CN102212065B - 异核苷化合物或其亚磷酰胺衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一类异核苷化合物或其亚磷酰胺衍生物，该类化合物能够有效地提高经过其修饰的寡核苷酸的基因沉默效率，并且还能够保持该寡核苷酸的酶稳定性。本发明还提供了该类异核苷化合物或其亚磷酰胺衍生物的制备方法，还提供了寡核苷酸5’端磷酸化的固相合成方法，以及该类化合物在修饰寡核苷酸中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一类异核苷化合物或其亚磷酰胺衍生物，还涉及其制备方法以及该类化合物在修饰siRNA和脱氧寡核苷酸上的应用。
背景技术
反义寡核苷酸(ASONs)是研究最为广泛和深入的一类核酸类药物，长约15-20bp，能够与同源的RNA序列杂交，抑制特定基因的转录翻译过程或者破坏靶RNA的结构，从而达到治疗疾病的目的。天然结构的寡核苷酸作为药物，不能透过细胞膜，且易被体内核酶降解，生物利用度不高，因此需要对其进行结构修饰以改善其生物性质。硫代磷酸二酯键修饰的寡核苷酸VitraveneTM，作为抑制细胞巨化病毒引起的视网膜炎的反义药物，采用静脉注射的方式能够安全有效的治疗此种疾病，是第一个获准在美国、欧洲和南美上市的反义药物。目前，各种不同化学修饰的反义寡核苷酸正处于临床研究的不同阶段，希望能够用于治疗癌症。
继反义寡核苷酸和核酶技术之后，上世纪90年代后期科学家们发现了RNA干扰技术，具有不同于反义技术的基因靶向机理。RNA干扰作用使长链尤其是双链的RNA转变为约21碱基长度的RNA信号分子，包括siRNAs(smallinterfering RNAs)和miRNAs(microRNAs)。siRNAs和miRNAs参与特异性的蛋白复合物的形成，抑制mRNA的转录或翻译，或者催化mRNA的降解。由于RNA干扰作用能够高效、特异的阻断基因表达，因此在基因功能以及蛋白质相互作用等方面展示了诱人的前景，同时siRNAs在抗肿瘤抗病毒的基因治疗中也表现出巨大的潜力。与ASONs类似，天然结构的siRNAs不能够完全满足作为基因药物的需要，必要的化学修饰能够改善其体内稳定性、透膜性、生物利用度等特性，提高其沉默效应。ASONs化学修饰方法的研究对siRNAs的结构修饰有很大的帮助，但由于siRNAs作用机制和自身结构的复杂性，其化学修饰也比ASONs要复杂，仍需要深入的研究。
发明内容
为了克服未经修饰的反义寡核苷酸和siRNA的缺点，本发明的目的在于提供一种能够用来修饰反义寡核苷酸和siRNA以提高其生物学或药代动力学性质的一类异核苷化合物或其亚磷酰胺衍生物。该类化合物能够有效地提高经过其修饰的寡核苷酸的酶稳定性，并且还能够保持该寡核苷酸的基因沉默效率。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一类异核苷化合物，具有如式I所示的结构：
其中，n＝1、2或3；B为胸腺嘧啶基(T)、尿嘧啶基(U)、胞嘧啶基(C)、鸟嘌呤基(G)或腺嘌呤基(A)。
该类异核苷化合物的特征在于，异核苷的碱基由糖环的1’-位移至糖环的2’-位，增加了糖苷键的稳定性。
本发明的另一目的在于提供所述异核苷化合物的制备方法。
为了达到上述目的，本发明采取如下技术方案：
式I中n＝1时的异核苷采用如下合成方法：
A.将式II中所示化合物，通过微波辅助加热法与1，8-二氮杂双环(5.4.0)十一-7-烯(DBU)和不同碱基反应生成式III中所示化合物，其中的碱基包括胸腺嘧啶基(T)、尿嘧啶基(U)、胞嘧啶基(C)和腺嘌呤基(A)或鸟嘌呤基(G)；
B.将式III中所示的化合物，经过酸水解二甲缩醛，再经硼氢化钠还原得式I所示化合物，其中水解的酸包括不同浓度的盐酸或不同浓度的三氟乙酸。
式I中n＝2时的异核苷采用如下合成方法：
A.将式IV中所示中间体与苯甲酰氯反应，使苯甲酰氯对3’羟基进行保护；
B.将苯甲酰基保护后的式IV所示的化合物经酸水解后，与组分S发生反应，得到中间体式V中所示化合物，其中酸包括不同浓度的三氟乙酸，冰醋酸，盐酸，硫酸，磷酸，组分S为对甲苯基-2-(三苯基膦叉)甲基砜；
C.将式V中所示化合物，与偶氮二异丁腈(AIBN)，三正丁基锡氢(Bu3SnH)在甲苯或苯中反应，生成式VI中所示化合物，再与氟化铵在醇中反应，生成式VII中所示化合物，其中醇包括甲醇、乙醇、异丙醇；
D.将式VII中所示化合物，在四氢呋喃或二氧六环或二氯甲烷中与9-硼二环[3.3.1]壬烷(9-BBN)或硼烷或其他硼烷类似物反应，再在碱性条件下与双氧水反应生成式VIII中所示化合物，再在N，N-二甲基甲酰胺中与咪唑和叔丁基二甲基氯硅烷反应或在吡啶中与叔丁基二甲基氯硅烷反应生成式IX中所示化合物；
E.将式IX中所示化合物，在甲醇或乙醇中与碳酸钾反应生成式X中所示的环氧化合物，再通过微波辅助加热法与1，8-二氮杂双环(5.4.0)十一-7-烯(DBU)和不同碱基反应生成式XI中所示化合物，其中的碱基包括胸腺嘧啶基、尿嘧啶基、胞嘧啶基和腺嘌呤基或鸟嘌呤基，再在四氢呋喃中与四丁基氟化铵(TBAF)反应，脱去叔丁基二甲基硅醚基，得到式XII中所示化合物
式I中n＝3时的异核苷采用如下合成方法：
A.将苯甲酰基保护后的式IV所示的化合物经酸水解后，得到式XIII中所示化合物；再将组分P，在四氢呋喃中与氢化钠反应一段时间后，加入式XIII中所示化合物，反应得式XIV中所示化合物，组分P为磷酰基乙酸三乙酯；
B.将式XIV中所示化合物经催化氢化还原后，用氢化铝锂还原，得到式XV中所示化合物，再在N，N-二甲基甲酰胺中与咪唑，叔丁基二甲基氯硅烷反应或在吡啶中与4-二甲氨基吡啶，叔丁基二甲基氯硅烷反应，得到式XVI中所示化合物
C.将式XVI中所示化合物，通过微波辅助加热法与1，8-二氮杂双环(5.4.0)十一-7-烯(DBU)和不同碱基反应生成式XVII中所示化合物，其中的碱基包括胸腺嘧啶基、尿嘧啶基、胞嘧啶基、腺嘌呤基或鸟嘌呤基，再在四氢呋喃中与四丁基氟化铵反应，脱去叔丁基二甲基硅醚基，得到式XVIII中所示化合物。
其中所述微波辅助加热法，是使环氧化合物开环得异核苷的方法，能缩短反应时间、提高收率、减少副反应的发生、提高选择性。在本发明较佳实施例中，所述微波辅助加热法的反应条件是：利用微波合成仪(Biotage，Initiator 2.0)，以N，N-二甲基甲酰胺为溶剂，时间30min，温度180℃，吸收水平为高，预搅拌时间30～60s。
本发明的另一个目的是为了提供一种用于制备反义寡核苷酸和siRNA的异核苷亚磷酰胺单体，具有如式XIX所示的通式
其中，n＝1、2或3；B为胸腺嘧啶基(T)、尿嘧啶基(U)、鸟嘌呤基(G)、腺嘌呤基(A)或胞嘧啶基(C)。
为得到上述的异核苷亚磷酰胺单体，本发明采取如下方法：
其中，异核苷亚磷酰胺单体中碱基B为腺嘌呤基或胞嘧啶基时采取如下合成方法：
A.将式I所述化合物，先与三甲基氯硅烷反应，再与苯甲酰氯反应，再脱除三甲基硅醚键，使苯甲酰基保护腺嘌呤或胞嘧啶上的氨基，将具有苯甲酰基保护的式I所示的化合物与组分M反应，得到化合物D，所述组分M为4，4’-二甲氧基-三苯甲基氯；
B.将化合物D与组分C反应，得到具有苯甲酰基保护式XIX所示的化合物；所述组分C为2-氰乙氧基-N，N-二异丙基-氯代亚磷酰胺或2-氰乙氧基-N，N，N’，N’-四异丙基-亚磷酰胺。
其中，异核苷亚磷酰胺单体中碱基B为胸腺嘧啶基、尿嘧啶基和鸟嘌呤基时采取如下合成方法：
将式I中所述化合物与组分M反应，得到化合物E，所述组分M为4，4’-二甲氧基-三苯甲基氯；将化合物E与组分C反应，得到式XIX所示的化合物；所述组分C为2-氰乙氧基-N，N-二异丙基-氯代亚磷酰胺或2-氰乙氧基-N，N，N’，N’-四异丙基-亚磷酰胺。
本发明的另一目的是为了提供所述的异核苷化合物或所述的异核苷亚磷酰胺单体在修饰siRNA和脱氧寡核苷酸领域中的应用。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
提供一种异核苷修饰的反义寡核苷酸或siRNA，其包括一个或多个式I所示的异核苷化合物或式XIX所示的异核苷亚磷酰胺单体，是在DNA合成仪上掺入式I所示的异核苷化合物或式XIX所示的异核苷亚磷酰胺单体，以得到异核苷修饰的反义寡核苷酸或siRNA。
