医院中被使用，它对于组织分析领域的技术人员而言是公知方法。简言之，IHC是一种用于通过使用与生物组织中的抗原特异结合（bind）的抗体来定位组织部分的细胞中的蛋白质的方法。IHC染色在诸如肿瘤的异常组织的诊断中是常用的。组织中的细胞中或细胞上的特异分子结构是指示疾病的特别细胞事件的特性。为了使抗体-抗原相互作用可视化，抗体可以被附到荧光基团诸如FITC（异硫氰酸荧光素）、罗丹明、Texas Red（德克萨斯红）或者任何其他荧光部分（moiety）。在该过程中，取得感兴趣的组织的薄（典型地为20μm）切片。随后通常通过使用去污剂（例如Triton X-100）来处理该组织以使膜（membrane）破裂。在这些步骤之后，制备组织切片以用于典型地遵循间接法的抗体治疗。该间接法涉及与组织抗原起反应的初级（未标记）抗体以及与初级抗体起反应的次级（标记）抗体。次级抗体通常标记有荧光部分或者酶。IHC是有力的检测技术并且能够精确示出给定的蛋白质位于组织样本的什么地方。IHC在很多生物学领域中广泛使用，例如在神经科学中使得研究者能够检查在特异大脑结构内的蛋白质表达以及在诊断外科病理学中用于测定肿瘤的类型（例如，癌瘤对黑素瘤）。IHC分析的结果总是为包含特定目标受体的区域以可区别颜色染色的组织切片的图像。照此，IHC是终点测量，即其仅可能检测在一个时间点处抗体-抗原相互作用的状态。IHC也遭受图像的经常人工解释；受过训练的操作者对完全相同组织载片的染色范围和强度可能有不同看法，导致了在操作者和实验室之间（across）比较结果时的不确定性。IHC的另一个主要缺点是不可能在IHC中示出该染色与感兴趣的蛋白质相对应。临床实践中所使用的IHC的描述在由Press MF、Sauter G、Bernstein L、Villalobos IE、Mirlacher M、Zhou JY、Wardeh R、Li YT、Guzman R、Ma Y、Sullivan-Halley J、Santiago A、Park JM、Riva A、Slamon DJ在Clinical Cancer Research 2005 Sep 15; 11 (18): 6598-607中发表的报告“Diagnostic evaluation of HER-2 as a molecular target: an assessment of accuracy and reproducibility of laboratory testing in large, prospective, randomized clinical trials”中可获得，该报告通过引用并入本文。

发明内容

本发明的一个目标是便于固体对象的分析或诊断，其中所述分析包括使用与所述对象上的结构相互作用的一个或多个探针。本发明对于通过使用生物或化学来源的探针来分析生物来源的固体对象而言特别有用。

本发明特别涉及一种改进的分析或诊断固体对象的方法。该方法基于实时检测预定义的探针如何与存在于固体对象上或固体对象中的结构相互作用、与计算所记录的所述探针的结合曲线就相互作用性质而言如何分布组合。相互作用性质的分布被用作固体对象的指纹，并且所述指纹包含指示固体对象的状态的不同特征。对该指纹应用分类算法以自动确定固体对象的状态。该方法对于像与抗体探针组合的组织切片的固体生物对象而言特别有利，所述抗体识别在所述组织切片上已知在疾病状态中是过表达的受体结构。该方法因此将通过使用探针如何与固体表面相互作用的信息来定义固体表面而改进通常所执行的分析和诊断过程。

因此，在一个方面中，本发明提供了一种能够将固体对象分类为预定义的类别（诸如恶性/良性、好/坏的治疗预测、可接受的/不可接受的质量等）的分析方法。

该方法包括提供一种其上附接有固体对象的固体支撑物以及一种包含一个或多个探针的溶液，并且提供对探针与固体对象之间的相互作用的存在的检测与对探针和固体对象的复合物的形成速率的检测。来自所述检测的输出首先被变换为示出结合的探针量相对于时间的图表（也被称为结合曲线）。使用表示探针-对象相互作用的结合曲线，计算相互作用性质的分布。相互作用性质的分布被用作固体对象的指纹，所述指纹携带不同特征，所述不同特征对于建立用于将固体对象分类为恶性/良性、好/差的治疗预测、可接受的/不可接受的质量等等的标准而言有用。在权利要求1中定义了根据本发明的方法。

因而，在第一方面中本发明提供了一种用于测量可用于分析或诊断过程中的固体对象的性质的方法，该方法包括：提供一个或多个探针，所述探针能够与所讨论的固体对象上的结构相互作用以形成探针-对象复合物；将固体对象附接于固体支撑物；提供感兴趣的探针的溶液，使所述溶液与附接于支撑物的固体对象相接触，检测探针与固体对象之间的相互作用的存在以及探针-对象复合物的形成速率以形成表示与固体对象结合的探针量随时间的曲线；用原始（primitive）结合曲线的预定义集合中的所有原始曲线的加权和来逼近所述曲线，计算每个原始结合曲线的权重，从而所述权重使所检测的结合曲线与加权的原始结合曲线和之间的差异最小化；并且通过使用单独地或者与另外的数据组合地基于所述权重的标准，将用于分析或诊断过程中的所述固体对象进行分类。

在优选的实施例中，本发明包括在不使检测器与所述固体支撑物相接触的情况下执行所述检测。

在更加优选的实施例中，所述检测器是放射性检测器或者荧光检测器。

适当地，原始结合曲线和对应权重的数量至少是九。

在其他实施例中，所述探针选自蛋白质、脱氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）和有机化合物，所述探针可能标记有放射性或者荧光部分。

