CN102209522B - 调节皮肤色素沉着的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及对研究或调节黑色素在皮肤中的色素沉着有用的组合物和方法。具体地说,本发明涉及包括能够调节ALK6(SEQ?ID?2)或Cdc42的活性或表达从而能够对黑色素从黑素细胞到角化细胞以及潜在地从角化细胞到角化细胞的转移进行调节的物质的组合物。本发明也涉及鉴定这种组合物的试验,以及调节皮肤色素沉着的方法。
Description
技术领域
本发明涉及对研究或调节黑色素在皮肤中的色素沉着有用的组合物和方法。具体但是不独占地说,本发明涉及能够对黑色素从黑素细胞到角化细胞以及潜在地从角化细胞到角化细胞的转移进行调节的组合物,鉴定这种组合物的试验,以及调节皮肤色素沉着的方法。
背景技术
黑素细胞是沿着表皮和毛球的基底层分布的神经嵴源性细胞。这些细胞在称为黑素体的黑素细胞特异性细胞器内部合成黑色素。对于色素沉着的皮肤和头发,这种黑素素必须从黑素细胞转移到相邻的角化细胞。在涉及大量步骤被一系列分子和化合物在多个控制点上控制的过程中,黑色素的数量和质量(棕/黑真色素或红/黄褐黑素)决定哺乳动物的皮肤和头发/羊毛/毛皮的颜色。在过去的二十年里,人类在理解黑色素合成和黑素体生源/成熟的分子控制方面取得了很多进步。然而,人类知识的显著空白集中在黑色素转移是怎样被控制的一主要的临床/化妆品兴趣点,因为这个过程最终控制在皮肤表面和沿着毛发纤维所察觉到的色素沉着水平。
在本申请中描述了一种控制黑色素从人体皮肤黑素细胞转移到人体皮肤角化细胞的新机制。该机制涉及BMP6的行为,其以剂量依赖的方式激发该过程。
骨形态发生蛋白(BMPs)是属于TGF-β超家族的分泌的信号分子。它们在细胞增殖,细胞分化,细胞运动,细胞黏着和细胞死亡方面发挥重要作用(Hogan1996)。迄今为止,已经描述了20个以上不同的BMP家族成员,而且每个都通过与特异性BMP受体的相互作用发挥其生物活性(Wozney等,1988)。BMP信号在多个水平上运行取决于BMP类型,拮抗剂的存在,靶组织的发展阶段,以及靶细胞受体类型(Botchkarev2003)。BMPs结合两个跨膜受体家族,多重BMP受体(BMPR)I和单个BMPRII(Hogan1996)。有趣地是,为了启动信号,BMP必须结合两个受体,通过BMP-RII诱导BMPRI中细胞内域的磷酸化并且活化细胞内信号转导。
BMPs是皮肤发展的有力监管者,而且它们也在调控表皮动态平衡,毛囊生长,和正常产后皮肤中黑素生成方面发挥重要作用(Botchkarev2003)。黑素细胞是在胚胎形成过程中迁移至表皮和毛囊的而且随后合成黑色素和将黑色素分配给周围角化细胞的神经嵴源性细胞(Halaban等2003)。有趣地是,有许多BMPRI受体,BMPRIA(ALK3;SeqID4),BMPRIB(ALK6;SeqID2),和ActR-I(ALK2)(Kawabata等,1998)而且通过ALK3诱导它们的增殖同时通过ALK6诱导它们的分化在神经前体细胞中发信号(Panchision等,2001),这表明受体表达决定BMP对细胞的作用。
Gilchrest小组首先在研究中示出BMP4在黑素细胞生物学中的作用,该研究表明特定的BMP家族成员通过抑制黑素细胞中的限速酶(酪氨酸酶)的表达和活性而扮演正常人体黑素细胞中的黑素生成自分泌抑制剂的角色(Yaar等,2006)。
然而,至今还没有报道其他BMP蛋白质与黑素细胞生物学(例如黑素生成和/或黑色素转移)有关。虽然已经对黑素细胞中黑素生成(即黑色素合成)的调控了解很多,但是我们关于黑素体怎样从黑素细胞转移到角化细胞的知识还很有限。除了细胞质-吞噬作用,越来越多的证据支持黑素体通过可以与角化细胞质膜相互作用的丝状伪足转移的观点(Scott等,2002,Singh等,2008)。重要地是,与由黑素细胞树突的侧面和末梢引起的并且在其内腔中包含黑素体的丝状伪足一致的结构已经在humanskininsituaswellasinvitro(Scott等,2002)中进行了报道。
发明内容
根据本发明的第一方面,提供了一种对受体的皮肤和/或头发的黑色素色素沉着进行调节的方法,方法包括给受体服用组合物,该组合物包括可以对ALK6(SEQID2)或Cdc42的活性或表达进行调节的物质。
在本发明优选的实施例中,物质通过调节ALK6的活性调节Cdc42的表达。
在本发明优选的实施例中,方法包括将组合物涂在受体的皮肤和/或头发的外表面上。
为了调节皮肤的色素沉着,有两个方法:调节黑素生成和调节黑色素的转移。本发明可以包括这些方法的一个,另一个或两个方法都包括。然而,本发明的发明人尤其对调节黑色素转移的方法感兴趣,因为发明人已经发现可以有效地以黑色素转移为目标。假设黑色素转移是比黑素生成更“下游”的过程,那么在避免副作用方面,黑色素转移是更有吸引力的目标。
合适地是,该方法是化妆品的方法,其在用化妆品调节皮肤和/或头发的黑色素色素沉着水平使皮肤和/或头发颜色变淡或变深方面有用。
可选地,该方法可以用于为受体提供一定程度的光保护。众所周知黑色素保护皮肤免受紫外线照射的许多有害作用。因此,增加受体的皮肤中的黑色素量可以显著地降低阳光诱发的损伤,例如细胞的突变潜在地导致癌症或早熟衰老症。
在另一个可替换实施例中,该方法可以用于治疗与皮肤的非正常色素沉着相关的疾病。这种治疗可以是治愈的,或可能是用于缓解症状。与皮肤的变异色素沉着相关的可以治疗的疾病或医疗疾病包括色素沉着过度(例如黑斑病,黄褐病,衰老性着色斑,日光性着色斑,雀斑,炎症后色素沉着过度)和色素减退(例如,白癜风,和炎症后色素减退)和皮肤损伤带来的色素沉着减少。
在一个实施例中,物质可以增加与正常生理水平相比的ALK6的活性或表达,即ALK6激动剂。在特定的实施例中,物质可以以增加黑色素转移的方式增加ALK6的活性或表达。ALK6的活性的增加将使皮肤和/或头发中的黑色素增加。
在另一个实施例中,物质可以降低与正常生理水平相比的ALK6的活性或表达,即ALK6拮抗剂。在特定的实施例中,物质可以以降低黑色素转移的方式降低ALK6的活性或表达。ALK6的活性的降低将使皮肤和/或头发中的黑色素降低。
在一个实施例中,本发明的方法涉及包含BMP6多肽(编号NM_001718;SeqID1)或片段或其变体的组合物的应用,其中所述片段或变体是功能活性的。
以野生型BMP6至少50%的活性活化ALK6的片段或变体可以称为是功能活性的,尽管较低的活性水平可能也是有用的。更优选的这种片段或变体的活性应该是野生型BMP6的活性的至少75%,尤其优选是野生型BMP6的活性的90%。具体地说,本文中的“活性”可以在以下描述的试验中表示激发黑色素从黑素细胞转移到角化细胞的能力。
正如使用以下将要描述的实验所确定的,“功能活性的”BMP6片段或变体表现出增加黑素生成或黑色素转移的能力。BMP6蛋白质,变体,和片段的功能活性可以通过本领域技术人员已知的各种方法进行检验(CurrentProtocolsinProteinScience(1998)Coligan等,eds.,JohnWiley&Son,Inc.,Somerset,NewJersey)而且在以下进一步描述。
为了本文的目的,功能活性的片段可以包括那些包含BMP6的一个或多个结构域的片段,例如结合域,因为所述域具有所需的活性。可以使用PFAM程序鉴别蛋白质域(BatemanA.,等,NucleicAcidsRes,1999,27:260-2)。在一些实施例中,优选的片段是功能活性的,域包含片段包括至少25个连续的氨基酸,优选至少50,更优选75,而且最优选BMP6有效域的至少100个连续的氨基酸。在更优选的实施例中,片段包括整个功能性的有效域。
功能性的活性片段或变体包括重组BMP6多肽及其功能活性片段或变体,包括被BMP6-编码核酸编码的那些。
功能性的活性BMP6多肽可以理论上包括BMP6前体蛋白质(编号P22004)(序列号1)。据相信,成熟的BMP6多肽包括相同的氨基酸374-513。