所述的反义寡核苷酸链或siRNA链，其还可以包括2’-O-甲基核苷酸(2’-OMe)、2’-脱氧-2’-氟代(2’-F)核苷酸、锁定核酸(LNA)核苷酸，以及它们的混合。
所述反义寡核苷酸(ASONs)是研究最为广泛和深入的一类核酸类药物，长约15-20bp，能够与同源的RNA序列杂交，抑制特定基因的转录翻译过程或者破坏靶RNA的结构，从而达到治疗疾病的目的。
所述siRNA是一种长度为19-21个核苷酸的双链区修饰的siRNA，由Dicer酶(RNAase III家族中对双链RNA具有特异性的酶)加工而成，激发与之互补的目标mRNA的沉默，从而达到治疗疾病的目的。
本发明的再一个目的是为了提供一种所述异核苷化合物修饰的反义寡核苷酸或siRNA的合成方法。
为达到上述目的，本发明采取如下方法：
寡核苷酸的固相合成是从其3’端起始，逐个偶联核苷单体。带有5’-DMTr保护的脱氧核苷，其3’-位与可控玻璃珠(control pore glass，CPG)通过琥珀酸桥连接，得到相应的A，T，C，G Columns，用于寡核苷酸合成的固相载体。通常附载在CPG上的核苷单体也就是寡核苷酸链3’-末端核苷。
Universal-CPG可方便的用于合成3’-端是任何一种核苷的寡核苷酸链，用它来合成3’-末端为异核苷修饰的寡核苷酸链，可以避免将异核苷预先偶联到CPG载体上的操作。
寡核苷酸链的固相合成是按照设定好的程序进行的，一般每偶联一个核苷为一个循环，每个循环包括四个反应：1.三氯乙酸溶液脱除5’-DMTr保护；2.核苷偶联反应，由1H-四唑催化，亚磷酰化单体通常分次进样以提高偶联收率；3.盖帽(capping)反应，用乙酰基封闭未反应的5’-OH，防止短链的形成；4.氧化反应，一般用碘的Py-H2O-THF溶液快速的将三价磷氧化成五价磷。当5’-末端核苷偶联完成以后，可以选择脱除或保留该核苷上的DMTr保护基，及DMT-off或DMT-on合成方式，合成方式不同，下一步寡核苷酸链的分离纯化的方式也不相同。每一循环中，各步反应液的加液时间和反应等待时间根据合成规模、反应液的浓度等设定。
异核苷修饰的寡核苷酸链的固相合成，只需用异核苷亚磷酰化单体代替天然核苷的亚磷酰化单体在相应的位置进样偶联，但由于异核苷常规条件下的偶联收率偏低，采用增加异核苷亚磷酰化单体的进样次数(3次)和每次进样后的偶联时间(300秒/次)以保证整个寡核苷酸链合成的收率。
RNA的合成与DNA合成类似，采用固相亚磷酰胺法合成，同样在ApplideBiosystems model 392 DNA Synthesizer上完成。RNA的固相合成也是从3’-端至5’-端依次连接核苷，每连接一个核苷同样也是一个循环，且每个循环也包含四个反应，与DNA合成类似。但用于RNA合成的亚磷酰化单体是2’-TBDMS保护的核糖核苷单体，保护基产生较大的位阻，影响偶联反应，因此与DNA合成不同，RNA合成中偶联一步需要较长的反应时间以提高偶联收率。此外，乙酰化封闭反应时间、碘液氧化反应时间、脱除DMTr保护基的等待时间等都相应延长。通常，siRNA两条RNA链3’-末端都带有两个嘧啶核苷(3’-tt或3’-uu)，因此在分别合成单链RNA链时，其3’-末端均带有两个胸腺嘧啶核苷(3’-tt)。以CPG-dT为载体，首先偶联一个胸苷单体后再依次偶联其他核糖核苷单体，合成采用DMT-off方式。
在合成未经修饰的单链RNA时，每个循环偶联时间为30分钟(600秒/次x3次)，当用异核苷单体偶联时，每个循环偶联时间增加至45分钟(900秒/次x3次)。
本发明的另一个目的是为了提供一种利用DNA合成仪进行反义寡核苷酸和siRNA 5’末端的磷酸化方法，可用于研究5’-端磷酸化后的寡核苷酸和siRNA对其生物学功能的影响。
为达到上述目的，本发明采用如下方法：
将寡核苷酸链和siRNA单链5’-端磷酸化的固相合成方法，其特征在于使用组分C代替正常的亚磷酰胺单体在相应位置进行偶联，组分C为2-氰乙氧基-N，N-二异丙基-氯代亚磷酰胺或2-氰乙氧基-N，N，N’，N’-四异丙基-亚磷酰胺。
本发明提供的异核苷化合物能够显著地提高经过其修饰的寡核苷酸的酶稳定性，并且还能够保持寡核苷酸的基因沉默效率，从而使经过其修饰的寡核苷酸能够更好的起到调控基因表达的作用；此外，正义链修饰的siRNA具有抑制脱靶效应的作用。
附图说明
图1a为使用蛇毒磷酸二酯酶(SVPDE)降解脱氧寡核苷酸(ASON-I，III和D1)的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图1b为ASON-D1，I，III对于蛇毒磷酸二酯酶(SVPDE)的稳定性的时间浓度曲线；
图2a为20％变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳显影，通过E.coli RNase H1降解5’端32P标记的脱氧寡核苷酸，以表示裂解能力；
图2b为E.coli RNase H1降解脱氧寡核苷酸的时间浓度曲线；
图3为siRNA的沉默活性。
缩略表：
AIBN 偶氮二异丁腈
Bu3SnH 三正丁基锡氢
Bz- 苯甲酰基
DBU 1，8-二氮杂双环(5.4.0)十一-7-烯
DMAP 4-二甲氨基吡啶
DMTr 二甲氧基三苯甲基
DMF N-甲酰二甲胺
Py 吡啶
TBAF 四丁基氟化铵
TBDMS- 叔丁基二甲基硅烷基
TFA 三氟乙酸
TMS- 2，4，6-三甲基苯磺酰基
Ts- 对甲苯磺酰基
9-BBN 9-硼二环[3.3.1]壬烷
具体实施方式
所有溶剂、原料和试剂如不特别指名，均为分析纯或化学纯。溶剂的无水处理按照常规方法进行。
产物分离、鉴定的仪器和方法：薄层层析硅胶GF254、柱层析粗孔硅胶(200-300目)、硅胶H均为青岛海洋化工厂生产；TLC通过254nm紫外检测或用5％磷钼酸乙醇溶液显色；熔点使用XT-4A型熔点仪测定，温度计未校正；红外光谱使用DE-983G红外光谱仪测定，溴化钾压片；糖浆用液膜法。FAB和MALDI-TOF由VG-ZAB-HS和Bruker APEXTM II，HR-FAB使用BrukerBIFLEXTMIII质谱仪测定；紫外光谱使用Pharmacia LKB Biochrom 4060分光光度计测定。核磁共振谱使用Varian VXR-500、JEOL AL300、Bruker Advance 300核磁共振仪测定，氢谱、碳谱以TMS为内标；磷谱以85％H3PO4为外标；元素分析使用PE-240C元素分析仪测定。注射泵用Cole-Parmer公司生产的74900型。HPLC使用Gilson高效液相仪，使用Delter Paker C-18半制备柱分离。微波合成仪使用瑞典Biotage全自动微波合成仪。
实施例1 5-(S)-羟亚甲基-4-(R)-羟基-3-(S)-(腺嘌呤基-9’)-四氢呋喃的合成(式I中n＝1，B为腺嘌呤)
1.5-(R)-二甲氧甲基-4-(R)-羟基-3-(S)-(腺嘌呤基-9’)-四氢呋喃[5-(R)-dimethoxy-methyl-4-(R)-hydroxy-3-(S)-(adenyl-9’)-tetrahydrofuran]的合成(式III)
腺嘌呤(958mg，7.09mmol)，DBU(1.76ml，11.79mmol)置于微波反应瓶中，加入溶有化合物5-(R)-二甲氧甲基-3-(R)，4-(R)-环氧-四氢呋喃(式II，942mg，5.88mmol)的20ml无水DMF，压盖，室温搅拌10min；将反应瓶置于微波反应仪中，以中等功率微波催化，180℃，反应30min；抽滤，油泵蒸干溶剂，常压柱分离，得到产物白色固体1.45g，产率83.5％。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ3.30-3.33(d，6H，-(CH3)2)，3.78(s，1H，5-H)，4.17-4.21(m，2H，2-H)，4.40(d，1H，6-H)，4.49(m，1H，4-H)，4.82(m，1H，3-H)，5.85(d，1H，4-OH)，7.28(s，2H，NH2 in adenine)，8.12(s，1H，2-H in adenine)，8.16(s，1H，8-H in adenine).