此外，所述固体对象可以选自哺乳动物组织或者生物来源的对象。

在另外的方面中，本发明提供了一种用于基于来自根据权利要求1中所定义的方法的分析的结果进行诊断的方法。

在又另外的方面中，本发明也涉及一种探针的工具包（kit），所述探针可用于通过使用根据本发明的方法而对固体对象进行质量控制或者诊断。

附图说明

参考附图，在下面的示例和描述中将更详细地公开本发明，在所述附图中：

图1是本发明的方法的示意性表示；

图2示出了现有技术中已知的用于执行质量控制方法中的测量的适当器械；

图3说明了作为相互作用图的结合曲线的表示；

图4示出了对于与相同固体对象结合的相似探针所得到的两个相互作用图的比较。

图5示出了对于与相似固体对象结合的相同探针所得到的两个相互作用图的比较；以及

图6示出了对于与相似固体对象结合的相同探针所得到的四个相互作用图的比较。

图7示出了对于与相似固体对象结合的相同探针所得到的六个相互作用图的比较。

具体实施方式

为了本申请的目的并且为清晰起见，待分析的固体对象附接于固体支撑物，并且被设计为与固体对象上的结构相互作用的预定义探针存在于与所述固体支撑物相接触的液体中。可能的固体对象包括但不限于组织样本、嵌入的组织样本及其部分、细胞、细菌、病毒、磁粒子、表面涂层（例如涂料）、多细胞有机体（活的或死的）、设计用于植入在有机体中的材料（例如，钛螺钉、陶瓷板及相似物）或者其任意组合。固体对象薄于10mm，并且典型地薄于1mm。固体对象还具有小于100cm²的面积并且典型地所述面积大于1mm²并且小于10cm²。

所述固体对象到所述固体支撑物的附接典型地是牢固的附接，像共价结合的蛋白质、在固体支撑物上生长的粘细胞、或者粘到固体支撑物上的非生物对象（仅举几例）。然而，可能使用弱附接的固体对象，其中附接的方法通过例如静电相互作用、疏水性相互作用以及以高粘性凝胶捕获固体对象（仅举几种可能性）而促成（mediate）。

在本发明中所使用的探针必须具有两个特性性质：首先，探针必须附接于在待检查的固体对象中所搜索的结构或者与该结构相互作用。其次，必须可能以时间分辨的方式检测到探针与所述固体对象相互作用。用于生物对象的典型探针可以是已知与特定受体特异相互作用的蛋白质，预先已知所述受体在生物对象中的存在指示了疾病。所述探针可以还具有为了简单地检测与所述生物对象结合的探针量而附接的荧光标签（例如，FITC、Cy2、Cy3、Cy5、德克萨斯红或任何其他荧光标签）。用于分析或诊断过程中的可能探针包括但不限于大分子（例如蛋白质、DNA、RNA）、抗体、适体、亲和体（affibody）、纳米体、肽和其他化学化合物以及任何可以溶解于液体中的种类（species）或者甚至是可以悬浮于液体中的细胞、细胞器、有机体或粒子。关于探针的要求是其可以溶解或悬浮于液体中并且其（在正常重力的影响下）在24小时内不沉淀。探针可以附接有某种标记。适当的标记包括但不限于放射性标记和荧光标记。

术语原始结合曲线在本上下文中定义为表示根据预定义相互作用模型进行结合的过程的曲线，给定一些（典型地小于10个）相互作用性质来计算所述原始结合曲线。原始结合曲线族的示例是来自单价相互作用模型的曲线，其中给定结合速率（association rate）常数k_a、离解速率（dissociation rate）常数k_d和在饱和的固体支撑物处的信号R_MAX，可以计算每个原始结合曲线。

本发明还包括一种通过该方法用于分析或诊断过程的探针或固体支撑物的工具包。

通常，本发明在其第一方面中基于五个特性成分的规定。这五个方面是：

●适用于分析或诊断测量的一个或多个探针，可能标记有可检测的标志，

●待研究的固体对象，

●对探针和固体对象之间的相互作用的时间分辨测量，

●用于表示时间分辨测量的方法，其中所述表示提供了探针与固体对象的相互作用的本质的多维指纹，

●对所述指纹应用分类算法以得到关于对象状态的陈述。

本发明目的尤其（i.a.）是通过为经典的分类算法提供相互作用图作为输入来改进对用于分析或者诊断过程中的固体对象的分类。在一些分析或诊断过程中，通过固体支撑物中的相关结构的相对分数（relative fraction）来构成固体对象的有利状态（例如，可接受的质量或者良性肿瘤）和不利状态（例如，不可接受的质量或者恶性肿瘤）之间的差异。在肿瘤学中，已知特定受体的过表达指示疾病，这实际上是细胞的受体过多的相对丰度的变更。在药物发现中，潜在药物为了到达细胞内的目标受体而通过细胞膜的输送是对潜在药物和用作固体对象的细胞培养物或组织的重要质量度量。在设计用于植入在人类病人中的对象中，被植入的对象的表面应当是生物相容的。在非生物来源的其他对象中，表面多孔性和表面的氧化程度对于对象的质量或性能而言可能是不可缺少的。

尽管本发明被描述为分析探针和固体对象之间的结合事件，但是本发明不一定专门用于该实验布置（set-up）中。例如，可能使用诸如铬的痕量元素作为探针。对固体对象中的⁵¹Cr的直接、实时的检测先前已在WO2009029039中公开，所述WO2009029039通过引用并入本文。还可能测量固体对象在探针的影响下的固有来源的事件（诸如固体对象两端的电阻、阻抗或电容）。例如，可以用作为能量补充的不同糖分子（例如果糖、蔗糖和葡萄糖）的存在来测量单层细胞两端的阻抗随时间的改变。在该情况下，单层细胞是固体对象而不同的糖分子是不同的探针。