功能性的活性片段可以包括多肽,该多肽包括BMP6前体(序列号1)的氨基酸382-513,388-513和412-513。
术语“BMP6-编码核酸”是指编码BMP6多肽的DNA或RNA分子。
优选地是,BMP6多肽或核酸或变体或其片段来自人体,但是也可以是其同源物或衍生物。
优选所述变体或其片段具有与人类BMP6或序列编码BMP6(NM001718)至少70%的序列一致性,优选至少80%,更优选85%,进一步优选90%,和最优选至少95%的序列一致性。
如本文中所使用的,关于目标序列或目标序列的特定部分的“百分比(%)序列一致性”被定义成候选衍生序列中的核苷酸或氨基酸与目标序列(或其特定部分)中的核苷酸或氨基酸的百分比,在对齐序列和引入间隙之后,如果需要获得最大的百分比序列一致性,如通过所有检索参数设定在缺省值的程序WU-BLAST-2.0al9(Altschul等,J.Mol.Biol.(1997)215:403-410)所产生的。HSPS和HSPS2参数是动态值并且通过程序建立,程序本身取决于具体序列的组成和搜索所需序列的特定数据库的组成。A%一致性值由匹配的相同核苷酸或氨基酸的数量决定,核苷酸或氨基酸是由被报告百分比一致性的序列长度所分割的。确定“百分比(%)氨基酸序列相似性“的计算与确定%氨基酸序列一致性的计算相同,但是在计算中除了相同氨基酸以外还包括保守氨基酸取代物。
保守氨基酸取代物是指其中的氨基酸被具有相似性质的另一个氨基酸取代使得蛋白质的折叠或活性不受到显著的影响。可以互相取代的芳香族氨基酸是苯丙氨酸,色氨酸,和酪氨酸;可以互换的疏水氨基酸是亮氨酸,异亮氨酸,蛋氨酸,和缬氨酸;可以互换的极性氨基酸是谷氨酰胺,赖氨酸和组氨酸;可以互换的酸性氨基酸是天冬氨酸和谷氨酸;和可以互换的小氨基酸是丙胺酸,丝氨酸,苏氨酸,半胱氨酸和甘氨酸。
可选地,Smith和Waterman的局部同源性算法提供了核酸序列的对齐方式(Smith和Waterman,1981,AdvanceinAppliedMathematics2:482-489;数据库:EuropeanBioinformaticsInstitute;Smith和Waterman,1981,J.ofMolec.Biol.,147:195-197;Nicholas等,1998,“ATutorialonSearchingSequenceDatabasesandSequenceScoringMethods”(www.psc.edu)和其中引用的参考文献;W.R.Pearson,1991,Genomics11:635-650)。通过使用Dayhoff(Dayhoff:AtlasofProteinSequencesandStructure,M.O.Dayhoffed.,5suppl.3:353-358,NationalBiomedicalResearchFoundation,Washington,D.C.,USA)开发的和Gribskov(Gribskov1986Nucl.AcidsRes.14(6):6745-6763)标准化的计分矩阵可以将算法应用到氨基酸序列上。可以使用Smith-Waterman算法,其中使用缺省参数计数(例如,12的比较结果中一个空隙的罚分,2的比较结果中一个空隙每延长一碱基的罚分)。从产生的数据,“匹配”值反映“序列一致性”。
目标核酸分子的衍生核酸分子包括与编码BMP6的核酸序列杂交的序列。在杂交和清洗过程中,温度,离子强度,pH,和变性剂例如甲酰胺的存在可以控制杂交的严格。用容易获得的过程文本阐述通常使用的条件(例如CurrentProtocolinMolecularBiology,Vol.1,Chap.2.10,JohnWiley&Sons,Publishers(1994);Sambrook等,MolecularCloning,ColdSpringHarbor(1989))。
在一些实施例中,本发明的核酸分子可以与包含BMP6的核苷酸序列的核酸分子在高严格杂化条件下杂化:在包含6×单强度柠檬酸(SSC)(1×SSC是0.15MNaCl,0.015M柠檬酸钠;pH7.0),5×Denhardt’s溶液,0.05%焦磷酸钠和100g/ml鲱鱼精DNA的溶液中,含有核酸的过滤器在65℃下预杂化8小时到过夜;在含有6×SSC,1×Denhardt’s溶液,100μg/ml酵母tRNA和0.05%焦磷酸钠的溶液中,在65℃下杂化18-20小时;在65℃下然后在含有0.1×SSC和0.1%SDS(十二烷基硫酸钠)的溶液中清洗过滤器1小时。
在其他实施例中,使用的中等严格的水解条件是:在包含35%甲酰胺,5×SSC,50mMTris-HCl(pH7.5),5mMEDTA,0.1%PVP,0.1%Ficoll,1%BSA,和500μg/ml变性的鲑精DNA的溶液中,含有核酸的过滤器在40℃下预处理6小时;在含有35%甲酰胺,5×SSC,50mMTris-HCl(pH7.5),5mMEDTA,0.02%PVP,0.02%Ficoll,0.2%BSA,100μg/ml变性的鲑精DNA,和10%(wt/vol)右旋糖酐硫酸酯的溶液中,在40℃下杂化18-20小时;然后在55℃下在含有2×SSC和0.1%SDS的溶液中分两次清洗1小时。
可选地,可以使用的低严格条件是:在含有20%甲酰胺,5×SSC,50mM磷酸钠(pH7.6),5×Denhardt’s溶液,10%右旋糖酐硫酸酯,和20μg/ml变性的被修饰的鲑精DNA的溶液中在37℃下孵化8小时;在相同的缓冲液中杂化18到20小时;然后在约37℃条件下在1×SSC中清洗滤器1小时。
在另一个实施例中,方法包括组合物的应用,该组合物包括可以与BMP6键合并且使BMP6失活的化合物。因此,本发明可以与BMP6的拮抗剂相关。例如,化合物可以是能够与BMP6键合的抗体或其片段。
可以使用已知的方法产生与BMP6多肽特异性键合的抗体。优选对BMP6多肽的哺乳动物直系同源特异的抗体,而且更优选对人类BMP6特异的抗体。抗体可以是多克隆的,单克隆的(mAbs),人源化抗体或嵌合抗体,单链抗体,Fab片段,F(ab′)2片段,由FAb表达文库产生的片段,抗独特性(抗-Id)抗体,和以上任何的表面抗原结合片段。可以选择特别抗原性的BMP6表面抗原,例如为了抗原性的BMP6多肽的常规筛选或为了选择蛋白质的抗原区域通过施加理论方法给BMP6的氨基酸序列(Hopp和Wood(1981),Procc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:3824-28;Hopp和Wood(1983)Mol.Immunol.20:483-89;Sutcliffe等,(1983)Science219:660-66)。通过上述标准程序可以制造相似性是108M-1,优选109M-1到1010M-1,或更强的单克隆抗体(Harlow和Lane,supra;Goding(1986)MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice(2ded)AcademicPress,纽约;和美国专利第4,381,292号;和4,618,577号)。
抗体可以针对BMP6的粗细胞提取物或其基本纯化的片段产生。如果使用BMP6片段,它们优选包括至少10个,和更优选,至少20个BMP6蛋白质的连续氨基酸。BMP6-特异的抗原和/或免疫原可以与激发免疫应答的载体蛋白连接。例如,目标多肽与锁孔血蓝蛋白(KLH)的载体共价连接,而且共轭物在费式完全佐剂中乳化,其提高了免疫应答。根据传统的实验方案使合适的免疫系统例如实验室兔或实验小鼠免疫。
通过合适的实验例如使用固定的相应BMP6多肽的固相酶联免疫吸附试验(ELISA)检验BMP6-特异性抗体的存在。也可以使用其他试验例如放射性免疫测定或荧光测定。