数据表明合成产物正确。
2.5-(S)-羟亚甲基-4-(R)-羟基-3-(S)-(腺嘌呤基-9’)-四氢呋喃[5-(S)-hydroxymethyl-4-(R)-hydroxy-3-(S)-(adenyl-9’)-tetrahydrofuran]的合成
5-(R)-二甲氧甲基-4-(R)-羟基-3-(S)-(腺嘌呤基-9’)-四氢呋喃(1.30mg，4.40mmol)在氩气保护下溶于40ml水中，滴加1ml浓HCl，70℃回流反应5hr，冰浴条件下以2N NaOH中和；加入NaBH4(334mg，8.83mmol)，室温1hr，冰浴条件下以2N HCl中和，蒸干溶剂，二氯甲烷/甲醇溶解常压柱分离，得到产物白色固体960mg，产率86.8％。
1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ3.59(m，1H，6-H)，3.63(m，1H，6-H)，3.69(m，1H，5-H)，4.10-4.17(m，2H，2-H)，4.39(m，1H，4-H)，4.87(t，1H，6-OH)，4.91(m，1H，3-H)，5.76(d，1H，4-OH)，7.24(s，2H，-NH2)，8.15(s，1H，2-H in adenine)，8.19(s，1H，8-H in adenine).
数据表明合成产物正确。
实施例2[5S-(2-羟基乙基)-4R-羟基-3S-(腺嘌呤基-9-yl)]-四氢呋喃的合成，[5S-(2-hydroxyethyl)-4R-hydroxyl-3S-(adenin-9-yl)-四氢呋喃的合成(式I中n＝2，B为腺嘌呤)
1.(2R-二甲氧基甲基-3S-O-对甲苯磺酰基-4R-O-苯甲酰基)-四氢呋喃[(2R-dimethoxymethyl-3S-O-p-toluenesulfonyl-4R-O-benzoxy)-tetrahydrofuran](式IV)
(2R-二甲氧基甲基-3S-O-对甲苯磺酰基-4R-羟基)-四氢呋喃(1.99g，5.99mmol)溶解在无水吡啶(40mL)中，加入BzCl(1.05mL，9.11mmol)和DMAP(77mg，0.63mmol)。反应液室温搅拌过夜，蒸干溶剂，残渣用乙酸乙酯溶解，饱和NaHCO3溶液和饱和NaCl溶液洗，无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩。常压硅胶柱分离，石油醚-乙酸乙酯洗脱，得到淡黄色糖浆(2.56g，98.1％)。
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ2.42(s，3H，Ts-CH3)，3.32(s，3H，-OCH3)，3.46(s，3H，-OCH3)，3.90(dd，J5a，5b＝11.0Hz，J5a，4＝2.5Hz，1H，5a-H)，4.15(dd，J2，3＝3.5Hz，J2.1’＝7.0Hz，1H，2-H)，4.37(dd，J5b，4＝5.0Hz，1H，5b-H)，4.53(d，1H，1’-CH-)，5.15(dd，J3，4＝1.0Hz，J2，3＝3.5Hz，1H，3-H)，5.35(m，1H，4-H)，7.35(d，2H，Bz)，7.43-7.47(m，2H，Bz-H)，7.58-7.60(m，1H，Bz-H)，7.88(d，2H，Ts)，7.96-7.98(m，2H，Ts)；13C NMR(125MHz，CDCl3)：δ21.6，53.9，55.5，71.9，76.9，79.2，82.3，101.9，128.0，128.4，128.8，129.7，129.9，133.3，133.6，145.3，164.8；Anal.Calcd.for C21H24O8S：C，57.79；H，5.54.Found：C，57.54；H，5.46.
数据表明合成产物正确。
2.2S-(2E-对甲苯磺酰基乙烯基)-3R-O-对甲苯磺酰基-4R-O-苯甲酰基]-四氢呋喃[2S-(2E-p-toluenesulfonylethylene)-3R-O-p-toluenesulfonyl-4R-O-benzoxy]-tetra-hydrofuran](式V)
(2R-二甲氧基甲基-3S-O-对甲苯磺酰基-4R-O-苯甲酰基)-四氢呋喃(440mg，1.01mmol)溶解在87.5％的三氟乙酸水溶液(4.0mL)中，室温搅拌5小时后，蒸出大部分溶剂，以二氯甲烷溶解，饱和NaHCO3水溶液和饱和NaCl水溶液洗，无水MgSO4干燥过夜，过滤，浓缩得到白色糖泡。白色糖泡溶解在无水THF中，加入化合物Ph3P＝CHTs(475mg，1.10mmol)，室温反应20小时。加入饱和NH4Cl水溶液中止反应，加入乙酸乙酯萃取，无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩。常压硅胶柱分离，石油醚-乙酸乙酯洗脱，得到白色糖泡23(390mg，71.3％)。
[α]D 20-97.50(c＝0.040，MeOH).1H NMR(500MHz，CDCl3)δ2.44(s，6H，Ts-CH3)，3.92(dd，J5a，5b＝11.0Hz，J5a，4＝2.0Hz，1H，5a-H)，4.34(dd，J5b，4＝4.5Hz，1H，5b-H)，4.83(m，1H，2-H)，5.13(dd，J3，4＝1.5Hz，J2，3＝4.0Hz，1H，3-H)，5.41(m，1H，4-H)，6.79(dd，J1’，2’＝15Hz，J2’，2＝1.5Hz，1H，2’-H in double bond)，6.81(dd，J1’，2＝4.0Hz，1H，1’-H in double bond)，7.34-7.38(m，4H，Ts，Bz)，7.44-7.47(m，2H，Bz)，7.59-7.62(m，1H，Bz)，7.78-7.84(m，4H，Ts)，7.95-7.96(m，2H，Ts)；13C NMR(125MHz，CDCl3)δ21.6，21.7，71.6，77.3，78.2，81.5，128.0，128.1，128.6，128.7，129.8，130.0，130.3，132.4，133.7，133.8，136.8，137.5，144.6，145.8，164.8；Anal.Calcd.for C27H26O8S2：C，59.76；H，4.83.Found：C，59.90；H，5.02.
数据表明合成产物正确。
3.[2S-(2E-三丁锡基乙烯基)-3R-O-对甲苯磺酰基-4R-O-苯甲酰基]-四氢呋喃[2S-(2E-tributylstannylvinyl)-3R-O-p-toluenesulfonyl-4R-O-benzoxy]-tetrahydrofuran](式VI)
2S-(2E-对甲苯磺酰基乙烯基)-3R-O-对甲苯磺酰基-4R-O-苯甲酰基]-四氢呋喃(1.68g，3.10mmol)和AIBN(118mg，0.71mmol)溶解在无水无氧甲苯(40mL)中，加热，氩气保护下滴加Bu3SnH(2.7mL，9.7mmol)，加热回流5小时后蒸干溶剂。常压硅胶柱分离，石油醚-乙酸乙酯洗脱得到无色糖浆(1.85g，88.1％)。
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ0.88-0.93(m，15H，butyl-CH2-CH3)，1.28-1.36(m，6H，butyl-CH2-)，1.48-1.54(m，6H，butyl-CH2-)，2.39(s，3H，Ts-CH3)，3.83(dd，J5a，5b＝10.5Hz，J5a，4＝2.5Hz，1H，5a-H)，4.40(dd，J5b，4＝5.5Hz，1H，5b-H)，4.56(m，1H，2-H)，5.08(dd，J3，4＝2.0Hz，J2，3＝4.0Hz，1H，3-H)，5.39(m，1H，4-H)，6.00(dd，J1’，2＝6.0Hz，J1’，2’＝19Hz，1H，1’-H in double bond)，6.44(dd，J2’，2＝1.0Hz，1H，2’-H in double bond)，7.29-7.32(m，2H，Bz)，7.44-7.48(m，2H，Bz)，7.58-7.64(m，1H，Bz)，7.81-7.84(m，2H，Ts)，7.96-8.00(m，2H，Ts)；13C NMR(125MHz，CDCl3)δ9.4，10.7，13.6，21.6，27.2，29.0，71.1，77.7，83.1，127.9，128.1，128.4，129.0，129.7，129.8，133.5，136.0，139.7，145.1，165.0；Anal.Calcd.forC32H46O6SSn：C，56.73；H，6.84.Found：C，56.87；H，6.80.
数据表明合成产物正确。
4.(2S-乙烯基-3R-O-对甲苯磺酰基-4R-O-苯甲酰基)-四氢呋喃[(2S-vinyl-3R-O-p-toluenesulfonyl-4R-O-benzoxy)-tetrahydrofuran](式VII)
[2S-(2E-三丁锡基乙烯基)-3R-O-对甲苯磺酰基-4R-O-苯甲酰基]-四氢呋喃(129mg，0.19mmol)溶解在无水乙醇(6mL)中，加入NH4F(331mg，10.03mmol)，反应液加热回流28小时，蒸干溶剂，常压硅胶柱分离，石油醚-乙酸乙酯洗脱得到白色固体(50mg，67.6％)。
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ2.40(s，3H，Ts-CH3)，3.84(dd，J5a，5b＝10.5Hz，J5a，4＝3.0Hz，1H，5a-H)，4.39(dd，J5b，4＝4.5Hz，1H，5b-H)，4.58(m，1H，2-H)，5.07(dd，J3，4＝4.0Hz，J2，3＝1.5Hz，1H，3-H)，5.28(m，J2a’，2’b＝1.5Hz，J2’a，1’＝10.5Hz，1H，2’a-H in double bond)，5.36-5.42(m，2H，4-H，2’b-H in double bond)，5.83(m，J2’b，1’＝17.0Hz，1H，1’-H in double bond)，7.30-7.32(d，2H，Bz)，7.44-7.48(m，2H，Bz)，7.59-7.62(m，1H，Bz)，7.82-7.84(d，2H，Ts)，7.96-7.99(m，2H，Ts)；13C NMR(125MHz，CDCl3)：δ21.6，71.2，77.7，80.9，83.3，119.9，128.0，128.5，128.9，129.7，129.9，130.9，133.2，133.6，145.3，165.0；Anal.Calcd.for C20H20O6S：C，61.84；H，5.19.Found：C，61.70；H，5.32.