用于分析或诊断目的的方法可以被描述为图1中所概述的五步骤过程。在第一步骤（110）中，固体对象（112）附接于固体支撑物（113），并且使溶解于液体中的适当探针（111）可用。在第二步骤（120）中，使包含探针（111）的液体与固体支撑物（113）和固体对象（112）相接触。当液体与固体支撑物（113）相接触时，测量装置（121）被激活以便测量已与固体对象（112）结合的探针（111）量。在预定的时间之后，包含探针（111）的液体可以用没有探针的液体来替代。在第三步骤（130）中，来自测量装置的读数被呈现为结合曲线（131），所述结合曲线将探针和固体对象之间的相互作用的存在和探针-对象复合物的形成速率示出为表示与固体对象结合的探针量随时间的曲线。在结合曲线（131）中识别探针添加（132）和探针移除（133）的时间点，除非它们是预先已知的。在第四步骤（140）中，所测量的结合曲线（131）被表达为预定义集合的原始结合曲线之和，每个这样的原始曲线都被乘以权重以调节不同原始曲线在表示所测量的结合曲线（131）的和中的幅度。因而，可以由多个权重来表示每个所测量的结合曲线（131），每个权重与原始曲线相关联。这样的权重聚集被称为权重向量。不同的所测量的结合曲线将被表达为不同的权重向量。在一些情况下，权重向量进而可以被呈现为地形图，其中三元组（典型地为[结合速率、离解速率、权重]）的表面被绘制为等值线图（141）。该图中的每个“山”（142）意味着对应的结合和离解速率值具有提高的权重，这意味着结合曲线（131）部分地由对应的结合和离解速率值的相互作用组成，这进而意味着探针（111）正与具有对应的结合和离解速率值的固体对象（112）的结构相互作用。在生物对象的情况下，每个探针-受体相互作用将导致至少一个这样的“山”，并且针对给定的生物对象的这些“山”的位置和相对高度将表示生物对象的受体表达浓度或者状态。在第五步骤（150）中，所述权重可能与另外的数据（152）一起被馈送到分类算法（151）。分类算法可以是神经网络、线性判别分类器、支持向量机、k-最近邻分类器或者任何其他能够基于输入数据中的特征来将所述输入数据的集合分类为至少两个不同类别的算法。分类算法（151）的输出被例示为三个不同类别（153，154，155），这三个类别例如可以表示组织样本的分类[健康；不确定；疾病]。

待检查的固体对象需要被附接到固体支撑物。附接的方法可以根据固体对象的类型而不同。活的或者新鲜的生物对象可以自发地附着到特定塑料和玻璃表面，但是在一些情况下固体支撑物必须涂覆有特定蛋白质（像纤连蛋白、Concavalin A、聚赖氨酸或者牛血清白蛋白（仅举几例））以便于附着。在固体对象是涂料或者其他保护性表面涂层的情况下，它们典型地是固有粘性的。还有其他的对象可以被粘到固体支撑物。

本发明中所使用的固体支撑物是刚性结构，典型地由玻璃或者塑料制成，并且是基本平坦的。通常结合检测技术来设计支撑物。固体支撑物的示例包括但不限于玻璃载片（例如显微镜载片、显微镜盖载片、覆盖有被设计用于在表面等离子体共振检测器中进行检测的金膜的玻璃载片、具有用于干涉测量检测的多个不同折射率的涂层的玻璃载片、以及具有压印光栅的玻璃载片（仅举几例））、透明塑料载片（覆盖有被设计用于在表面等离子体共振检测器中进行检测的金膜的塑料载片、具有用于干涉测量检测的多个不同折射率的涂层的塑料载片、以及具有压印光栅的塑料载片（仅举几例））、以及由玻璃或者塑料制成的皮氏培养皿（petri dish）。固体支撑物可以含有涉及检测原理的特征，包括（但不限于）薄金层、压印光栅、嵌入电极以及具有酶活性的表面涂层（仅举几例）。

有若干可用于对探针和固体对象之间的复合物形成速率以及所形成的复合物量值进行测量的方法。基于表面等离子体共振和相似技术的方法是可用的，如在由Rich RL和Myszka DG在Journal of Molecular Recognition 2007 Sep-Oct;20(5):300-66中发表的报告“Survey of the year 2006 commercial optical biosensor literature”（该报告通过引用并入本文）中所描述的。时间分辨的共聚焦显微术和相似成像技术是备选方法，如由Praus P、Kocisová E、Mojzes P、Stepánek J、Seksek O、Sureau F和Turpin PY在Annals of the New York Academy of Sciences 2008; 1 130: 1 17-21中发表的报告“Time-resolved microspectrofluorometry and fluorescence imaging techniques: study of porphyrin-mediated cellular uptake of oligonucleotides.”（该报告通过引用并入本文）中所描述的。用于完成图1中的步骤120的优选方法先前已被公开[WO2005080967，其通过引用并入本文]并且在图2中被示意性地描述。简言之，该方法依赖于被固定于固体支撑物（201）上的定义区域（记为“活性区域”）的固体对象（202）。在相同的固体支撑物上，也有基准区域（在该情况下与活性区域相对）。包含所溶解的探针的液体与固体支撑物相接触以实现对象和探针之间的相互作用。此外，固体支撑物被倾斜并且使用电动机（203）而被缓慢旋转。在固体支撑物的提高部分上方，安装能够检测附接到所使用的探针的标记的检测器（204）。所述检测器典型地不与固体支撑物相接触，但是登记例如来自荧光标记的发出的光或者发出的放射性核素辐射。当活性区域通过检测器时，在配体已与目标结合的情况下将登记提高的信号。对于每次旋转，可以通过从来自活性区域的检测信号中减去来自基准区域的检测信号而计算结合水平值。当从一系列旋转中收集结合水平值时，得到时间分辨的结合曲线。