可以将BMP6多肽特异的嵌合抗体制造成包含来自不同动物种族的不同部分。例如,免疫球蛋白恒定区可以与鼠科mAb的各种区域连接,使得抗体从人类抗体衍生出生物活性,和从鼠科片段衍生出键合特异性。将基因拼接在一起产生嵌合抗体,该基因对来自各个种族的合适区域进行编码(Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.(1984)81:6851-6855;Neuberger等,Nature(1984)312:604-608;Takeda等,Nature(1985)31:452-454)。
人源化抗体(嵌合抗体的一种形式)可以通过借助重组DNA技术将小鼠抗体的互补决定区(CDRs)(Carlos,T.M.,J.M.Harlan.1994.Blood84:2068-2101)移植到人类的框架区域和恒定区域的背景中产生(RiechmannLM等,1988Nature323:323-327)。人源化抗体包含鼠科序列和人类序列,从而进一步降低或消除免疫抗原性,而同时保留抗体特异性(CoMS,和QueenC.1991Nature351:501-501;MorrisonSL.1992Ann.Rev.Immun.10:239-265)。人源化抗体及其产生方法是本领域公知的(美国专利第5,530,101,5,585,089,5,693,762,和6,180,370号)。
可以通过本领域公知的方法产生重组的BMP6-特异性单链抗体,通过使Fv区域的重和轻链片段借助氨基酸桥连接形成的单链多肽(美国专利第4,946,778;Bird,Science(1988)242:423-426;Huston等,Proc.Natl.Acad.Sci.美国(1988)85:5879-5883;和Ward等,Nature(1989)334:544-546)。
用于抗体产生的其他合适技术包括淋巴细胞暴露给抗原性多肽或可选地暴露给噬菌体载体或类似载体中的抗体库的选择(Huse等,Science(1989)246:1275-1281)。
本发明的多肽和抗体可以改性使用或不改性使用。通常,抗体通过连接物质进行标记(共价的或非共价的),该物质提供可检测的信号,或是对表达目标蛋白的细胞有毒的物质(MenardS等,IntJ.BiolMarkers(1989)4:131-134)。大量的标记和共轭技术都是公知的而且在科学和专利文献中都有广泛报道。合适的标记包括放射性核素、酶、酶作用物、辅因子、抑制剂、荧光部分、荧光发光镧系金属,化学发光部分,生物发光部分,磁性粒子等(美国专利第3,817,837;3,850,752;3,939,350,;3,996,345;4,277,437;4,275,149;和4,366,241)。同样,可以产生重组的免疫球蛋白(美国专利第4,816,567号)。可以传输细胞质多肽的抗体而且抗体通过与膜穿透毒蛋白结合到达它们的靶点(美国专利第6,086,900)。
在另一个实施例中,方法涉及包括化合物的组合物的应用,该化合物可以与ALK6键合并且活化或阻滞ALK6的活性。例如,这种化合物可以是可以与ALK6键合的抗体或其片段。因此,本发明可以包括ALK6的激动剂或拮抗剂。例如,抗体可以键合ALK6和阻止BMP6的键合,从而防止BMP6活化ALK6和驱动黑素生成或黑色素转移。以上列举了抗体产生的公知技术的细节。
在另一个实施例中,方法涉及包括核酸的组合物的应用,该核酸能够通过与DNA或RNA的相互作用调节ALK6或Cdc42的表达,DNA或RNA为ALK6或Cdc42或其功能部分编码。在优选的实施例中,核酸是RNA分子,尤其是可以对mRNA编码ALK6或Cdc42进行针对性的反义核酸相互作用或RNA干扰的RNA分子。例如,用于靶向Cdc42mRNA的合适RNAi分子可以是5′-GAUAACUCACCACUGUCCATT-3′和5′-UGGACAGUGGUGAGUUAUCTT-3′寡核糖核苷酸;或可以用于抑制Cdc42的5′-GACUCCUUUCUUGCUUGUUTT-3′和5′-AACAAGCAAGAAAGGAGUCTT-3′寡核糖核苷酸,或其他这种合适的和特异性的序列。其在本领域技术人员确定其他合适的序列的技能范围内,该序列可以表现出针对ALk6或Cdc42mRNA的RNAi。
RNAi是序列特异性的转录后基因在动植物中沉默的方法,由与沉默的基因序列同源的双链RNA(dsRNA)激发。关于RNAi在C.elegans,Drosophila,植物,和人类的沉默基因中的应用的方法是本领域公知的(FireA等,1998Nature391:806-811;Fire,A.TrendsGenet.15,358-363(1999);Sharp,P.A.RNA干扰2001。GenesDev。15,485-490(2001);Hammond,S.M.等,NatureRev.Genet.2,110-1119(2001);Tuschl,T.Chem.Biochem.2,239-245(2001);Hamilton,A等,Science286,950-952(1999);Hammond,S.M.等,Nature404,293-296(2000);Zamore,P.D.等,Cell101,25-33(2000);Bernstein,E等,Nature409,363-366(2001);Elbashir,S.M.等,GeneDev.15,188-200(2001);W00129058;W09932619;ElbashirSM等,2001Nature411:494-498;NovinaCD和SharpP。2004Nature430:161-164;SoutschekJ等2004Nature432:173-178)。
核酸调节剂通常用作研究试剂,诊断法,和治疗法。例如,可以以强特异性抑制基因表达的反义寡核苷酸通常用于阐明特定基因的功能(参考例如美国专利6,165,790)。核酸调节剂通常用于例如区分生物途径的各个成员的功能。例如,反义低聚物已经用于动物和人类的疾病状态中的治疗部分而且已经证明在许多临床试验中是安全和有效的(MilliganJF等,CurrentConceptsinAntisenseDrugDesign,JMedChem.(1993)36:1923-1937;TonkinsonJL等,AntisenseOligodeoxynucleotidesasClinicalTherapeuticAgents,CancerInvest。(1996)14:54-65)。
在一个实施例中,方法包括确定组合物的方法的应用,该确定组合物的方法是确定以下列举的影响ALK6或Cdc42的物质的方法。
在本发明优选的实施例中,物质是ALK6的拮抗剂。适合用于本发明的一些ALK6拮抗剂包括硬化蛋白,腱蛋白样蛋白质和卵泡抑素相关蛋白(FSRP)。在特别优选的实施例中拮抗剂是硬化蛋白(SEQID3)。
通常优选小分子调节具有酶功能和/或包含蛋白质作用域的蛋白质的功能。在本领域称为“小分子”化合物的化学试剂是典型的有机,非肽类分子,具有大于10,000的分子量,优选大于5,000,更优选大于1,000,和最优选大于500道尔顿。这类调节剂包括化学合成的分子,例如来自组合化学库的化合物。合成化合物可以是基于ALK6已知的或推断的性质设计或确定的或可以是通过筛选化合物库确定的。可选的合适的这一类调节剂是天然化合物,尤其是来自有机体例如植物或真菌的次生代谢产物,其也可以由于ALK6-调节活性而被筛选化合物库确定。产生和获得化合物的方法是本领域公知的(SchreiberSL,Science(2000)151:1964-1969;RadmannJ和GuntherJ,Science(2000)151:1947-1948)。
由筛选试验确定的小分子化合物调节剂,如以下描述的,可以用作先导化合物,候选的临床化合物可以从先导化合物设计,优化,和合成。候选小分子调节剂的活性可以通过迭代二级功能验证(如以下进一步描述的),结构确定,和候选调节剂改性和测试而改进几倍。另外,产生具有特定临床和药理性质的候选临床化合物。例如,试药可以进行衍生化和使用体外和体内试验再筛选从而为药物开发优化活性和降低毒性。