数据表明合成产物正确。
5.[2S-(2-O-叔丁基二甲基硅基乙基)-3R-O-对甲苯磺酰基-4R-O-苯甲酰基]-四氢呋喃[2S-(2-O-t-butyldimethylsilyl-ethyl)-3R-O-p-toluenesulfonyl-4R-O-benzoxy]-tetrahydrofuran(式IX)
(2S-乙烯基-3R-O-对甲苯磺酰基-4R-O-苯甲酰基)-四氢呋喃(169mg，0.435mmol)溶解在无水THF(3.5mL)中，氩气保护下滴加9-BBN(0.5M in THF，4.5mL，2.25mmol)，室温搅拌3小时，冰浴下加入水(1mL)，0.5M NaOH水溶液(15.8mL，7.9mmol)和30％H2O2(3.05mL，30.32mmol)，0℃搅拌3小时，加入饱和NH4Cl溶液中止反应。水相用乙酸乙酯萃取，饱和NaCl溶液洗，无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩，常压硅胶柱快速分离得到式VIII。式VIII溶解在无水DMF(3.5mL)中，加入TBDMSCl(69mg，0.46mmol)和咪唑(76mg，1.11mmol)，室温搅拌2小时，加水淬灭反应，蒸干溶剂，常压硅胶柱分离，石油醚-乙酸乙酯洗脱得到无色糖浆(137mg，60.6％)。
[α]D 20-73.08(c＝0.026，MeOH).1H NMR(500MHz，CDCl3)δ0.04(s，6H，TBDMS-CH3)，0.88(s，9H，TBDMS-tBu)，1.74-1.80(m，1H，-CH2-)，1.86-1.93(m，1H，-CH2-)，2.38(s，3H，Ts-CH3)，3.66-3.75(m，3H，5a-H，-CH2-O-)，4.28(m，1H，2-H)，4.34(dd，J5a，5b＝10.5Hz，J5b，4＝5.5Hz，1H，5b-H)，5.03(dd，J3，4＝1.0Hz，J2，3＝4.0Hz，1H，3-H)，5.31(m，1H，4-H)，7.31(d，2H，Bz-H)，7.45(m，2H，Bz-H)，7.59(m，1H，Bz-H)，7.84(m，2H，Ts)，7.95(m，2H，Ts)；13C NMR(125MHz，CDCl3)δ-5.5，-5.4，18.2，21.6，25.8，31.6，59.4，71.0，76.6，77.8，83.4，127.9，128.4，129.0，129.7，130.0，133.3，133.5，145.3，164.9；Anal.Calcd.for C26H36O7SSi：C，59.97；H，6.97.Found：C，60.14；H，6.83.
数据表明合成产物正确。
6.[2S-(2-O-叔丁基二甲基硅基乙基)-3S，4R-环氧]-四氢呋喃，[2S-(2-O-t-butyldimethylsilyl-ethyl)-3S，4R-epoxy]-tetrahydrofuran(式X)
[2S-(2-O-叔丁基二甲基硅基乙基)-3R-O-对甲苯磺酰基-4R-O-苯甲酰基]-四氢氟喃(176mg，0.34mmol)溶解在无水甲醇(4mL)中，加入无水K2CO3(224mg，1.62mmol)，室温搅拌1.5小时，用乙酸中和反应，蒸干溶剂。常压硅胶柱分离，石油醚-乙酸乙酯洗脱得到无色糖浆(74mg，89.6％)。
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ0.06(s，6H，TBDMS-CH3)，0.90(s，9H，TBDMS-tBu)，1.56-1.61(m，1H，1’-CH2-)，1.64-1.71(m，1H，1’-CH2-)，3.69-3.76(m，5H，2’-CH2-，3-H，4-H，5b-H)，3.98(d，J5a，5b＝11.0Hz，1H，5a-H)，4.23(dd，J2，1’a＝5.5Hz，J2，1’b＝7.5Hz，1H，2-H)；13C NMR(125MHz，CDCl3)δ-5.4，18.2，25.9，34.0，55.9，59.1，59.3，66.0，75.2；Anal.Calcd.for C12H24O3Si：C，58.97；H，9.90.Found：C，58.69；H，9.76.
数据表明合成产物正确。
7.[5S-(2-O-叔丁基二甲基硅基乙基)-4R-羟基-3S-(腺嘌呤基-9-yl)]-四氢呋喃，[5S-(2-O-t-butyldimethylsilyl-ethyl)-4R-hydroxy-3S-(adenin-9-yl)]-tetrahydrofuran](式XI)
腺嘌呤(130mg，0.96mmol)，DBU(0.25mL，1.64mmol置于微波反应瓶中，加入溶有化合物[2S-(2-O-叔丁基二甲基硅基乙基)-3S，4R-环氧]-四氢呋喃(121mg，0.50mmol)的20ml无水DMF，压盖，室温搅拌10min；将反应瓶置于微波反应仪中，以中等功率微波催化，180℃，反应30min；抽滤，油泵蒸干溶剂，常压柱分离，得到产物白色固体88mg，产率46.8％。
1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ0.03(s，3H，TBDMS-CH3)，0.04(s，3H，TBDMS-CH3)，0.87(s，9H，TBDMS-tBu)，1.69-1.76(m，1H，-CH2-)，1.82-1.88(m，1H，-CH2-)，3.67-3.77(m，3H，5-H，-CH2-OTBDMS)，4.10-4.17(m，2H，2-H)，4.30(m，1H，4-H)，4.85(m，1H，3-H)，5.72(d，J＝6.0Hz，1H，4-OH)，7.23(br s，2H，-NH2)，8.14(s，1H，2-H in adenine)，8.15(s，1H，8-H in adenine)；13C NMR(125MHz，DMSO-d6)δ-5.4，-5.3，17.9，25.8，36.0，59.5，61.9，68.7，78.8，80.5，119.0，139.2，149.4，152.3，156.0；Anal.Calcd.for C17H29N5O3Si：C，53.80；H，7.70；N，18.45.Found：C，53.93；H，7.770；N，18.35.
数据表明合成产物正确。
8.[5S-(2-羟基乙基)-4R-羟基-3S-(腺嘌呤基-9-yl)]-四氢呋喃，[5S-(2-hydroxyethyl)-4R-hydroxyl-3S-(adenin-9-yl)-四氢呋喃](XII)
[5S-(2-O-叔丁基二甲基硅基乙基)-4R-羟基-3S-(腺嘌呤基-9-yl)]-四氢呋喃(56mg，0.148mmol)溶解在THF(1 M in THF，0.3ml，0.3mmol)中，滴加TBAF(2ml)，室温反应3小时后，蒸干溶剂，常压硅胶柱分离，二氯甲烷-甲醇洗脱得到白色固体(26mg，66.5％)。
[α]D 20+41.07(c＝0.056，MeOH)；UV(MeOH)：λmax＝260.5nm(ε12250).1HNMR(500MHz，DMSO-d6)：δ1.68-1.75(m，1H，1’-CH2-)，1.79-1.86(m，1H，1’-CH2-)，3.35-3.60(m，2H，2’-CH2-)，3.75(m，1H，5-H)，4.12(dd，J2a，2b＝9.5Hz，J2a，3＝1.0Hz，1H，2a-H)，4.16(dd，J2b，3＝2.0Hz，1H，2b-H)，4.29(m，1H，4-H)，4.51(t，J＝5Hz，1H，2’-OH)，4.86(m，1H，3-H)，5.73(d，J＝5.5Hz，1H，4-OH)，7.25(s，2H，-NH2)，8.16(s，1H，2-H in adenine)，8.17(s，1H，8-H in adenine)；13C NMR(125MHz，DMSO-d6)：δ36.2，57.7，61.8，68.7，79.0，81.0，119.0，139.3，149.5，152.4，156.0；Anal.Calcd.for C11H15N5O3：C，49.81；H，5.70；N，26.40.Found：C，50.01；H，6.000；N，26.33.
数据表明合成产物正确。
实施例3[5S-(2-羟丙基)-4R-羟基-3S-(腺嘌呤基-9’-yl)]-四氢呋喃的合成(式I中n＝3，B为腺嘌呤)
1.{2S-[2-E(Z)-乙氧羰基乙烯基]-3R-O-对甲苯磺酰基-4R-O-苯甲酰基}-四氢呋喃，{2S-[2-E(Z)-ethoxycarboxyl-vinyl]-3R-O-p-toluenesulfonyl-4R-O-benzoxy}-tetrahydrofuran}(式XIV)
(2R-二甲氧基甲基-3S-O-对甲苯磺酰基-4R-O-苯甲酰基)-四氢呋喃(3.00g，6.78mmol)溶解在87.5％的三氟乙酸水溶液(8mL)中，室温反应5小时，蒸出大部分溶剂，残渣用二氯甲烷溶解后，用饱和NaHCO3水溶液和饱和NaCl水溶液洗，无水MgSO4干燥，过滤，浓缩得到白色糖泡。NaH(60％，275mg，6.88mmol)的无水THF(19mL)混悬液保持在-30℃，滴加(EtO)2P(O)CH2COOEt(1.43mL，6.99mmol)，搅拌约30分钟后，加入白色糖泡的THF溶液，室温反应4小时，用饱和NH4Cl溶液中止反应，水相用乙酸乙酯多次萃取，有机相无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩。常压硅胶柱分离，石油醚-乙酸乙酯洗脱得到白色固体(2.36g，74.6％)。
[α]D 20-82.00(c＝0.050，MeOH).1H NMR(500MHz，CDCl3)δ1.32(t，J＝7.0Hz，3H，-CH3)，2.41(s，3H，Ts-CH3)，3.94(dd，J5a，5b＝11.0Hz，J5a，4＝2.0Hz，1H，5a-H)，4.22(q，2H，-COOCH2-)，4.41(dd，J5b，4＝5.0Hz，1H，5b-H)，4.76(m，1H，2-H)，5.11(dd，J2，3＝4.0Hz，J3，4＝1.5Hz，1H，3-H)，5.48(m，1H，4-H)，6.09(dd，J1’，2’＝15.5Hz，J2’，2＝2.0Hz，1H，2’-H)，6.73(dd，J1’，2＝5.0Hz，1H，1’-H)，7.31(d，2H，Bz-H)，7.44-7.47(m，2H，Bz-H)，7.59-7.62(m，1H，Bz-H)，7.80(d，2H，Ts)，7.97-7.99(m，2H，Ts)；13C NMR(125MHz，CDCl3)：δ14.2，21.7，60.6，71.5，77.6，78.8，83.3，124.4，128.1，128.5，128.8，129.8，130.0，133.7，139.7，145.5，165.0，165.4；Anal.Calcd.for C23H24O8S：C，59.99；H，5.25.Found：C，59.93；H，5.27.