本发明中的检测方法可以具有空间分辨率。例如，可以在测量的过程期间重复地拍摄固体对象的高分辨率数字照片。通过将对象的图片划分为不同区域，可能在一次测量中为每个区域得到一个结合曲线。因而，给定空间分辨的检测装置，本发明可以不仅应用于整个固体对象，而且还应用于所述对象的选择部分。当分析薄的组织部分时，空间分辨的检测对于医疗决定而言特别令人感兴趣。取决于分辨率，若干不同的组织部分可以以阵列状结构应用在一个固体支撑物上。

由若干原始理论结合曲线之和来表示一个或多个结合曲线可以如图3中所简要概述地解释。给定与图1中记为141的等值线图相似的等值线图（300），每个“山”指示在所测量的结合曲线（350）中存在与该山相关联的原始结合曲线。在图3中，山310具有最高的幅度，如等值线的数字所指示的。因此，对应的原始曲线311是对所测量的曲线（350）的表示的主要贡献。山320在幅度上较低，但是还具有较慢的结合速率和较慢的离解速率。这意味着对应的曲线321的特性形状对于探针摄取和探针离解而言都较慢。在所测量的曲线（350）的表示中，原始曲线321是小贡献。山330和340分别具有对应的原始曲线331和341，并且这些如上所述地被添加到所述表示。因而，由形成等值线图300的基础的所有原始曲线之和来表示所测量的曲线350，其中所有权重都是小的，除了根据相互作用图300被加权的原始曲线311、321、331和341之外。

图3中所概述的表示的背景在由Svitel J、Balbo A、Mariuzza RA、Gonzales NR和Schuck P在Biophys J. 2003 Jun;84(6):4062-77中发表的报告“ Combined affinity and rate constant distribution of ligand populations from experimental surface bin

在其中一种已知浓度的探针在时间点t_ass处被添加并且在时间点t_diss处用没有探针的液体来替代的探针-固体对象相互作用的情况下，可以根据以下来描述理论单价相互作用模型：

对于t<t_ass，Y=0

对于t_ass≤t<t_diss，Y=R_MAX*C/(C+k_d/k_a)*(1-EXP(-(k_a*C+k_d)*(t-t_ass))

对于t≥t_diss，Y=R₀*EXP(-k_d*(t-t_diss))

其中R_MAX是当固体对象上的所有可能的结合部位都具有与其结合的探针时得到的信号，k_a是相互作用的结合速率常数，k_d是相互作用的离解速率常数，R₀是在时间t_diss时的Y值。三个参数是预先已知的：t_ass是探针添加的时间，t_diss是探针移除的时间，而C是探针的浓度。

然而，原始结合曲线可以选自任何其他类别的相互作用模型，包括（但不限于）具有对扩散限制的校正（也称为对质量（mass）输送限制的校正）的单价相互作用模型、具有对由于与固体对象的相互作用导致的探针耗尽的校正的单价相互作用模型、以及二价相互作用模型。在其中使用不与固体对象相互作用的探针（例如，痕量元素）来做出对固体对象状态的测量的情况下，可以使用其他曲线作为原始曲线，诸如在有或者没有探针的主动输送（例如通过细胞膜中的流入泵和流出泵）的情况下进入固体对象的不同区室的被动扩散。在其中没有使用探针来做出对固体对象状态的测量的情况下，可以使用还有其他曲线作为原始曲线。在所有情形下，所有类别的原始曲线典型地具有小于10个自由参数（例如，在扩散进入不同区室的情况下的扩散常数和区室体积）。

可能例示使用根据理论单价相互作用模型的原始曲线来表示所测量的结合曲线（131）。随后通过作为各自乘以对应的权重w_i（i=1..n）的若干理论曲线Y_i（i=1..n）之和的Y_hat来逼近所测量的曲线131，其中n是在逼近中所使用的预定义[k_a,k_d]值的总数。

Y_hat=Σ_i=1至n（w_i*Y_i）

其中对于任意R_max>0（典型地选择为R_max=1），Yi=Y(k_ai,k_di)。

权重w_i被选择为使成本函数的值最小化。普遍的成本函数是平方残差之和，其是通过首先从所测量的结合曲线（131）中减去Y_hat、随后计算每个残差元素的平方并且最后将所有平方残差元素求和来计算的。当Y_hat接近类似所测量的结合曲线（131）时，平方残差之和的值将是小的。

有用于通过使成本函数的值最小化来找出权重w_i的自动方法。一种这样的可能方法是通过Marquardt-Levenberg的方法，如由Carrot C、Guillet J、May J-F和Puaux J-P在Macromolecular Theory and Simulations 1 (4):215 - 231 , 2003中发表的报告“Application of the Marquardt-Levenberg procedure to the determination of discrete relaxation spectra”（该报告通过引用并入本文）中所描述的。其他的可能方法包括但不限于单纯性优化、基因算法和基于梯度的优化算法。

当计算了权重时，也许可能以三维图绘制权重。典型地，离解速率常数被指定为x轴而结合速率常数被指定为y轴。在z方向上把权重绘制为其中使用例如从红到蓝的梯度来表示权重值的比色图或者绘制为很像是地形图的、其中用等权重水平线来示出较高权重的等值线图（141）。因而，所测量的结合曲线（131）的该示例性表示通过使用根据理论单价相互作用模型的原始曲线，在逼近中使用[k_a,k_d]的预定义值的多个权重。