ALK6的拮抗剂可以抑制黑色素从黑素细胞转移到角化细胞,从而降低皮肤和/或头发色素沉着。另一方面,ALK6的激动剂可以促进黑色素从黑素细胞转移到角化细胞,从而增加皮肤和头发色素沉着。从美容的角度看这两种效果都是需要的,另外这种效果可以带来医疗好处。例如为了美容,目前在西欧和美国(和其他地方)需要被太阳晒黑的外表。在一些亚洲国家,为了美容,需要具有相对白皙的外表。另外,从保护的角度看,由于黑色素可以保护皮肤免受太阳的伤害作用,可能需要增加皮肤中的黑色素含量。
受体优选是哺乳动物,优选是灵长类和尤其是人类。
本发明的另一个方面提供了一种组合物,该组合物包括可以调节ALK6或Cdc42的活性或表达的物质,用于调节受体的皮肤和/或头发的色素沉着。以上提供了合适的物质的细节,而且调节的目的可以是美容或治疗方面的。
特别优选的物质包括BMP6或功能活性的变体或其片段,和硬化蛋白。
本发明的另一个方面提供了包括可以调节ALK6或Cdc42的活性或表达的物质的组合物在生产药物方面的用途,该药物是用于治疗与皮肤的反常色素沉着相关的的疾病。这种治疗可以是治愈作用的,或可以是为了缓解症状。
通常需要根据本发明的组合物是适合皮肤外敷剂的。可以使用任何常用的外用剂型例如溶液,悬浮剂,凝胶,乳霜,软膏或油膏等。这种外用剂型的制备在制药配方领域作为例子进行描述,例如,Gennaro等(1995)Remington′sPharmaceuticalScience,MackPublishing中描述的。对于外敷剂,组合物也可以作为粉末或喷雾给药,尤其是以气溶胶的形式。
根据本发明的又一方面,提供了一种评估物质调节黑色素从黑素细胞转移到角化细胞或潜在地从角化细胞转移到角化细胞的能力的方法,该方法包括以下步骤:
-提供测试物质;以及
-确定测试物质与ALK6相互作用的能力。
在一些实施例中,方法包括确定物质与ALK6键合的能力。ALK6可以在细胞上,或可以提供在支架上。
方法优选包括提供细胞表达ALK6和确定测试物质与被所述细胞表达的ALK6相互作用的能力,尤其是在细胞的表面上表达的ALK6。
优选表达ALK6的细胞是黑素细胞。
通过确定测试物质与ALK6相互作用的能力,可以确定有潜力在调节黑素转移或黑素生成方面具有活性的物质。
本发明的方法优选包括确定测试物质调节ALK6的活性和/或表达的能力。
在一个实施例中,方法可以包括确定测试物质活化ALK6的能力,即确定测试物质是否是ALK6的激动剂。
在可选的实施例中,方法可以包括确定测试物质使ALK6失活的能力,即确定测试物质是否是ALK6的拮抗剂。
本领域的技术人员有许多方法可以确定测试物质是否可以调节ALK6的活性。例如,可以确定测试物质对下游信号分子的影响,下游信号分子受到ALK6活性化的影响。可选地,可以确定测试物质对mRNAs或蛋白质的表达的影响,mRNAs或蛋白质的表达受到ALK6活性化的影响。这可以包括确定,例如a)R-Smads的补充(受体调节的Smads,Smad-1,-5,-8)以及在与ALK6键合的时候R-Smads随后的磷酸化;b)通过抑制剂Smads(I-Smads)阻断R-Smads的活性化,例如Smad6和7;或c)通过Smurfs使ALK6选择性地降解(Smad泛素化调节因子)。
本领域的技术人员有许多方法可以确定测试物质增加ALK6表达的能力。例如,本领域的技术人员可以定量地确定细胞中的ALK6mRNA水平(例如,使用定量的rtPCR),或可以定量地确定细胞表面上的蛋白质表达(例如使用免疫荧光技术,ELISA,二维电泳法或质谱法)。
在一个实施例中,方法可以包括通过测试物质对Cdc42的表达或活性化的影响(优选是Cdc42的表达)来确定测试物质与ALK6相互作用能力的步骤。确定Cdc42的表达的方法包括测量细胞中或细胞上的Cdc42的数量,或确定合成Cdc42蛋白质的前体的数量,例如为Cdc42编码的mRNA。确定Cdc42蛋白质表达水平或Cdc42mRNA水平所需的技术对本领域技术人员来说是显而易见的。确定蛋白质水平的技术可以包括免疫染色(例如免疫荧光,西方墨点法),ELISA,二维电泳法或质谱法。确定mRNA水平的技术可以包括北方墨点法,逆转录酶PCR,定量PCR,微阵列或芯片。
特别地,本发明关注可以以影响黑素生成或黑色素转移的方式与ALK6相互作用物质。因此,尤其需要确定测试物质对黑素生成或黑色素转移的影响。在本申请中详细列举了实现这一目的的方法,例如确定物质对从黑素细胞转移到角化细胞或潜在地从角化细胞转移到角化细胞的黑素体的数量的影响。这可以使用本申请中描述的荧光染色技术实现。
本发明的方法可以包括提供BMP6的步骤。通过在方法中提供BMP6,可以确定测试物质调节ALK6的活性的能力是其生物向心配合体的存在。这种方法可能与生理条件更相关,因为这种方法评估化合物在与BMP6的竞争中与ALK6相互作用的能力。
本发明的又一个方面提供了一种评估物质调节黑色素从黑素细胞转移到角化细胞,或潜在地从角化细胞转移到角化细胞的能力的方法,该方法包括以下步骤:
-提供测试物质;
-提供表达Cdc42的细胞;以及
-确定测试物质调节Cdc42的活性和/或表达的能力。
优选表达Cdc42的细胞是黑素细胞或角化细胞,更优选是黑素细胞。
方法可以包括将被测试物质处理过的细胞中的Cdc42的活性和/或表达与对照细胞中的Cdc42的活性和/或表达进行比较。
可以使用许多对于本领域技术人员来说显而易见的方法确定Cdc42的表达水平。在本发明的实施例中,可以使用免疫荧光,西方墨点法或通过确定Cdc42mRNA的水平来确定表达。如上所述,其他合适的方法对于本领域的技术人员来说可能是显而易见的。
附图说明
现参考附图,仅仅通过实例的方式描述本发明的实施例,其中:
-图1的A和B示出表皮角化细胞和表皮黑素细胞细胞毒性对BMP6体外孵化的评估结果。
A.用10ng/ml和100ng/ml的BMP6处理正常人类表皮角化细胞培养(女性-68;p2)24h,48h和72h。
B.用10ng/ml和100ng/ml的BMP6处理正常人类表皮黑素细胞培养(i)女性-68;p4和(ii)女性-42;p372h。通过细胞凋亡和细胞病理学改变评估细胞毒性。未发现细胞毒性效应。
-图2的A和B示出正常人类表皮黑素细胞中BMP6和ALK6蛋白质表达的检测结果。
A.(i)BMP6(绿色)的双荧光标记;(ii)酪氨酸酶(红色)和(iii)BMP6和酪氨酸酶的合并图像,证实人类表皮黑素细胞(F39-MC)中的BMP6蛋白质表达。(iv)示出相应的亮视场像。
B.(i)BMP6(绿色),(ii)ALK6(红色)的双荧光标记以及(iii)示出人类表皮黑素细胞(F39-MC)中BMP6和ALK6(黄色)的共定位。(iv)示出相应的亮视场像。
-图3的A和B示出表皮黑素细胞-角化细胞共培养中,剂量依赖型的BMP-6激发的黑素体转移的定量分析结果。
A.对匹配的黑素细胞-角化细胞共培养(F39MC-KC)实施双免疫荧光法,由BMP-6不断增加的浓度(1,10,50,100和500ng/ml)激发黑素细胞-角化细胞共培养24h。使用抗-gp100抗体(绿色)和抗细胞角蛋白抗体(红色)的双荧光标记示出转移到角化细胞的荧光斑点的数量的明显剂量依赖型增加。细胞核用DAPI染色。
B.对于每个不同的处理组在五个随机选择的微观领域(每个领域总共有20个细胞)中的转移的黑素体的量化。数值表达为与未激发的对照水平相比每个角化细胞的gp-100阳性斑点数量的百分比增加。具有*=P<0.05,**=P<0.01,和***=P<0.001的三个独立实验的装置是±SEM。
-图4的A和B示出是否BMP6向上调节Cdc42和ALK6(BMP6受体)在表皮黑素细胞中的表达。正常人类表皮黑素细胞培养(女性39y-MC)中Cdc42mRNA表达的RT-PCR分析。
A.指定时间内的100ng/mlBMP6处理
B.以指定的剂量进行BMP6处理2h。通过RT-PCR检测Cdc42mRNA。GAPDH用作可比较负载的内部对照。