数据表明合成产物正确。
2.[2S-(2-乙氧羰基乙基)-3R-O-对甲苯磺酰基-4R-O-苯甲酰基]-四氢呋喃，[2S-(2-ethoxy-carboxyethyl)-3R-O-p-toluenesulfonyl-4R-O-benzoxy}-tetrahydrofuran
{2S-[2-E(Z)-乙氧羰基乙烯基]-3R-O-对甲苯磺酰基-4R-O-苯甲酰基}-四氢呋喃(4.42g，9.60mmol)溶解在THF(43mL)中，加入10％Pd-C，室温，在氢化仪上反应过夜，滤除催化剂后，浓缩，石油醚-乙酸乙酯重结晶，得到白色晶体(4.33g，97.5％)。
[α]D 20-35.71(c＝0.154，MeOH).1H NMR(500MHz，CDCl3)δ1.26(t，J＝7.0Hz，3H，-CH3)，1.87-1.94(m，1H，1’-CH2-)，1.97-2.02(m，1H，1’-CH2-)，2.38(s，3H，Ts-CH3)，2.40-2.46(m，2H，2’-CH2-)，3.72(dd，J5a，5b＝11.0Hz，J5a，4＝3.0Hz，1H，5a-H)，4.10-4.17(m，3H，2-H，-COOCH2-)，4.33(dd，J5b，4＝5.5Hz，1H，5b-H)，5.05(dd，J3，4＝1.0Hz，J2，3＝3.5Hz，1H，3-H)，5.30(m，1H，4-H)，7.31(d，2H，Bz-H)，7.44-7.47(m，2H，Bz-H)，7.58-7.61(m，1H，Bz-H)，7.84(d，2H，Ts)，7.94-7.96(m，2H，Ts)；13C NMR(125MHz，CDCl3)δ14.2，21.6，23.9，30.4，60.4，71.0，77.9，78.9，79.3，82.4，83.0，128.0，128.5，128.9，129.7，130.0，133.1，133.6，145.4，165.0，172.9；Anal.Calcd.for C23H26O8S：C，59.73；H，5.67.Found：C，59.73；H，5.63.
数据表明合成产物正确。
3.[5S-(3-羟丙基)-3S，4R-环氧]-四氢呋喃，[5S-(3-hydroxypropyl)-3S，4R-epoxy]-tetrahydro-furan(式XV)
[2S-(2-乙氧羰基乙基)-3R-O-对甲苯磺酰基-4R-O-苯甲酰基]-四氢呋喃(180mg，0.39mmol)溶解在无水THF(5mL)中，冰浴搅拌，分批加入LiAlH4(25mg，0.62mmol)，室温反应10小时，加水淬灭反应，继续搅拌过夜，过滤，浓缩。残渣用常压硅胶柱分离，二氯甲烷-甲醇洗脱得到无色糖浆(54mg，96.2％)。
[α]D 20-24.66(c＝0.073，MeOH).1H NMR(500MHz，CDCl3)δ1.41-1.48(m，1H，1’-CH2)，1.55-1.62(m，1H，1’-CH2)，1.64-1.75(m，2H，2’-CH2)，2.53(brs，1H，-OH)，3.61(d，J3，4＝3.0Hz，1H，3-H)，3.65(m，2H，3’-CH2-)，3.73(d，J5a，5b＝10.5Hz，1H，5a-H)，3.78(d，1H，4-H)，3.98(d，1H，5b-H)，4.10(dd，J2，1’a＝4.5Hz，J2，1’b＝8.0Hz，1H，2-H)；13C NMR(125MHz，CDCl3)δ27.4，28.7，55.7，58.7，62.2，65.8，77.4；Anal.Calcd.for C7H12O3：C，58.32；H，8.39.Found：C，58.24；H，8.12.
数据表明合成产物正确。
4.[5S-(3-O-叔丁基二甲基硅基-丙基)-3S，4R-环氧]-四氢呋喃[5S-(3-O-t-butyldimethylsilyl-propyl)-3S，4R-epoxy]-tetrahydrofuran](式XVI)
[5S-(3-羟丙基)-3S，4R-环氧]-四氢呋喃(458mg，3.18mmol)溶解在无水DMF(15mL)中，加入TBDMSCl(746mg，5.09mmol)和咪唑(75mg，11.07mmol)，室温搅拌3小时后，加水中止反应，浓缩，残渣用常压硅胶柱分离，石油醚-乙酸乙酯洗脱得到无色糖浆(777mg，946％)。
[α]D 20-13.21(c＝0.106，MeOH).1H NMR(500MHz，CDCl3)δ0.05(s，6H，TBDMS-CH3)，0.89(s，9H，TBDMS-tBu)，1.40-1.71(m，4H，1’，2’-CH2-)，3.60(d，J3，4＝3.0Hz，1H，3-H)，3.62-3.68(m，2H，3’-CH2-)，3.71(d，J5a，5b＝10.5Hz，1H，5a-H)，3.76(d，1H，4-H)，3.97(d，1H，5b-H)，4.09(dd，J2，1’a＝5.5Hz，J2，1’b＝7.5Hz，1H，2-H)；13C NMR(125MHz，CDCl3)：δ-5.4，18.3，25.9，27.3，28.7，55.8，58.9，62.6，65.9，77.4；Anal.Calcd.for C13H26O3Si：C，60.42；H，10.14.Found：C，60.13；H，10.32.
数据表明合成产物正确。
5.[5S-(3-O-叔丁基二甲基硅基-丙基)-4R-羟基-3S-(腺嘌呤基-9’-yl)]-四氢呋喃，[55-(3-O-t-butyldimethylsilyl-propyl)-4R-hydroxyl-3S-(adenin-9’-yl)]-tetrahydrofuran](式XVII)
腺嘌呤(515mg，3.79mmol)，DBU(0.87ml，5.70mmol)置于微波反应瓶中，加入溶有化合物[5S-(3-O-叔丁基二甲基硅基-丙基)-3S，4R-环氧]-四氢呋喃(491mg，1.90mmol)的20ml无水DMF，压盖，室温搅拌10min；将反应瓶置于微波反应仪中，以中等功率微波催化，180℃，反应30min；抽滤，油泵蒸干溶剂，常压柱分离，得到产物白色固体376mg，产率50.8％。
[α]D 20+18.18(c＝0.055，MeOH)；UV(MeOH)：λmax＝260.5nm(ε11684).1HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ0.01(s，6H，TBDMS-CH3)，0.84(s，9H，TBDMS-tBu)，1.52-1.69(m，4H，-CH2CH2-)，3.57-3.64(m，3H，5-H，-CH2-O-)，4.12(m，2H，2-H)，4.23(m，1H，4-H)，4.83(m，1H，3-H)，5.71(d，J＝5.5Hz，1H，4-OH)，7.22(br s，2H，-NH2)，8.13(s，2H，2-H，8-H in adenine)；13C NMR(125MHz，DMSO-d6)δ-5.3，17.9，25.8，28.8，29.1，62.0，62.4，68.6，78.9，83.6，119.0，139.2，149.4，152.3，156.0；Anal.Calcd.for C18H31N5O3Si：C，54.93；H，7.94；N，17.80.Found：C，54.94；H，7.747；N，17.73.
数据表明合成产物正确。
6.[5S-(2-羟丙基)-4R-羟基-3S-(腺嘌呤基-9’-yl)]-四氢呋喃[5S-(2-hydroxypropyl)-4R-hydroxyl-3S-(adenin-9’-yl)]-tetrahydrofuran(式XVIII)
[5S-(3-O-叔丁基二甲基硅基-丙基)-4R-羟基-3S-(腺嘌呤基-9’-yl)]-四氢呋喃(452mg，1.15mmol)溶解在THF(30mL)中，滴加TBAF(1M in THF，2.3ml，2.3mmol)，室温搅拌3小时后蒸出溶剂，残渣用常压硅胶柱分离，二氯甲烷-甲醇洗脱得到白色糖泡(311mg，96.9％)。
[α]D 20+37.89(c＝0.095，MeOH)；UV(MeOH)：λmax＝260.5nm(ε12035).1HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ1.48-1.62(m，3H，1’-CH2-，2’-CH2-)，1.66-1.71(m，1H，1’-CH2-)，3.42(m，2H，3’-CH2-)，3.62(m，1H，5-H)，4.11(dd，J2a，2b＝9.5Hz，J2a，3＝5.5Hz，1H，2a-H)，4.15(dd，J2b，3＝7.0Hz，1H，2b-H)，4.23(m，1H，4-H)，4.40(t，J＝5.0Hz，1H，3’-OH)，4.85(m，1H，3-H)，5.72(d，J＝5.5Hz，1H，4-OH)，7.23(s，2H，-NH2)，8.15(s，2H，2-H，8-H in adenine)；13C NMR(125MHz，DMSO-d6)δ29.0，29.4，60.6，62.0，68.6，79.0，83.7，119.0，139.2，149.5，152.4，156.0；Anal.Calcd.for C12H17N5O3：C，51.60；H，6.14；N，25.08.Found：C，51.66；H，6.206；N，24.96.