在一些情况下，优化问题可能是欠定的（under-determined），即可能有产生等于所测量的结合曲线（131）的Y_hat的w_i的若干不同集合。在该情况下，优选的是在搜索使Y_hat和所测量的结合曲线（131）之间的差异最小化的w_i的集合时应用正则化算法（例如Tichonov正则化）。简言之，正则化算法对导致朝向具有最少数量的大w_i的解（这也将是最简单的可能解）收敛的、具有高方差的w_i的集合添加惩罚。

当把相互作用图用于不同固体对象和/或不同探针的比较时，在针对经受比较的情形来计算相互作用图时使用原始曲线的相同预定义集合可能是重要的。在针对经受比较的情形来计算相互作用图时把相同的初始值用于最小化算法也可能是重要的。

使用本发明的方法的益处是很多探针-对象相互作用具有异源本质，并且异源性照此包含关于相似结构在固体对象中的分布的信息。例如，在固体对象是组织切片的情况下，组织中的癌细胞可以大量地表达特定受体而在该受体的氨基酸序列中有突变。为这样的受体所选择的探针可以是标记有荧光部分的单克隆抗体。抗体与癌细胞的突变受体的相互作用将很可能不同于与自然受体的相互作用。因为组织切片可能包含癌细胞和正常细胞两者，所以所测量的结合曲线将反映与突变体的相互作用和与正常受体的相互作用两者，并且因此在三维的权重图中导致两个峰。两个峰的相对高度将进一步指示突变体和正常受体的相对数目。

基本上，本发明使得可能针对例如癌症发展和治疗而测量重要蛋白质的基因变异的浓度。这可以形成测量以下的基础：用于治疗的药物形式的个人化药品的生物标志，或者用于在个体病人中进行活体成像的标记分子。例如，使用已知用来识别在疾病状态中已知是过表达的受体结构的抗体探针来分析来自病人的组织将产生进而可以用于对组织进行分类的权重向量，这实现对所述疾病的状态做出决定。

在细胞生长控制系统中的蛋白质的基因突变对于癌症的发展而言是重要的。例如，表达蛋白质P53的基因中的基因突变在很多癌症中是普遍的。蛋白质的改变的其他示例是转译后修饰（例如，蛋白质的糖基化（仅举一个示例）），其导致可以具有显著生物学重要性的密切相关分子。这样的修饰非常难以分析，并且质谱分析法是当前用于这样的任务的一种可能技术。可以使用抗体技术来检测突变和转译后修饰，但是抗体技术首先需要精确了解要检测哪种突变/转译并且其次需要发展具有非常高特异性和在密切相关抗原之间的大亲和性差异的抗体。发展这样的抗体是困难的。

本发明使得可能识别固体对象上或固体对象中的诸如突变蛋白质的密切相关结构。可以使用与具有不同动力性质的密切相关结构（例如，具有不同突变的受体（仅举一个示例））结合的探针，因为时间分辨的检测与基于加权原始曲线之和的指纹组合可以用于识别固体支撑物中的结构以及对这些结构的量进行量化。这样定义的探针更容易发展，因为与对基于终点化验相比，对多个结合结构之间的差异的要求较不严格。

也可以通过使用亲和性提纯的多克隆抗体探针来识别固体对象上或固体对象中的诸如突变蛋白质的密切相关结构。多克隆抗体是从免疫的动物血清中提纯的并且因此典型地包含结合于免疫原的不同免疫原表面的若干不同抗体，因此标记（notation）是多克隆的。在组特异配体或者抗原本身上可以将这样的多克隆抗体提纯为不同的程度，诸如免疫球蛋白片段或者亲和性提纯的制剂。在使用多克隆抗体作为探针时，相互作用将是固有异源的，但是尽管利用不同机制，所有探针都与相同受体表面结构相结合。因为依赖于不同机制的若干相互作用中的仅一种由于受体结构的改变而需要变更，所以在使用多克隆抗体探针时，将检测到受体结构的小改变（例如，突变、构型改变、转译后修饰、磷酸化（仅举几个改变固体表面的分子结合性质的修饰））的可能性因此较高。一个或若干“山”的指纹的这样的改变可以与分子性质或者治疗效果的临床预测或者对用于活体诊断成像方法的分子的选择都相关。还可能通过混合大量已知或者未知的同源探针，例如通过混合已知与相同受体结合的五个单克隆抗体或者通过在生成人造结合剂（binder）时在摇拍（panning）过程中保持多个潜在结合剂（例如在噬菌体显示和相似方法中），来模拟多克隆抗体探针的性质。在这样的混合物中可以使用其他类型的分子，诸如部分抗体、scFv、纳米体、亲和体、适体、肽或者任何其他可以结合的分子。

现在，在细胞中的DNA或者RNA水平上检测基因多样性。使用定量的聚合物链反应（polymer chain reaction，PCR）技术和相关方法，可能以高灵敏度检测这样的分子种类。然而，RNA的细胞含量不是对蛋白质浓度的完美镜像，如由Ellmark P、H?gerkorp CM、Ek S、Belov L、Berglund M、Rosenquist R、Christopherson RI和Borrebaeck CA在Cancer Letters 28;265(1):98- 106, 2008中发表的报告“Phenotypic protein profiling of different B cell sub-populations using antibody CD-microarrays”（该报告通过引用并入本文）中所讨论的。也可以确定感染原，例如在重要病毒定义的蛋白质中有突变的病毒株。本发明通过使用以由经常突变基因所表达的蛋白质的可变区域为目标的探针而具有检测这样的差异的可能性。作为用于在相关结合或者调节部位中识别不同结合性质的探针，在细胞网络中所识别的相互作用分子是非常有用的。