C.使用或不使用100ng/mlBMP6处理正常人类表皮黑素细胞培养(女性42y-EM)。对ALK6进行荧光标记(绿色)并且示出与(i)未处理的对照试验相比在(ii)BMP6的影响下ALK6的表达增加。相应的亮视场像(下方处的画面)。
-图5的A和B,以及补充-1示出实验的结果,表明Cdc42表达的诱导增加背部丝状伪足形成和黑素体转移。
A.FM55细胞的背表面被(ii)组成型活化(CA)人类GFP-Cdc42(61L)转染而导致背部丝状伪足数量的大量增加而且与只有(i)GFP存在下的丝状伪足相比,被(iii)显性阴性(DN)人类GFP-Cdc42(15A)转染的细胞抑制背部丝状伪足。方框区域的更高功率图(下方的画面)。使用场发射SEM(FEI,Quanta400)以10kev的加速电压产生的SEM图像。
B.(左边的画面)对转染的FM55细胞-角化细胞共培养实施双免疫荧光法。(i)只有GFP在FM55和角化细胞中(ii)组成型活化(CA)人类GFP-Cdc42(61L)在FM55和角化细胞中(iii)显性阴性(DN)人类GFP-Cdc42(15A)在FM55和角化细胞共培养中。用抗-gp100抗体(绿色)和抗细胞角蛋白抗体(红色)的双荧光标记揭示在不同构成的存在下转移到角化细胞的荧光斑点的数量明显增加。细胞核用DAPI染色。
B.(右边的画面)对于每个不同的处理组在五个随机选择的微观领域(每个领域总共有20个细胞)中的转移的黑素体的量化。数值表达为与未激发的对照水平相比每个角化细胞的gp-100阳性斑点数量的百分比增加。具有***=P<0.001的三个独立实验的装置是±SEM。
补充-1:通过GFP表达(绿色)证实FM55细胞的选择。为了证实黑素细胞的身份,用黑素细胞特异性的抗-HMB-45/gp100(红色)对转染的细胞进行荧光标记。细胞核用DAPI染色。
-图6的A和B示出表明使用选择性的BMP6拮抗剂(硬化蛋白)抑制BMP6诱导的黑素体转移的实验结果。
A在加入或不加入其选择性拮抗剂,重组人类硬化蛋白(400ng/ml)的重组人类BMP6(100ng/ml)的存在或不存在情况下,对匹配的黑素细胞-角化细胞共培养(F36yMC-KC)实施双免疫荧光法24h。使用抗-gp100抗体(绿色)和抗细胞角蛋白抗体(红色)的双荧光标记揭示出与基线水平相比在BMP6的存在下转移到角化细胞的荧光斑点的数量的明显增加,当向共培养中加入选择性拮抗剂硬化蛋白时,转移到角化细胞的荧光斑点的数量明显减少。细胞核用DAPI染色。
B.对于每个不同的处理组在五个随机选择的微观领域(每个领域总共有20个细胞)中的转移的黑素体的量化。数值表达为与未激发的对照水平相比每个角化细胞的gp-100阳性斑点数量的百分比增加。具有**=P<0.01,***=P<0.001的三个独立实验的装置是±SEM。
图7的A和B示出表明使用选择性的BMP6拮抗剂(硬化蛋白)抑制BMP6诱导的Cdc42和ALK6受体的表达的实验结果。
A.Cdc42mRNA表达的RT-PCR分析:
在加入或不加入其选择性拮抗剂,重组人类硬化蛋白(400ng/ml)的重组人类BMP6(100ng/ml)的存在或不存在情况下,培养正常人类表皮黑素细胞(女性42y-EM)2h。通过RT-PCR检测Cdc42mRNA。GAPDH用作可比较负载的内部对照。
B.在加入或不加入其选择性拮抗剂,重组人类硬化蛋白(400ng/ml)的重组人类BMP6(100ng/ml)的存在或不存在情况下,培养正常人类表皮黑素细胞(女性42y-EM)12h。对ALK6进行荧光标记(绿色)并且示出在硬化蛋白的影响下BMP6诱导的ALK6表达的抑制。相应的亮视场像(下方的画面)。
-图8示出实验结果,结果表明使用选择性的BMP6拮抗剂(硬化蛋白)抑制BMP6诱导的丝状伪足形成。在加入或不加入其选择性拮抗剂,重组人类硬化蛋白(400ng/ml)的重组人类BMP6(100ng/ml)的存在或不存在情况下,培养正常人类表皮黑素细胞(女性42y-EM)72h。使用场发射SEM(FEI,Quanta400)以10kev的加速电压产生的SEM图像。
-图9的A,B和C示出表明BMP6对人类表皮黑素生成,酪氨酸酶活性和酪氨酸酶在mRNA和蛋白质水平的表达的影响的实验结果。
A.在加入或不加入其选择性拮抗剂,重组人类硬化蛋白(400ng/ml)的重组人类BMP6(100ng/ml)的存在或不存在情况下,处理正常人类表皮黑素细胞(F62;p4)72h。在使用不同药物处理之后,细胞表现出明显的黑色素水平的变化。氢氧化钠溶解之后通过分光光度法(475nm)确定黑色素含量。结果表达为与未激发的对照水平相比黑色素含量(Pg/细胞)的变化。具有*=P<0.05,*=P<0.01的三个独立实验的装置是±SEM。
B.在加入或不加入其选择性拮抗剂,重组人类硬化蛋白(400ng/ml)的重组人类BMP6(100ng/ml)的存在或不存在情况下,处理正常人类表皮黑素细胞(F62y;p4)72h。(下方处的画面)为了评估酪氨酸酶的活性,电转染蛋白质提取物以及用L-DOPA染色细胞膜。(上方处的画面)与未激发的对照水平相比,谱带强度的光密度扫描和值表达为成倍增加。具有*=P<0.01的三个独立实验的装置是±SEM。
C.在加入或不加入其选择性拮抗剂,重组人类硬化蛋白(400ng/ml)的重组人类BMP6(100ng/ml)的存在或不存在情况下,处理正常人类表皮黑素细胞(F62y;p4)72h。上方处的画面:通过RT-PCR检测酪氨酸酶mRNA以及GAPDH用作可比较负载的内部对照。下方处的画面:通过西方墨点法检测酪氨酸酶蛋白质以及肌动蛋白用作可比较负载的内部对照。
具体实施方式
引言
在黑色素转移生物学的研究中,本发明者们研究了骨形态发生蛋白(BMP)家族成员在该过程中的潜在作用。在本申请中描述了一种控制黑色素从人类皮肤黑素细胞转移到人类皮肤角化细胞的新机理。这包括BMP6的作用,BMP6可以以剂量依赖的形式激发该过程。而且,选择性BMP6拮抗剂(硬化蛋白)抑制BMP6-诱导的黑素体转移,以及阻挡BMP6-诱导的纳米细管(称为丝状伪足)的产生,如对人类黑素细胞进行的扫描电子显微镜(SEM)分析所证明的。仔细分析BMP6诱导丝状伪足形成的分子机理,使用逆转录分析发现BMP6在人类黑素细胞中以剂量依赖的方式激发(细胞增殖周期42)Cdc42的表达。对具有转染组成型活性(CA)Cdc42和显性-阴性Cdc42的FM55细胞进行SEM分析,证实黑素细胞中的丝状伪足形成和黑素体转移需要Cdc42。CA-Cdc42诱导背部丝状伪足的形成而DN-Cdc42抑制背部丝状伪足。
预测BMP6作为前体分子合成,该前体分子被分割成产生一个具有大约15kd的计算分子量的132个氨基酸成熟多肽。BMP6(前体)是57kD蛋白质,长度为513个氨基酸,局部化为人体的染色体6p24。BMP6的成熟形态的每个多肽链包含三个潜在的N-连接糖基化位置。活性的BMP-6蛋白质分子可能是二聚体。用与加工相关蛋白质TGFβ(Gentry等,Mol.cell.Biol.8:4162(1988)类似的方法将BMP6加工成成熟形态,包括二聚化和移除N-封端区域。GenBank数据库(编号-P22004)中提供了人类BMP6前体并且整合到UniprotKB/Swiss-Prot(参考SEQIDNO:1)中。据相信成熟多肽包括SEQIDNO:1的氨基酸374-513。其他活性BMP-6多肽包括包含SEQIDNO:1的氨基酸382-513,388-513和412-513的多肽。
BMPs通过与几乎所有正常细胞上发现的受体复合物结合而发挥作用,受体复合物由型I受体和型II受体组成。当作为单体存在时,BMPR-I以低亲和力与BMP结合。然而,当BMPR-I和BMPR-II作为异质二聚体存在时,它们与BMP的亲和力大体上增加(Hogan1996)。一旦分泌,BMP二聚体通过协同地与型I受体和型II受体都结合而激发信号。BMP6的每个单体都可以与型I受体和型II受体都连接。因此四聚受体复合物的组合体对于传导信号到细胞中是必要的。