数据表明合成产物正确。
实施例4{5S-[3-O-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基)-甲基]-4R-O-[(2-氰乙基-N，N’-二异丙基)-亚磷酰胺基]-3S-(胸腺嘧啶基-1-yl)}-四氢呋喃
{5S-[3-O-(4’，4-dimethoxytriyl)-methyl]-4R-O-[(2-cyanoethyl-N，N’-diisopropyl)-phosphoramidite]-3S-(thymin-1-yl)}-tetrahydrofuran的合成(式XIX中B为胸腺嘧啶基，n＝1)
1.5-(S)-O-((4，4’-二甲氧基)-三苯甲基)-亚甲基-4-(R)-羟基-3-(S)-(胸腺嘧啶-1)-四氢呋喃[5-(S)-O-(4，4’-dimethoxytrityl)-methyl-4-(R)-hydroxy-3-(S)-(thymin-1-yl)-tetrahydrofuran]
5-(S)-羟亚甲基-4-(R)-羟基-3-(S)-(胸腺嘧啶-1)-四氢呋喃(204mg，0.84mmol)溶于无10ml无水吡啶中，经过干燥处理的DMTrCl(286mg，0.85mmol)溶于10ml无水吡啶中，冰浴搅拌下向反应物溶液中滴加吡啶溶液，室温反应36小时；以甲醇淬灭反应，油泵蒸干溶剂，常压柱分离，得到产物白色固体340mg，产率74.1％。
1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ1.61(s，3H，CH3 in thymine)，3.14-3.18(m，2H，6-H)，3.74(s，6H，-OCH3)，3.76(m，1H，5-H)，3.95-4.09(m，2H，2-H)，4.13(m，1H，4-H)，4.78(m，1H，3-H)，5.62(d，1H，4-OH)，6.88-7.38(m，13H，DMT)，7.45(s，1H，6-H inthymine)，11.30(s，1H，-NH-).
数据表明合成产物正确。
2.{5S-[3-O-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基)-甲基]-4R-O-[(2-氰乙基-N，N’-二异丙基)-亚磷酰胺基]-3S-(胸腺嘧啶基-1-yl)}-四氢呋喃{5S-[3-O-(4’，4-dimethoxytriyl)-methyl]-4R-O-[(2-cyanoethyl-N，N’-diisopropyl)-phosphoramidite]-3S-(thymin-1-yl)}-tetrahydrofuran(式XIX中B为胸腺嘧啶)
5-(S)-O-((4，4’-二甲氧基)-三苯甲基)-亚甲基-4-(R)-羟基-3-(S)-(胸腺嘧啶-1’)-四氢呋喃(305mg，0.56mmol)和1H-四氮唑(30mg，0.41mmol)预先干燥后，氩气保护下加入无水二氯甲烷，冰浴滴加亚磷酰化试剂NCCH2CH2OP[N(iPr)2]2(0.27mL，0.85mmol)，室温反应2小时，加二氯甲烷冲淡反应液，5％的NaHCO3水溶液和饱和NaCl水溶液洗，无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩。残渣用硅胶柱分离，氩气保护，石油醚-乙酸乙酯-二氯甲烷(0.5％三乙胺)洗脱得到白色糖泡(367mg，88.0％)。
31P NMR(121.5MHz，DMSO-d6)δ148.8，149.3.
数据表明合成产物正确。
实施例5.{5S-[3-O-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基)-甲基]-4R-O-[(2-氰乙基-N，N’-二异丙基)-亚磷酰胺基]-3S-(N6-苯甲酰基-腺嘌呤基-9-yl)}-四氢呋喃的合成(式XIX中B为苯甲酰基保护腺嘌呤，n＝l)
1.5-(S)-羟亚甲基-4-(R)-羟基-3-(S)-(N6-苯甲酰基-腺嘌呤基-9-yl)-四氢呋喃[5-(S)-hydroxymethyl-4-(R)-hydroxy-3-(S)-(N6-benzoyl-adenin-9-yl)-tetrahydro-furan]
5-(S)-羟亚甲基-4-(R)-羟基-3-(S)-(腺嘌呤基-9-yl)-四氢呋喃(610mg，2.43mmol)溶于无水吡啶80ml，冰浴条件下滴加TMSCl(3.3ml，25.75mmol)，室温反应2hr；冰浴条件下滴加重蒸BzCl(1.53ml，13.28mmol)，室温反应3hr；冰浴条件下，滴加浓氨水调节pH值至8-9，室温搅拌3hr，油泵蒸干溶剂，残渣用二氯甲烷/甲醇溶解，常压柱分离，洗下产物白色粉末状固体670mg，产率77.7％。
1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ3.58(m，1H，6-H)，3.65(m，1H，6-H)，3.73(m，1H，5-H)，4.18-4.24(m，2H，2-H)，4.44(m，1H，4-H)，4.93(t，J＝5.5Hz，1H，6-OH)，5.02(m，1H，3-H)，5.82(d，J＝5.5Hz，1H，4-OH)，7.54-7.57(m，2H，Bz)，7.63-7.66(m，1H，Bz)，8.04-8.05(m，2H，Bz)，8.54(s，1H，2’-H)，8.76(s，1H，8’-H)，11.16(s，1H，-NH-).13CNMR(125MHz，DMSO-d6)δ60.7，62.2，68.4，75.7，86.0，125.4，128.4，132.4，133.4，143.0，150.2，151.4，152.3，165.5.Anal.Calcd.for C17H17N5O4：C，57.46；H，4.82；N，19.71.Found：C，57.24；H，5.03；N，19.54.
数据表明合成产物正确。
2.5-(S)-O-((4，4’-二甲氧基)-三苯甲基)-亚甲基-4-(R)-羟基-3-(S)-(N6-苯甲酰基-腺嘌呤基-9’)-四氢呋喃5-(S)-O-(4，4’-dimethoxytrityl)-methyl-4-(R)-hydroxy-3-(S)-(N6-benzoyl-adenin-9-yl)-tetrahydrofuran
5-(S)-羟亚甲基-4-(R)-羟基-3-(S)-(N6-苯甲酰基-腺嘌呤基-9-yl)-四氢呋喃(1.11g，3.12mmol)溶于无40ml无水吡啶中，经过干燥处理的DMTrCl(1.17g，3.44mmol)溶于40ml无水吡啶中，冰浴搅拌下向反应物溶液中滴加吡啶溶液，室温反应36小时；以甲醇淬灭反应，油泵蒸干溶剂，常压柱分离，得到产物白色固体1.47g，产率71.6％。
1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ3.19(m，2H，-CH2-)，3.94(m，1H，5-H)，3.73(s，6H，-OCH3)，4.29-4.38(m，2H，2-H)，4.56(m，1H，4-H)，5.05(m，1H，3-H)，5.81(d，J＝6.0Hz，1H，4-OH)，6.87-6.90(m，4H，DMT)，7.20-7.32(m，7H，DMT)，7.40-7.42(m，2H，DMT)，7.54-7.57(m，2H，Bz)，7.63-7.66(m，1H，Bz)，8.04-8.06(m，2H，Bz)，8.50(s，1H，2-H in adenine)，8.74(s，1H，8-H in adenine)，11.19(brs，1H，-NH-)；13C NMR(125MHz，DMSO-d6)：δ55.0，62.1，63.5，68.5，75.0，83.3，85.3，113.1，125.7，126.6，127.7，127.8，128.4，129.7，132.4，133.4，135.6，143.1，144.8，150.3，151.2，152.3，158.0，165.6.
数据表明合成产物正确。
3.{5S-[3-O-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基)-甲基]-4R-O-[(2-氰乙基-N，N’-二异丙基)-亚磷酰胺基]-3S-(N6-苯甲酰基-腺嘌呤基-9-yl)}-四氢呋喃{5S-[3-O-(4’，4-dimethoxytriyl)-methyl]-4R-O-[(2-cyanoethyl-N，N’-diisopropyl)-phosphoramidite]-3S-(N6-benzoyl-adenin-9-yl)}-tetrahydrofuran
5-(S)-O-((4，4’-二甲氧基)-三苯甲基)-亚甲基-4-(R)-羟基-3-(S)-(N6-苯甲酰基-腺嘌呤基-9’)-四氢呋喃(370mg，0.56mmol)和1H-四氮唑(45mg，0.64mmol)预先干燥后，氩气保护下加入无水二氯甲烷，冰浴滴加亚磷酰化试剂NCCH2CH2OP[N(iPr)2]2(0.27mL，0.85mmol)，室温反应2小时，加二氯甲烷冲淡反应液，5％的NaHCO3水溶液和饱和NaCl水溶液洗，无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩。残渣用硅胶柱分离，氩气保护，石油醚-乙酸乙酯-二氯甲烷(0.5％三乙胺)洗脱得到白色糖泡(371mg，76.87％)。
31P NMR(121.5MHz，DMSO-d6)δ149.1
实施例6.根据与实施例1相同的方法制备(式I中n＝1，B为胸腺嘧啶基、尿嘧啶基、胞嘧啶基、鸟嘌呤基)所示化合物。
i.1，8-二氮杂双环(5.4.0)十一-7-烯，N-甲酰二甲胺，核苷，微波条件；ii.1％盐酸，硼氢化钠
实施例7.根据实施例2相同的方法制备式(I中n＝2，B为胸腺嘧啶基、尿嘧啶基、胞嘧啶基、鸟嘌呤基)所示化合物。
i.苯甲酰氯，4-二甲氨基吡啶，吡啶；ii.三氟乙酸/水(v∶v＝7∶1)，室温；iii.对甲苯基-2-(三苯基膦叉)甲基砜，四氢呋喃，；iv.三正丁基锡氢，偶氮二异丁腈，甲苯；v.氟化铵，乙醇；vi.a.硼烷-四氢呋喃；b.0.5N氢氧化钠，30％双氧水；vii.叔丁基二甲基氯硅烷，N-甲酰二甲胺，咪唑；viii.碳酸钾，甲醇；ix.微波，核苷，1，8-二氮杂双环(5.4.0)十一-7-烯，N-甲酰二甲胺；x.四丁基氟化铵，四氢呋喃.