可以使用具有两个或更多结合部位的任何探针，并且由于抗体亲抗原性（avidity）效应，本发明使得可能在通过一个、两个或更多结合部位所结合的结构之间进行区分。使用双或多功能探针的可能性特别令人感兴趣。双功能探针可以与形成复合物的分子上的两个独立结合表面相结合，而多功能探针可以与多于两个独立结合表面相结合。因为本发明使得可能识别单价和二价结合的贡献，所以可能量化紧密分布物质的含量。这是特别令人感兴趣的，因为很多生物控制路径是所形成的分子复合物的后果。

当以具有小差异的结构为目标时，等值线图中的两个山可能重叠。在该情况下，在提高的温度下（例如，在37℃下而非在室温下）执行测量可能是有利的，因为探针-结构相互作用的热力学性质在过多的不同结构之间可能不同。另一个可能性是在不同环境中执行测量以便分离通常重叠的山。先前已知的是，化验环境的小改变可以影响一个探针和相似结构之间的相互作用，如由Andersson K、Choulier L、Hamalainen MD、van Regenmortel MH、Altschuh D和Malmqvist M在Journal of Molecular Recognition 14(1): 62-71 , 2001中发表的“Predicting the kinetics of peptide-antibody interactions using a multivariate experimental design of sequence and chemical space”（其通过引用并入本文）中所报告的。因此，通过适配测量的化学环境，重叠的山可以变得分离，这进而可以改进测量的分析质量。相同的推理也适用于其中使用多于一个探针以及两个探针与具有相似相互作用性质的它们相应目标相互作用的情况。

本发明使得可能使用不同探针的混合物。在该情况下，每个个体探针将具有定义的结合性质，并且将因此以独特的方式对与固体对象上的结构的相互作用做出贡献。这使得可能复用该测量。通过使用可以从不同标记（例如，用于不同放射性核素的不同能量或者用于荧光标记的不同发射波长（仅举几例））中分离所测量信号的检测器，可以实现可观的复用。因为每个探针在其与固体支撑物上的结构的结合性质方面是预定义的，所以即使探针与其他标记分子相混合也可以被识别以及其对固体支撑物上的反应的贡献。在该情况下，可以确定固体对象上的和探针混合物中的结构的相对比例。当混合物含有非特异吸附于任何结构的物质并且其中吸附过程在时间分辨的性质上可以被分离时，这是特别相关的。

本发明也允许例如通过使用酶基底作为探针来测量固体对象中或固体对象上的酶活性。在其中基底具有定义的性质并且所形成的酶产物与固体对象上的或者紧密靠近固体对象的结构结合的情况下。这对于作为固相上的结构的功能酶可以是有效的。如果使用酶来检测双功能探针的结合，其组合具有定义的性质的结合以及通过增加的信号生成所进行的结合的酶扩增。这样的所形成的酶产物可以是具有锚定于表面的标记的聚合物的形成物或者不溶性产物以保持产物紧密靠近固相上的结构。

示例1

在以下示例中，示出的是应用于相同固体对象上的探针的小差异可以导致不同的相互作用图。使用HNSCC（头颈鳞癌）细胞系SCC-9（取自美国模式培养物保藏所（American Type Culture Collection））作为固体对象。简言之，在含有5% CO₂的加湿空气的大气中在37℃下在完全培养基（complete medium）中培养SCC-9细胞。该示例中的两个探针是使用螯合剂CHXA’’-DTPA而标记有¹¹¹In或者¹⁷⁷Lu的抗体cMAb U36。SCC-9细胞以适于在LigandTracer Yellow（瑞典乌普萨拉的Ridgeview Instruments AB）中测量的方式生长在塑料皮氏培养皿上，将放射性标记抗体（1-15μg）添加到培养皿，并且开始测量。在所有情况下，在存在抗体的情况下跟踪（follow）结合曲线至少四个小时，并且在一些情况下将液体替换为纯介质以跟踪相互作用的洗出阶段（wash-out phase）。关于细胞培养、抗体标记、LigandCurver Yellow设置和其他实际问题的详细说明在由Nestor M、Andersson K、Lundqvist H在Journal of Molecular Recognition 2008 May-Jun;21 (3): 179-83中发表的题为“Characterization of ¹¹¹In and ¹⁷⁷Lu-labeled antibodies binding to CD44v6 using a novel automated radiommunoassay.”的报告（该报告通过引用并入本文）中可获得。

图4示出了所测量的与SCC-9对象结合的U36-¹¹¹In（410）和U36-¹⁷⁷Lu（460）探针的结合曲线。在U36-¹¹¹In（410）的情况下，以不同的U36-¹¹¹In浓度来记录5个个体曲线：1μg/ml（411），15μg/ml（412），10μg/ml（413），5μg/ml（414）和5μg/ml（415）。此外，测量415含有洗出阶段，其中在特定时间点处移除探针并且测量探针的释放。在U36-¹⁷⁷Lu（460）的情况下，以不同的U36-¹⁷⁷Lu浓度来记录5个个体曲线：15μg/ml（461），10μg/ml（462），5μg/ml（463），1μg/ml（464）和5μg/ml（465）。此外，测量465含有洗出阶段，其中在特定时间点处移除探针并且测量探针的释放。在图4中的两幅结合曲线图中，为了增强可视性，在y方向上移位了个体所测量的曲线。此外，示出了所测量的曲线（噪声线）和以求和的原始曲线（平滑线）的表示两者。

所测量的结合曲线被导入到MATLAB 6.5（马萨诸塞州内蒂克的Mathworks）中，并且使用平方残差之和成本函数以及单纯形优化方法来计算针对属于单价相互作用族的720个不同原始曲线的权重。以x轴上的离解速率常数k_d的对数、y轴上的结合速率常数k_a的对数以及作为z轴的权重值（示为等值线），将所得到的权重绘制为等值线图。U36-¹¹¹In（416）的等值线图不同于U36-¹⁷⁷Lu（466）的等值线图，特别是在-5<log10（离解速率）<-3的区域中。U36-¹¹¹In（416）具有几个log10(离解速率)≈-4.2的高山，而U36-¹⁷⁷Lu（466）具有log10(离解速率)≈-3.5至-4的零星山。这说明了即使不用分类算法，探针设计中的小差异也是可见的。