型II受体是组成型-活性激酶,其基于配体结合使型I受体转磷酸化。然而,型I受体通过磷酸化活化细胞内基质,因此决定细胞内信号的特异性。包括BMP6的BMPs可以与2个型I受体结合,包括BMPR-IA(ALK-3;SeqID4),和BMPR-IB(ALK6;SeqID2)。虽然BMPR-IA和BMP-IB结构上相似但是它们变现出不同的空间和时间表达模式。
也已经发现BMP6诱导其本身的同源受体ALK6(编号O00238)的表达。选择性的BMP6拮抗剂硬化蛋白抑制BMP6-诱导的ALK6表达以及黑素细胞中Cdc42的表达,表明Cdc42参与为了BMP6信号的可能的扩增循环。同时这些发现表明发射至黑素细胞BMP受体的Cdc42信号参与丝状伪足形成从而控制黑素体转移至角化细胞。
GenBank数据库(编号-Q9BQB4)中提供硬化蛋白(SOST)的氨基酸序列并且整合到UniprotKB/Swiss-Prot(参考SEQIDNO:3)中。SOST的C-封端区域(SEQID3的氨基酸169-203)在SOST二聚化中发挥作用。SOST的N-封端区域(SEQID3的氨基酸23-58)与BMP6上的型I受体和型II受体结合位点都相互作用,而且一部分核区域(SEQID3的氨基酸134-166)可以与型II受体结合位点相互作用使得这些SOST区域特异的抗体可以阻挡或削弱BMP与SOST的结合。
最后,也已经表明BMP6可以通过激发黑素细胞中限速酶(酪氨酸酶)的表达和活性而诱导黑素生成。
在本申请中,已经第一次表明BMP6可以控制黑色素在黑素细胞和角化细胞之间转移,而且潜在地从角化细胞转移到角化细胞。这至少部分地通过Cdc42的作用而发生。BMP拮抗剂以及基于它们的结构和作用的分子可以用作哺乳动物的皮肤和头发色素沉着的新调节剂。
材料&方法
细胞培养:分离和培养匹配的表皮角化细胞和表皮黑素细胞。
在知情同意和当地的研究伦理委员会同意的情况下,正常人类腹部皮肤由具有皮肤光-型II(女性68y,39y,36y)和皮肤光-型VI(女性42y)的正常健康白种人捐献者在选择整形手术之后提供。
所有的细胞培养试剂都来自Invitrogen公司(佩斯里,苏格兰)除非另有说明。在RPMI1640培养基中收集皮肤样品并且在5h的手术内加工处理皮肤样品。按照以上所述(Kauser等,2003)建立表皮黑素细胞培养然后表皮黑素细胞培养在K-SFM和Eagle’s最低必须培养基(EMEM)的混合物中生长,Eagle’s最低必须培养基中添加了1%FBS,1×浓缩的非必需氨基酸混合物,青霉素(100U/ml)/链霉素(100μg/ml),2mML-谷氨酸盐,5ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),和5ng/ml内皮素-1(Sigma,Poole,Dorset,UK)。按照以上所述(Kauser等,2003)建立完全匹配的表面角化细胞(即来自同样的皮肤样本)然后在无血清培养基(K-SFM)中生长,无血清培养基中添加了25μg/ml牛垂体提取物(BPE),0.2ng/mlrEGF,青霉素(100U/ml)/链霉素(100μg/ml),以及2mML-谷氨酸盐。每两天补充一次培养基。使用分别抗gp100的抗-角化蛋白抗体(Abcam,Cambridge,UK)和黑素细胞-特异性的NKI/beteb抗体(Monosan,Uden,Netherlands)鉴定角化细胞和黑素细胞的原代培养。
对于共培养,将黑素细胞(第4代)和角化细胞(第二代)接种到8孔腔室载玻片系统(ICNBiomedicals,Aurora公司,OH,USA)上,细胞密度是1×104细胞/孔,以及比例是1个黑素细胞对10个角化细胞。共培养物在K-SFM和MEM的混合物(共培养培养基)中保存整夜(16h)从而使细胞附着,然后补充培养基再保存24h。
在评估100ng/ml重组人类BMP-6(R&D系统,牛津郡,UK)和400ng/ml重组人类硬化蛋白(R&D系统,牛津郡,UK)的作用之前,共培养在血清-缺乏的培养基(即缺少优级胎牛血清和牛垂体提取物)中孵化16h以移除生长因子的外因来源。
BMP-6剂量的评估:
表皮黑素细胞(MC)和表皮角化细胞(KC)被接种到6孔板的血清补充充足的MEM黑素体和K-SFM角化细胞培养基中24h。将细胞转移到添加了10ng/ml和100ng/mlBMP-6的无血清(所谓缺乏的)培养基中保持24h,48h和72h。通过形态学中的细胞凋亡和细胞病理学改变评估细胞毒性。
将大约1×104MC接种到8孔腔室载玻片系统的每个孔中然后使MC附着24h。然后使用无菌PBS冲洗细胞3次以及添加350μl缺乏的无血清黑素细胞培养基然后在37℃和5%CO2条件下孵化24h。然后使用无菌PBS冲洗细胞3次以及用或不用100ng/mlBMP-6孵化12h。然后使用无菌PBS轻轻地冲洗细胞三次以及在20℃下将细胞混合在冰冷的甲醇中10分钟。将载玻片保存在-20℃直到实施免疫细胞化学法。
西方墨点分析:
在合流T225烧瓶中使MC受到胰蛋白酶作用并且接种到装满培养基的T25烧瓶中而且使其附着整夜。在处理前24h,用少量的培养基替换培养基24h。使用无菌PBS冲洗细胞3次,然后只在少量培养基中孵化或在带有100ng/mlBMP-6的少量培养基中孵化不同的时间段(1-24h)。在不同的实验中,用不同浓度的BMP-6处理细胞12h。
使来自细胞提取物的40mg总蛋白质在还原的SDS-8%-PAGE中电泳和在PVDF膜(Millipore公司,Bedford,MA)上涂污。在室温下用5%的牛奶PBS/0.075%Tween20阻挡膜2h以及在4℃下用一代抗体探测整夜。分子量阶梯(MagikMarker,Invitrogen)在5%的牛奶PBS/0.075%Tween20中孵化而且胶片带用1ml5%的牛奶PBS/0.075%Tween-20(阴性对照),或1ml的兔抗酪氨酸酶(在5%的牛奶PBS/0.075%Tween20中的1∶200多克隆抗体)和1ml羊抗肌动蛋白(在5%的牛奶PBS/0.075%Tween20中的1∶1000多克隆抗体)在摇摆平台上在4℃下孵化整夜。大量冲洗之后,用与二代抗体结合的三葵过氧化物孵化墨点2h。然后用1ml稀释在5%的牛奶PBS/0.075%Tween-20中的HRP-羊抗人类lgG(H+L)(Zymed,USA)(1∶500)孵化分子量阶梯而且胶片带用1ml抗兔lgG,与整个抗体(HRP)二代抗体(AmershamBiosciences,UK)(1∶700稀释在5%的牛奶PBS/0.075%Tween20中)连接的三葵过氧化物在摇摆平台上在室温下孵化2h。重复冲洗程序而且胶片带在LumiGLOR试剂和Peroxide(BioLabLtd,UK)中在室温下孵化2分钟。通过在各个曝光时间将墨点带置于KodakXRAX-射线胶片(kodak,UK)下检测化学发光信号,然后在显影液(kodak,UK)中显影直到谱带出现,用自来水漂洗,在定影液(kodak,UK)中定影直到胶片变成蓝色,然后用自来水冲洗,然后晾干。然后标记膜并且为光密度分析进行扫描,使用分析软件(ImageMasterTotallabversion1.11)对蛋白质的表达水平进行半定量评估。
免疫荧光染色
用PBS冲洗被冰冷的甲醇凝结的细胞,然后用10%驴血清阻滞以检测蛋白质表达。对于双标记实验,第一代原始抗体,BMP-6(Abcam,剑桥,英国),BMPR-IB/ALK-6(R&D系统,牛津郡,英国)或Nki/beteb(1∶30)(Monosan,Uden,荷兰)在4℃下被作用整夜,然后在室温下用FITC-结合的二代抗体孵化1h。二代原始抗体,cytokeratin(1∶100)(Abcam,剑桥,英国)或β-Actin(1∶100)(SantaCruz,USA)在室温下作用1h,然后是TRITC-结合的二代抗体(1∶100)(JacksonImmunoresearchLaboratories公司,WestGrove,美国)。使用DAPI(VectorLaboratories,Burlingame,CA)将细胞核染色。借助使用100×或40×物镜的冷却的Hamamatsu数码相机捕集图像并且使用PaintShopPro(JascSoftwareVer.7.CA,USA)后处理。阴性对照包括省略原始抗体和用来自二代抗体宿主的非免疫血清替代和包括二代抗体。