实施例8.根据与实施例3相同的方法制备(式I中n＝3，B为胸腺嘧啶基、尿嘧啶基、胞嘧啶基、鸟嘌呤基)所示化合物。
i.苯甲酰氯，4-二甲氨基吡啶，吡啶；ii.三氟乙酸/水(v∶v＝7∶1)，室温；iii.磷酰基乙酸三乙酯，氢化钠，四氢呋喃；iv.钯碳，氢气，四氢呋喃；v.四氢铝锂，四氢呋喃；vi.叔丁基二甲基氯硅烷，N-甲酰二甲胺，咪唑；vii.微波，核苷，，1，8-二氮杂双环(5.4.0)十一-7-烯；x.四丁基氟化铵，四氢呋喃.
实施例9.根据与实施例4相同的方法制备(式XIX中n＝1，B为尿嘧啶基、鸟嘌呤基；n＝2，B为胸腺嘧啶、尿嘧啶基、鸟嘌呤基；n＝3，B为胸腺嘧啶、尿嘧啶基、鸟嘌呤基)所示化合物。
i.二甲氧基三苯甲基氯，吡啶；ii.2-氰乙氧基-N，N-二异丙基-氯代亚磷酰胺，四氮唑，二氯乙烷
实施例10.根据与实施例5相同的方法制备(式XIX中n＝1，B为胞嘧啶基；n＝2，B为胞嘧啶基、苯甲酰基保护的腺嘌呤；n＝3，B为胞嘧啶基、苯甲酰基保护的腺嘌呤)所示化合物。
i.a)2，4，6-三甲基苯磺酰氯，吡啶，b)苯甲酰氯，吡啶，c)氨水；ii.二甲氧基三苯甲基氯，吡啶；
iii.2-氰乙氧基-N，N-二异丙基-氯代亚磷酰胺，四氮唑，二氯甲烷
实施例11.以上实施例所得产物均为L-构型，D-构型产物的合成方法同实施例1～10。
实施例12.DNA的固相合成
DNA的合成采用Applide Biosystems model 392 DNA Synthesizer固相合成仪。正常的脱氧核苷亚磷酰化单体(dABz，dCBz，dT，dGib)，CPG(universal CPG，CPG-dC)，CAP-A和CAP-B，氧化I2液，Cl3CCOOH从北京奥科生物科技公司购买。结晶1H-四氮唑从中国医药研究开发中心有限公司(北京)购买。
合成规模：1μmol
脱氧核苷亚磷酰化单体溶液的配制：氩气保护下称量，加无水乙腈，配成2M溶液；
1H-四氮唑溶液的配制：氩气保护下称量，加无水乙腈，配成0.5M溶液；
异核苷亚磷酰化单体溶液的配制：氩气保护下称量实施例5的化合物{5S-[3-O-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基)-丙基]-4R-O-[(2-氰乙基-N，N’-二异丙基)-亚磷酰胺基]-3S-(N6-苯甲酰基-腺嘌呤基-9’-yl)}-四氢呋喃(190mg，0.21mmol)，加入无水乙腈(3ml)，配成0.07M溶液；氩气保护下称量化合物{5S-[3-O-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基)-甲基]-4R-O-[(2-氰乙基-N，N’-二异丙基)-亚磷酰胺基]-3S-(N6-苯甲酰基-腺嘌呤基-9-yl)}-四氢呋喃(243mg，0.283mmol)，加入无水乙腈(3.5ml)，配成0.08M溶液
合成步骤：每次称量约27mg CPG-dC或约20mg universal-CPG(异核苷缀合在寡核苷酸链3’端时使用)装入合成柱中，设定合成程序(标准程序)，每个合成共84步。正常核苷单体偶联3次，每次40秒，异核苷单体偶联3次，每次300秒，共计偶联时间900秒。
寡核苷酸链的切割：合成结束后，取下CPG，加入浓氨水或浓氨水/0.5MNaCl水溶液(v∶v＝5∶1)的混合液(用于universal-CPG)，恒温55℃，摇床振荡反应12小时，将寡核苷酸从CPG上切割下来并脱除保护基。离心干燥，水复溶，分离纯化。
寡核苷酸的分离纯化：
(1)合成采用DMT-on方式：HPLC纯化，Venusil XBP-C18(10μM；100A；21.5x 250mm)柱。梯度洗脱，0-40min，0％-40％B(乙腈)in A(0.05M TEAB溶液)，流速5ml/min。离心干燥所得产物，加入0.2ml 80％乙酸水溶液，0℃摇床振荡30分钟，脱除DMT保护基，离心干燥后，去离子水复溶，HPLC(Sephadex G-25)脱盐，离心干燥得到目标寡核苷酸。
(2)合成采用DMT-off方式：HPLC纯化，用离子交换和C-18反相混填柱ZORBAX Bio Series Oligo Column(6.2mm ID*80mm)。梯度洗脱，0-90min，18％-85％B(1.0M NaCl in solvent A)in A(20％CH3CN：80％0.02M NaH2PO4水溶液)，流速1ml/min。离心干燥所得产物，去离子水复溶，HPLC(SephedaxG-25)脱盐，离心干燥，得到目标寡核苷酸。
异核苷修饰中间位置的脱氧寡核苷酸ASON-I、异核苷修饰3’-端位置的脱氧寡核苷酸ASON-III和天然结构的脱氧寡核苷酸ASON-D1结构如表1所示。
表1合成脱氧寡核苷酸的结构
实施例13.RNA的固相合成
RNA的合成采用Applide Biosystems model 392 DNA Synthesizer固相合成仪。正常的核苷亚磷酰化单体(rABz，rCAc，rU，rGAc)从上海吉玛制药技术有限公司购买，脱氧胸苷亚磷酰化单体dT，CPG(CPG-dT)，CAP-A和CAP-B，氧化I2液，Cl3CCOOH从北京奥科生物科技公司购买。结晶1H-四氮唑从中国医药研究开发中心有限公司(北京)购买。
合成规模：～1μmol
核苷亚磷酰化单体溶液的配制：氩气保护下称量，加无水乙腈，配成0.12M溶液。
1H-四氮唑溶液的配制：氩气保护下称量，加无水乙腈，配成0.5M溶液
异核苷亚磷酰化单体溶液的配制：氩气保护下称量实施例4的{5S-[3-O-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基)-甲基]-4R-O-[(2-氰乙基-N，N’-二异丙基)-亚磷酰胺基]-3S-(胸腺嘧啶基-1-yl)}-四氢呋喃(172mg，0.231mmol)，加入无水乙腈(2.5ml)，配成0.092M溶液；氩气保护下称量实施例5的{5S-[3-O-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基)-甲基]-4R-O-[(2-氰乙基-N，N’-二异丙基)-亚磷酰胺基]-3S-(N6-苯甲酰基-腺嘌呤基-9’-yl)}-四氢呋喃(112mg，0.130mmol)，加入无水乙腈(1.5ml)，配成0.087M溶液；氩气保护下称量实施例5的{5S-[3-O-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基)-丙基]-4R-O-[(2-氰乙基-N，N’-二异丙基)-亚磷酰胺基]-3S-(N6-苯甲酰基-腺嘌呤基-9-yl)}-四氢呋喃(300mg，0.339mmol)，加入无水乙腈(2.8ml)，配成0.121M溶液；氩气保护下称量实施例4的{5S-[3-O-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基)-丙基]-4R-O-[(2-氰乙基-N，N’-二异丙基)-亚磷酰胺基]-3S-(胸腺嘧啶基-1-yl)}-四氢呋喃(230mg，0.298mmol)，加入无水乙腈(2.2ml)，配成0.135M溶液。
合成步骤：每次称量约27mg CPG-dT装入合成柱中，设定合成程序(标准程序)，每个合成共84步。正常核苷单体偶联3次，每次600秒，异核苷单体偶联3次，每次900秒，共计偶联时间45分钟。
RNA的切割、脱保护：合成结束后，取下CPG，加入浓氨水/乙醇(v∶v＝3∶1)混合溶液，恒温55℃，摇床振荡反应12小时，将寡核苷酸从CPG上切割下来并脱除部分保护基，离心干燥。再加入TBAF(1M in THF)，控温32℃，摇床振荡反应12小时，加入1M醋酸铵水溶液终止反应，冻干，-78℃保存。
RNA的分离纯化：混合物以DEPC水溶解，HPLC(Sephedax G-25，50％CH3CN in H2O)脱盐，离心干燥。而后HPLC方式纯化，采用离子交换和C-18反相混填柱ZORBAX Bio Series Oligo Column(6.2mm ID x 80mm)，梯度洗脱，0-60min，18％-85％B(1.0M NaCl in solvent A)in A(20％CH3CN：80％0.02MNaH2PO4水溶液)，流速1ml/min。冷冻干燥所得产物，DEPC水复溶，HPLC(Sephedax G-25)脱盐，冷冻干燥，得到目标单链RNA，-78℃保存。
异核苷修饰在siRNA正义链5’-末端(S2/As)、3’-末端(S4/As)、中间位置(S5/As)，异核苷修饰在siRNA反义链5’-末端(S/As2)、中间切割位点附近(S/As3)如表2所示。
表2.合成的siRNA