示例2

在以下示例中，示出的是固体对象中的小差异可能在应用相同探针时导致不同的相互作用图。使用细胞系SKBR-3和SKOV-3（取自美国模式培养物保藏所）作为固体对象。简言之，在含有5% CO₂的加湿空气的大气中在37℃下在完全培养基中培养这些细胞。该示例中的探针是标记有荧光标志AlexaFluo488的抗体曲妥单抗（trastuzumab）。已知曲妥单抗与受体HER2相结合，并且已知细胞系SKOV-3和SKBR-3表达这样的受体。细胞以适于在LigandTracer Green原型（瑞典乌普萨拉的Ridgeview Instruments AB）中测量的方式生长在塑料皮氏培养皿上。在短基线读取之后，将荧光标记的抗体添加到培养皿，并且开始测量。在所有情况下，在存在抗体的情况下跟踪结合曲线至少一个小时，在此之后将液体替换为纯介质以跟踪相互作用的洗出阶段。所得到的结合曲线被导入到MATLAB中并且如示例1中所述地处理。所得到的曲线和等值线图示于图5中。图510示出了所测量的SKBR-3细胞上的曲妥单抗-HER2的结合曲线（噪声曲线）以及表示所测量的曲线的原始曲线之和（平滑曲线）。在等值线图520中示出了在原始曲线之和中所使用的权重。在图520中看到两个主要山，一个表示强相互作用（521）而一个表示弱且快速离解的相互作用（522）。还看到几个低山（523），但是山523的低量值使得它们较不重要。

图550示出了所测量的SKOV-3细胞上的曲妥单抗-HER2的结合曲线（噪声曲线）以及表示所测量的曲线的原始曲线之和（平滑曲线）。在等值线图560中示出了在原始曲线之和中所使用的权重。在图560中看到两个主要山，一个表示强相互作用（561）而一个表示弱且快速离解的相互作用（562）。还看到几个低山（563），但是山563的低量值使得它们较不重要。

当比较图520和560时，主要峰处于略为不同的位置。SKBR-3的强成分（521）具有比SKOV-3的强成分（561）更高的结合速率。此外，较弱的成分具有大约相同的亲和性，但是与SKOV-3弱成分（562）相比，SKBR-3（522）弱成分具有更快开-快关特性。这样的微妙差异可能是由于细胞膜中的总受体环境或者是由于不同细胞类型中的同和异二聚化（homo and heterodimerization）平衡的变更。还应当注意，SKBR-3得自乳腺癌肿瘤，而SKOV-3得自卵巢癌肿瘤，这可能影响HER2受体的表达模式和转译后修饰路线。

在该示例中对所选择的探针的HER2响应的差异可以具有临床后果。在该情况下，通过首先为未知的固体对象确定两个主要峰的位置并且其次将所检测的峰位置与预定义位置的集合相比较（每个预定义位置都与所建议的临床后果相关联），将决定最优剂量或者治疗或者其他临床后果。

示例3

在以下示例中，示出的是固体对象中的小差异可能在应用相同探针时导致不同的相互作用图。使用细胞系SKBR-3和A431（取自美国模式培养物保藏所）作为固体对象。简言之，在含有5% CO₂的加湿空气的大气中在37℃下在完全培养基中培养这些细胞。该示例中的探针是标记有碘125的表皮生长因子（EGF）。EGF是表皮生长受体（EGFR）的配体。已知A431表达大量的EGFR，而SKBR-3可以表达EGFR但是程度显著更低。细胞以适于在LigandTracer Grey（瑞典乌普萨拉的Ridgeview Instruments AB）中测量的方式生长在塑料皮氏培养皿上。在短基线读取之后，将1nM放射性标记EGF添加到培养皿，并且开始测量。在所有情况下，在存在放射性标记EGF的情况下跟踪结合曲线约一个小时，在此之后将液体替换为纯介质以跟踪相互作用的洗出阶段。所得到的结合曲线被导入到MATLAB中，并且如示例1中所述地处理。对于细胞系A431和SKBR-3两者都将这些测量执行两次。所得到的等值线图示于图6中。等值线图610示出了来自A431测量之一的相互作用图。该相互作用证明具有复合物本质，因为7个主要山被识别，如虚线圈（611）所指示的。对应的结合曲线619示出了所记录的结合信号约为160计数每秒（CPS）。使用新的A431细胞培养皿来重复该测量，这导致等值线图620，其中七峰模式是可见的（由虚线圈621所突出显示）。等值线图630示出了来自于SKBR-3测量之一的相互作用图。没有清晰表明所记录的相互作用相似于A431细胞的相互作用，因为找不到七峰模式。对应的结合曲线639具有约30CPS的结合水平。对结合于SKBR-3细胞的放射性标记EGF的第二测量导致等值线图640，其也没有七峰模式。因为公知A431细胞表达EGFR至高程度，所以导致图610和620中的七峰模式的大记录结合信号可能指示强EGF-EGFR相互作用。已知不表达大量EGFR（如果有的话）的其他细胞系SKBR-3示出了低得多的记录信号以及明显不同的等值线图（630,640），导致如下结论：放射性标记EGF以完全不同于针对A431上的EGFR的方式与SKBR-3上的少量EGFR相结合，或者放射性标记EGF与SKBR-3细胞表面上存在的其他东西相结合。