黑素细胞转移的定量分析:
用不同剂量的BMP-6刺激匹配的黑素细胞-角化细胞共培养并且与未刺激的细胞进行比较。通过计算在3个独立实验中每个孔被放大100×的5个随机显微镜视野中(油浸法)受体角化细胞内的荧光gp100-阳性斑点的数量对黑素细胞转移进行评估。为了避免计算可能仍然与黑素细胞相关的黑色素小颗粒,我们只计算不与黑素细胞直接接触的角化细胞内的gp100-阳性斑点。
逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)
用1-,10-,50-,100-和500ng/ml的BMP6处理从1×106黑素细胞得到的总RNA4h或用100ng/ml的BMP6处理一段指定的时间(图4A)。对于一些实施例,在100ng/mlBMP6的存在或不存在下,使用或不使用400ng/ml的硬化蛋白处理黑素细胞。用脱氧核糖核酸酶(QIAGEN,UK)处理RNA样品,然后确定浓度。然后使用用于逆转录试剂盒的SuperscriptIIIFirst-Strand合成方法来合成第一链cDNA。对于所有样品,反应中的RNA的最终浓度是1μg/100μl。在生产者描述的条件下用QIAGENFastCyclingPCR试剂盒(QIAGEN,UK)实施PCR。简单地说,使用以下循环条件:95℃下15分钟(阶段1);96。℃下15s;引物退火15s(对于Cdc是42-65℃,酪氨酸酶-58℃以及GAPDH-60℃);72。℃下25s(阶段2)×30个周期。表1示出了用于RT-PCR反应的引物而且该引物来自SigmaGenosys,英国。PCR产品在1×TAE缓冲液中分离在琼脂糖凝胶上并且用溴化乙锭染色。1KbDNA加DNA阶梯(Invitrogen,加利福利亚)用作DNA的标记。
表1.半定量RT-PCR的引物
转染
显性-阴性人类GFP-Cdc42(15A)和组成型活性GFP-Cdc42(61L)以及pEGFP-C3中的GFP是RichardE.Cheney(UniversityofNorthCarolina,ChapelHill)的重要成果。载体包括证实对遗传霉素(G418)有抵抗力的新霉素基因。在转录之前,在带有10%FBS的RPMI培养基中使大约5×105的中等色素沉着的FM55细胞在六孔板中生长16h达到70-80%融合。使用Lipfectamine2000转染试剂(Invitrogen,Carlabad,CA,USA)转染F55细胞。简单地说,在1.6ml的Opti-MEM还原血清培养基中使3.2μgcDNA组织与8μlLipfectamine2000转染试剂混合。用转染混合物孵化细胞12h,用1×PBS冲洗三次,在包含10%FBS的新鲜RPMI中孵化48h。使用1.6mg/mlG418选择转染的细胞15天。然后1×104稳定的转染细胞在带有10%FBS的RPMI培养基的存在下在8孔腔室载玻片系统中培养24h。24小时之后,为了保留FM55细胞的形状构型(包括丝状伪足)立即将稳定转染的细胞混合到用0.1M的二甲胂酸钠(Agar,英国)缓冲的1%戊二醛(Sigma,英国)中然后为SEM分析加工处理。为了进行gp100免疫荧光研究以证实转染和选择(补充-1),在-20℃下,将8-孔腔室载玻片系统上的平行细胞混合在冰冷的甲醇中10分钟,在PBS中冲洗然后用10%的驴血清阻滞。为了共培养研究,将稳定转染的FM55细胞和角化细胞(2代)接种到8孔腔室载玻片系统中,细胞密度是1×104细胞/孔而且比值是1个FM55对10个角化细胞。在K-SFM和MEM的混合物(共培养培养基)中保持共培养整夜(16h)以使细胞附着,然后补充培养基之后再保持24h。为了进行gp100和细胞角蛋白双免疫荧光研究以测试黑素体转移效率,在-20℃下,将细胞混合在冰冷的甲醇中10分钟,在PBS中冲洗然后用10%的驴血清阻滞。
细胞形态学的扫描电子显微镜评估
在100ng/mlBMP6的存在或不存在下使用或不使用400ng/ml的硬化蛋白处理表皮黑素细胞72h,然后在37℃下,将稳定选择的转染FM55细胞混合到用0.1M的二甲胂酸钠(Agar,英国)缓冲的1%戊二醛(Sigma,英国)中。然后将细胞后固定到1%的四氧化锇(Agar,英国)和用作媒染剂的1%单宁酸(Agar,英国)中,通过一系列从20%到70%的醇脱水,在0.5%的乙酸铀酰中染色,然后进一步在90%和100%乙醇中脱水。在六甲基-二硅氮烷(Sigma,UK)中进行最终的脱水,然后使空气干燥。一旦干燥,在镀金机(EMITECH,K550)(Blazer20mA)中给样品镀金10分钟。在场发射SEM(FEI,Quanta400)下以10keV的加速电压观察样本。
黑色素试验
在1M氢氧化钠(NaOH)(BOHLtd,英国)中制备500μg/ml合成的黑色素(Sigma,英国)然后在超声波水浴中溶解20分钟。从该贮备溶液制备1MNaOH中的从100μg/ml到1μg/ml的各种黑色素标准品。将黑色素标准品移液到96孔板中以产生评估测试样品中黑色素含量的校准曲线。向每个细胞颗粒中加入400μl的1MNaOH并且在微量恒温仪(100℃)中溶解15分钟。颗粒急剧地涡旋而且将溶解的颗粒移液到相同的96孔板中。用DYNEXREVELATION4.02程序在495nm读取样品的光密度。从校准曲线读取每个测试样品的黑色素含量。
用于评估酪氨酸酶活性的使用非变性SDS-PAGE的DOPA氧化酶检测
大约1×106的表皮黑素细胞被接种到三个T75烧瓶中而且在37℃和5%CO2条件下孵化整夜。为SDS-PAGE制备细胞并且将细胞转印到PVDF细胞膜上。将没有沸腾的非还原蛋白质提取物70μg移液到具有8%SDS-PAGE凝胶的合适孔中。包含分离的蛋白质的PVDF细胞膜在1×PBS中冲洗一次然后在RT上在5mML-DOPA的0.1M磷酸钠缓冲液中孵化3小时,其中更换L-DOPA三次。通过在蒸馏水中冲洗细胞膜停止L-DOPA反应然后扫描细胞膜。
统计分析:
使用1-wayANOVA和利用Prismv.4.00(GraphPadSoftwareChicago,IL,USA)的Dunnett’s后测评估组和处理之间的统计显著性。用星号表示统计上的显著性差异:**=P<0.01,***=P<0.001。
结果和讨论
BMP6(10和100ng/ml)没有表现出对正常人类表皮黑素细胞和角化细胞的细胞毒性
为了排除BMP6对黑素细胞或角化细胞有毒的可能性,细胞在10ng/ml和100ng/ml的存在下保存24h,48h和72h。BMP6的这两个剂量都与改变的细胞生长或黑素细胞和角化细胞的形态学无关(图1A,1B)。
正常人类表皮黑素细胞表达BMP6蛋白质和受体ALK6
通过抗-酪氨酸酶抗体(红色,Aii)对抗-BMP6(绿色,Ai)的双荧光标记(黄色-橙色,Aiii)证实BMP6在正常人类黑素细胞中的表达(图2A)。抗-BMP6(绿色,Bi)和抗-ALK6(红色,Bii)抗体对黑素细胞的双荧光标记揭示出在整个细胞中BMP6和ALK6共定位(黄色,Biii)(图2B)。
剂量依赖型的BMP6-刺激的黑素体转移的定量分析
ALK6受体是功能性的,因为对黑素细胞-角化细胞共培养的BMP6处理刺激黑素体以剂量依赖的方式从黑素细胞转移到角化细胞(图3A,B)。因此,这是第一次报道BMP6对黑素细胞-角化细胞共培养系统中黑素体转移的作用。可以包括自分泌作用和旁分泌作用两者。
BMP6上调Cdc42在人类表皮黑素细胞中的信息表达