实施例14脱氧寡核苷酸和siRNA的5’端磷酸化的合成
根据与实施例12和实施例13相同的方法制备脱氧寡核苷酸和siRNA的5’端磷酸化，不同在于在5’端延长一位使用组分C代替正常的亚磷酰胺单体在相应位置进行偶联，组分C为2-氰乙氧基-N，N-二异丙基-氯代亚磷酰胺或2-氰乙氧基-N，N，N’，N’-四异丙基-亚磷酰胺。
实验例1核苷修饰的脱氧寡核苷酸的耐外切酶能力测试
(1)总体系为14μL。实施例12中的DNA的浓度为7.1μM。实验共设6组，第1组为control，其他5组分别为反应时间是0，10，20，40，60min，每组的反应液组分如表3所示。将以上各组的分别混合均匀，37℃反应。加SVPDE stop buffer(50mM EDTA in 95％ formamide，14μL)终止反应，85℃变性5分钟，迅速置于冰上。20％聚丙烯酰胺胶(7M尿素)，200V，6小时。SYBR gold染色30分钟，用Model & Storm 860 hardware and Imagequant software(Amersham Biosciences，PKU，China)进行扫描观测。
表3：DNA耐外切酶实验分组及各组反应液组份
| 组别 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| Time(min) | control | 0 | 10 | 20 | 40 | 60 |
| DNA(50pmol/μL) | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
| SVPDE(0.1μg/μL) | 0 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
| 10*Buffer*(μL) | 1.4 | 1.4 | 1.4 | 1.4 | 1.4 | 1.4 |
| H2O(μL) | 10.6 | 8.6 | 8.6 | 8.6 | 8.6 | 8.6 |
10*Buffer*：56mM Tris-HCl(pH 7.9)和4.4mM MgCl2
(2)总体积为14μL。实施例12中的DNA的浓度为7.1μM。将异核苷修饰中间位置的脱氧寡核苷酸ASON-I、异核苷修饰3’-端位置的脱氧寡核苷酸ASON-III和天然结构的脱氧寡核苷酸ASON-D1按表3比例分别混合均匀，37℃反应20min。加SVPDE stop buffer(50mM EDTA in 95％formamide，14μL)终止反应，90℃变性5分钟，迅速置于冰上。20％聚丙烯酰胺胶(7M尿素)，200V，12小时。SYBR gold染色30分钟，用Model & Storm 860 hardware andImagequant software(Amersham Biosciences，PKU，China)进行扫描观测。
实施例12中异核苷修饰中间位置的脱氧寡核苷酸ASON-I、异核苷修饰3’-端位置的脱氧寡核苷酸ASON-III和天然结构的脱氧寡核苷酸ASON-D1分别与蛇毒磷酸二酯酶孵育后，发现ASON-III具有很强的抵抗3’-外切酶切割的能力。反应20min后，未经修饰的ASON-D1只余11％未被降解，ASON-I和ASON-D1类似，只余9％未被降解，而3’-末端异核苷修饰的ASON-III几乎没有被降解(图1a、1b)。3’-末端缀合的异核苷不能被蛇毒磷酸二酯酶识别和切割，使ASON-III具有显著的耐3’-外切酶降解的能力。
实验例2核苷修饰的脱氧寡核苷酸激活RNase H能力研究
将异核苷修饰的寡核苷酸链激活RNase H的性质与未经修饰的作了比较。从图2-a可以看出，ASON-III(异核苷修饰3’-端位置)/RNA双链和ASO(正常天然结构的脱氧寡核苷酸)/RNA双链激活RNase H的能力相当，而ASON-I(异核苷修饰中间位置)/RNA则表现出更强的激活RNase H的能力，双链中的RNA链比较容易被水解。图2-b表征了各个脱氧寡核苷酸/RNA杂交双链激活RNase H后，随着时间的增加，RNA被RNase H酶降解的百分数。由这样的一个定量计算结果可以更清楚地观察到ASON-I(异核苷修饰中间位置)/RNA激活RNase H的效率最高。推测异核苷在寡核苷酸链中间掺入后，使“A-form”杂交双链的结构趋于松散，双螺旋柔性增加，使RNase H能够更好的识别ASO/RNA双链，降解靶mRNA。ASON-III中异核苷修饰在3’-末端，对杂交双链的二级结构不会造成太大的影响，因此其激活RNase H的能力与未经修饰的类似。
实验例3核苷修饰的siRNA的活性测试
实施例13的异核苷修饰的siRNAs沉默活性测试，采用siQuantTM方法，以Lippfectamine 2000作为转染试剂，检测siRNAs对人胚胎肾细胞(HEK-293)的抑制效率。Dual-Luciferase实验初步结果如图3所示，实施例13中异核苷修饰的siRNA，当异核苷在siRNA正义链5’-末端(S2/As)、3’-末端(S4/As)或中间位置(S5/As)修饰时，对抑制效率影响都不大，能够保持很好的沉默靶mRNA的活性；而异核苷在siRNA反义链修饰时，其抑制效率均明显下降，在实验例13中异核苷修饰siRNA，在5’-末端(S/As2)修饰时还能保留中等程度抑制率(54％)，在反义链中间切割位点附近(S/As3)修饰时，siRNA只保留了很弱的抑制活性(27％)。
由此可见，siRNA反义链中间部位和5’-末端都不耐受异核苷的修饰，而这两个位点也是与siRNA解链、切割活性息息相关的位点，异核苷掺入造成双链构象等的改变，且本身结构的不同，对RISC的结构和功能可能产生较大影响。而siRNA正义链则能较大程度的耐受异核苷的修饰，活性不受影响。
根据初步的试验结果推测，异核苷在正义链中修饰，并不影响siRNA的沉默活性，且有可能抑制正义链进入RISC而产生的“off-target”效应。
本文显示并详细描述的信息足以实现本发明的上述目的，因此本发明的优选实施方案代表本发明的主题，该主题为本发明所广泛涵盖。本发明的范围完全涵盖其它对本领域技术人员来说显而易见的实施方案，因此，本发明的范围不被除所附权利要求之外的任何内容所限制，其中除了明确说明外，所用元素的单数形式并不是指“一个和唯一”，而是指“一个或更多”。对本领域一般技术人员来说，所有公知的上述优选的实施方案和附加实施方案部分的结构、组成和功能上的等价物因此引入本文作参考，而且试图被本发明的权利要求所涵盖。
此外，不需要某种设备或方法来表达本发明所解决的每个问题，因为它们都已包括在本发明的权利要求之内。另外，无论本发明公开事实中的所有部分、成分，或者方法步骤是否在权利要求中被明确叙述，它们都没有贡献给公众。但是，对本领域普通技术人员来说，很明显在不背离如所附权利要求中所阐明的本发明的实质和范围的前提下，可以在形式、试剂和合成细节上做出各种改变和修饰。
Claims (2)
1.一种异核苷化合物的制备方法，该异核苷化合物具有如式I所示的结构：
其中，n=3；B为胸腺嘧啶基(T)、尿嘧啶基(U)、胞嘧啶基(C)、鸟嘌呤基(G)或腺嘌呤基(A)，其特征在于，
式I中的L-构型对映异构体采用如下的合成方法：
A.将式IV中所示中间体与苯甲酰氯反应，使苯甲酰氯对3’羟基进行保护；
Ｂ.将苯甲酰基保护后的式IV所示的化合物经酸水解后，得到式XIII中所示化合物；再将组分P，在四氢呋喃中与氢化钠反应一段时间后，加入式XIII中所示化合物，反应得式XIV中所示化合物，组分P为磷酰基乙酸三乙酯；
Ｃ.将式XIV中所示化合物经催化氢化还原后，用氢化铝锂还原，得到式XV中所示化合物，再在N，N-二甲基甲酰胺中与咪唑，叔丁基二甲基氯硅烷反应或在吡啶中与4-二甲氨基吡啶，叔丁基二甲基氯硅烷反应，得到式XVI中所示化合物；
XV XVI
Ｄ.将式XVI中所示化合物，通过微波辅助加热法与1,8-二氮杂双环(5.4.0)十一-7-烯(DBU)和不同碱基反应生成式XVII中所示化合物，其中的碱基包括胸腺嘧啶基、尿嘧啶基、胞嘧啶基、腺嘌呤基或鸟嘌呤基，再在四氢呋喃中与四丁基氟化铵反应，脱去叔丁基二甲基硅醚基，得到式XVIII中所示化合物；
式I中的D-构型对映异构体以式IV的L-构型对映异构体为原料采用上述相同的合成方法合成得到。
2.根据权利要求1所述的异核苷化合物的制备方法，其中所述微波辅助加热法的反应条件是利用微波合成仪，以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，时间30min，温度180℃，吸收水平为高，预搅拌时间30~60s。
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