示例4

在以下示例中，示出的是固体对象中的小差异可能在应用相同探针时导致不同的相互作用图。使用细胞系A431（取自美国模式培养物保藏所）作为固体对象。简言之，在含有5% CO₂的加湿空气的大气中在37℃下在完全培养基中培养这些细胞。这些细胞在三个不同条件下生长：完全细胞培养介质（HAMS-F10+10%胎牛血清）、补充有葡萄糖（1g/L）的完全细胞培养介质、以及没有FCS（胎牛血清）的细胞培养介质。该示例中的探针是标记有碘125的抗体西妥昔单抗。已知西妥昔单抗与受体EGFR相结合，并且已知A431细胞表达这样的受体。细胞以适于在LigandTracer Grey（瑞典乌普萨拉的Ridgeview Instruments AB）中测量的方式生长在塑料皮氏培养皿上。在短基线读取之后，将4.4nM放射性标记西妥昔单抗添加到培养皿中，并且开始测量。在所有情况下，在存在放射性标记西妥昔单抗的情况下跟踪结合曲线约两个小时，在此之后将液体替换为纯介质以跟踪相互作用的洗出阶段。所得到的结合曲线被导入到MATLAB中，并且如示例1中所述地处理。对每种生长条件都将这些测量进行两次。所得到的等值线图示于图7中。示意图700示出了相互作用图中的三个区域，其中西妥昔单抗-EGFR相互作用导致主要山。区域701对应于具有约10分钟寿命的快速相互作用成分。区域702对应于慢（即，很多小时）且强的成分。区域703表示需要更高的探针浓度以可见（在与701和702相比时）的弱成分。其他六个相互作用图包含来自具有在完全细胞培养介质中培养的A431细胞的两个独立测量的结果（710和711）、来自具有在补充有葡萄糖的完全细胞培养介质中培养的A431细胞的两个独立测量的结果（720和721）、以及来自具有在无胎牛血清的细胞培养介质中培养的A431细胞的两个独立测量的结果（730和731）。具有完全介质的相互作用（710,711）在所有三个区域（701,702,703）中都具有山。区域702和703中的山具有大约相同的量值，而区域701中的山较不突出。具有葡萄糖补充的介质的相互作用（720,721）在区域702和703中具有山。区域702中的山具有比区域703中的山更高的量值。具有饥饿（starvation）介质的相互作用（730,731）也在区域702和703中具有山，但是区域703中的山具有比区域702中的山更高的量值。因而，通过使用相互作用图，可能在相似的固体对象之间进行区别。还可能相互作用图揭示可能令人感兴趣的生物信息。例如，已知EGFR受体在细胞膜中与其自身（同二聚体）和与相关受体（异二聚体）都形成二聚体。一种假设是三个区域701、702和2703实际上表示单体EGFR、同二聚体EGFR和异二聚体EGFR。

尽管关于构成当前对发明人已知的最好模式的本发明优选实施例描述了本发明，但是应当理解，在不脱离如此处所附权利要求所阐述的本发明的范围的情况下，可以做出如对本领域的普通技术人员将显而易见的各种改变和修改。

Claims

1. 一种用于对能用于分析或诊断过程中的固体对象的性质进行测量的方法，所述方法包括：

提供一个或多个探针，所述探针能够与所讨论的固体对象上的结构相互作用以形成探针-对象复合物；

将所述固体对象附接于固体支撑物；

提供感兴趣的探针的溶液；

使所述溶液与附接于所述支撑物的所述固体对象相接触，

检测探针与固体对象之间的相互作用的存在以及探针-对象复合物的形成速率，以形成表示与所述固体对象结合的探针量随时间的曲线；

用原始结合曲线的预定义集合中的所有原始曲线的加权和来逼近所述曲线，

计算每个原始结合曲线的权重，从而所述权重使所检测的结合曲线与加权的原始结合曲线和之间的差异最小化；并且

通过使用单独地或者与另外的数据组合地基于所述权重的标准，将用于分析或诊断过程中的所述固体对象进行分类。

2. 根据权利要求1所述的方法，其中在不使所述检测器与所述固体对象相接触的情况下执行所述检测。

3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述检测器是放射性检测器或者荧光检测器。

4. 根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中原始结合曲线和对应的权重的数量至少是九。

5. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中用于检测溶液中的探针和固体支撑物上的固体对象之间的相互作用的方法还包括：

使所述固体对象固定在所述固体支撑物的选定部分上；

在执行所述测量之前，减少覆盖所述支撑物的选定部分的溶液量；

对所述支撑物的其中没有发生相互作用的部分执行基准测量。

6. 根据权利要求5所述的方法，其中计算检测和基准测量之间的差异。

7. 根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述固体支撑物是能够容纳在其边界内限定的溶液的基本平坦的培养皿。

8. 根据任一权利要求5所述的方法，其中通过使所述支撑物以偏离水平的角度定向以提供所述支撑物的提高部分和下部分从而所述提高部分将比所述下部分由更少的溶液覆盖，来实现溶液量的减少，并且其中所述支撑物以预定的旋转速度来旋转。

9. 根据任一前述权利要求所述的方法，其中以诸如放射性标志或者荧光标志的标志来标记所形成的复合物的一个构件。

10. 根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述探针选自蛋白质、DNA、RNA和有机化合物，所述探针可能标记有放射性或者荧光部分。

11. 根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述固体对象选自哺乳动物组织或者生物来源的对象。

12. 一种诊断方法，包括执行根据权利要求1所述的方法，其中所述固体生物对象是与蛋白质探针组合的组织切片，所述蛋白质识别在所述组织切片上已知在疾病状态中是过表达的受体结构，并且其中所述分类的结果用于做出对所述疾病的状态的决定。

13. 一种工具包，包括能用于通过根据权利要求1所述的方法对固体对象进行质量控制或者诊断的探针。