为了更好地理解BMP6在黑素体转移中的机械作用,我们研究了Cdc42的表达;Cdc42是人类黑素细胞中丝状伪足形成的主要调节者(Scott等,2002)。RT-PCR分析表明与未处理对照中Cdc42mRNA的基准水平表达相比,在100ng/mlBMP6处理之后的Cdc42最大感应发生在2-4h然后稍微降低但是保持升高到12h(图4A)。Cdc42mRNA对BMP6的感应以剂量依赖的形式发生(图4B)。与正常人类表皮黑素细胞中ALK6表达的正常基准水平(图Ci)相比,BMP6也刺激BMP6受体ALK6的表达(绿色,图4Cii)(图4C)。
需要Cdc42从而通过诱导背部丝状伪足来激发黑素体转移
广泛地使用两种Rho蛋白质突变体以分析它们的功能;活化突变体,其是组合型GTP-结合,因为GTP酶活化蛋白质(GAPs)被抑制;而且显性-阴性突变体通过滴定出鸟苷酸交换因子(GEFs)而发挥作用(Feig1999)。我们发现与对照载体相比,组合型活性Cdc42诱导背部丝状伪足以及显性-阴性Cdc42压制FM55人类黑素体的背部丝状伪足(图5A)。
下一步我们迫切想要确定的是Cdc42蛋白质的过度表达是否也可以影响黑素体转移。为了试验这些过渡表达的蛋白质参与到黑色素转移中,使用转染的FM55细胞建立FM55黑色素瘤-角化细胞共培养24h。使用抗-gp100抗体(绿色)的共培养荧光标记示出转移到角化细胞(白色箭头)的荧光斑点的数量的明显改变(图5B,左边的画面)。与GFP对照载体相比,组合型活性GFP-Cdc42诱导黑素体转移而显性-阴性GFP-Cdc42抑制黑素体转移(图5B,右边的画面)。Cdc42的过度表达或抑制对黑素体转移的控制进一步表明黑素体转移中丝状伪足的有力参与。由于BMP6可以上调Cdc42的表达,这表明黑素体转移的与BMP6相关的刺激可以包括Cdc42作为其下游靶点。为了试验这个我们利用了DN-Cdc42对丝状伪足形成和黑素体转移的抑制作用。这也可以通过使用对抗人类Cdc42的siRNA击倒人类黑素细胞的内源Cdc42表达来类似地实现。
使用选择性BMP6拮抗剂(硬化蛋白)抑制BMP6-诱导的黑素体转移
为了试验硬化蛋白(选择性BMP6拮抗剂)是否抑制BMP6诱导的黑素体转移,我们测试了在正常人类表皮黑素细胞-角化细胞共培养中的这种拮抗剂。加入硬化蛋白本身抑制黑素体从黑素细胞转移到角化细胞的基准水平(图6A,B)。再者,硬化蛋白抑制人类表皮黑素细胞-角化细胞共培养中BMP6诱导的黑素体转移表明硬化蛋白可以用作哺乳动物皮肤和头发色素沉着的新调节剂(图6A,B)。
使用选择性BMP6拮抗剂(硬化蛋白)抑制BMP6-诱导的Cdc42和ALK6受体表达
我们第一次示出Cdc42作为从黑素细胞到角化细胞的黑素体转移调节剂的生理作用(图5B)。硬化蛋白抑制BMP6诱导的黑素体转移的能力表明硬化蛋白可能阻滞人类黑素细胞中Cdc42的BMP6诱导的表达。使用RT-PCR对人类黑素细胞进行分析,我们终于发现硬化蛋白下调Cdc42的BMP6诱导的表达(图7A)。使用免疫荧光研究我们也发现硬化蛋白下调ALK6(绿色)的,BMP6受体的BMP6诱导的表达(图7B)。该发现表明Cdc42参与用于BMP6发信号的可能的放大环。
使用选择性BMP6拮抗剂(硬化蛋白)抑制BMP6-诱导的丝状伪足形成
黑素细胞的SEM分析显示与未处理的对照相比,BMP6处理激发大量的背部丝状伪足(图8iii)。用硬化蛋白处理的黑素细胞表现出背部丝状伪足形成的降低,其中在硬化蛋白的存在下,用BMP6处理过的细胞不诱导丝状伪足形成(图8ii,iv)。这些数据有利地支持为了在人类黑素细胞中激发背部丝状伪足形成而对BMP6的需求。
硬化蛋白对BMP6诱导的黑素体转移的抑制(图6),对Cdc42和ALK6受体表达的抑制(图7)和对丝状伪足形成的抑制(图8)表明从黑素细胞BMP受体传出的Cdc42信号参与丝状伪足的形成,丝状伪足控制黑素体转移到角化细胞。
BMP6对人类表皮黑素细胞中黑素生成的影响
BMP6增加体外人类表皮黑素细胞中的黑色素含量(72h之后增加大约32±9%)(图9A)。选择性的BMP6拮抗剂硬化蛋白抑制人类表皮黑素细胞中BMP6诱导的黑色素含量(抑制15±3%)(图9A)。BMP6也激发酪氨酸酶活性(黑色素合成潜力的指示剂)而硬化蛋白抑制BMP6诱导的酪氨酸酶活性的增加(图9B)。
总结:对诱导黑素细胞中黑素生成的信号机制的研究表明通过蛋白质激酶A发挥作用的cAMP提升剂通过增加酪氨酸酶的表达诱导黑素细胞中黑素生成(Bertolotto等,1998)。除了这个简化的方案之外,也表明通过MSH,UV光或人类胎盘鞘脂的处理,p38MARK串联参与黑素细胞中的黑素生成(Galibert等,2001;Smalley和Eisen,2000;Singh等,2005)。最近BMPs也表现为黑素生成的有力调节剂(Botchkarev2003;Yaar等,2006)。已经发现BMP6作为正常人类黑素细胞中黑素生成的自分泌抑制剂通过抑制黑素细胞中的限速酶(酪氨酸酶)的表达和活性发挥作用(Yaar等,2006)。在我们的研究中,我们已经发现BMP6作为黑素生成的激发剂通过激发酪氨酸酶在蛋白质和基因水平的表达发挥作用(图9C)。而硬化蛋白在蛋白质和基因水平上都抑制人类表皮黑素细胞中的BMP6-诱导的酪氨酸酶表达(图9C)。
Claims (16)
1.一种评估物质调节黑色素从黑素细胞转移到角化细胞的能力的非治疗目的方法,所述方法包括以下步骤:
—提供测试物质;以及
—通过确定所述测试物质对Cdc42的表达或活化的影响来确定所述测试物质与ALK6相互作用的能力。
2.根据权利要求1所述的方法,包括提供表达ALK6的细胞和通过确定所述测试物质对Cdc42的表达或活化的影响来确定所述测试物质与所述细胞表达的ALK6相互作用的能力。
3.根据权利要求1或2中任意一项所述的方法,其中所述表达ALK6的细胞是黑素细胞。
4.根据权利要求1所述的方法,包括确定所述测试物质调节ALK6活性的能力。
5.根据权利要求4所述的方法,其中确定了所述测试物质活化ALK6的能力。
6.根据权利要求4所述的方法,其中确定了所述测试物质使ALK6失活的能力。
7.一种评估物质调节黑色素从黑素细胞转移到角化细胞的能力的非治疗目的方法,所述方法包括以下步骤:
-提供测试物质;
-提供表达Cdc42的细胞;以及
-确定所述测试物质调节Cdc42的活性和/或表达的能力。
8.根据权利要求7所述的方法,其中所述表达Cdc42的细胞是黑素细胞或角化细胞。
9.根据权利要求7所述的方法,包括将所述测试物质处理过的细胞中的Cdc42的活性和/或表达与对照细胞中Cdc42的活性和/或表达进行比较。
10.一种增加受体的皮肤和/或头发的黑色素沉着的非治疗目的方法,所述方法包括对受体施用组合物,所述组合物包括BMP6前体蛋白或BMP6的片段,其中,所述片段包括选自由SEQIDNO:1的氨基酸374-513、SEQIDNO:1的氨基酸382-513、SEQIDNO:1的氨基酸388-513和SEQIDNO:1的氨基酸412-513组成的组中的氨基酸。
11.根据权利要求10所述的方法,其中包括将所述组合物应用到受体的皮肤和/或头发的外表面上。
12.根据权利要求10所述的方法,其中所述物质能够相对于正常生理水平增加ALK6的活性。
13.一种调节受体的皮肤和/或头发的黑色素沉着的非治疗目的方法,所述方法包括对受体施用组合物,所述组合物包括核酸,所述核酸能够通过与编码Cdc42或其功能部分的DNA或RNA的相互作用而调节Cdc42的表达。
14.根据权利要求13所述的方法,其中所述核酸是RNA分子。
15.根据权利要求13所述的方法,其中所述核酸是能够对编码Cdc42的mRNA进行针对性的反义作用或RNA干扰的RNA分子。
16.根据权利要求13所述的方法,其中所述核酸是用于通过RNAi靶向Cdc42mRNA的RNA分子,所述RNAi具有序列5’-GAUAACUCACCACUGUCCATT-3’和5’-UGGACAGUGGUGAGUUAUCTT-3’寡核糖核苷酸;或5’-GACUCCUUUCUUGCUUGUUTT-3’和5’-AACAAGCAAGAAAGGAGUCTT-3’寡核糖核苷酸。
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