CN102204928A - 再生细胞用于促进伤口愈合的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及再生细胞用于促进伤口愈合的应用。包含浓缩的脂肪来源的再生细胞群的组合物在制备用于在伤口部位促进上皮形成的药物中的应用，其中，在被配置为维持密闭、无菌的流体/组织路径中分离所述浓缩的脂肪来源的再生细胞群。所述应用包括，处理脂肪组织，将从该脂肪组织中得到的一定浓缩数量的再生细胞给予病人。该方法可以在一个封闭系统中实践，以便该再生细胞在被给予病人之前，不会暴露在外部环境中。所以，在一个优选方法中，脂肪组织中存在的细胞，与促进、产生或维持治疗效果所需的添加剂一起，被直接放入接受者体内。

Description

再生细胞用于促进伤口愈合的应用

本申请是原申请的申请日为2004年7月1日，申请号为200480043510.1，发明名称为《使用再生细胞促进伤口愈合的方法》的中国专利申请的分案申请。

相关申请

本申请是以下的部分延续申请：要求2001年12月7日提出的美国临时申请No.60/338,856的权利的美国申请No.10/316,127，2002年12月9日提出，题目为SYSTEMS AND METHODS FOR TREATING PATIENTS WITHPROCESSED LIPOASPIRATE CELLS。所述申请的内容在此被特意地作为参考加以引入。

发明背景

技术领域

本发明整体上涉及多种组织来源的再生细胞，特别是脂肪来源的再生细胞(例如：干细胞和/或祖细胞)，使用脂肪来源的再生细胞的方法，含有脂肪来源的再生细胞的组合物，用于制造和使用脂肪来源的再生细胞的系统，其用于促进伤口愈合，例如糖尿病，慢性外周血管疾病和肥胖所引起的伤口。

背景技术

大约五百万美国人患有慢性疮口，原因经常是由于有限的血流能够减慢身体的自我愈合过程。通常，对皮肤的损伤引起一连串连锁反应，其最终导致伤口愈合，即新真皮形成和表皮细胞再生。这一系列反应包括局部、区域和系统的生长因子、细胞因子、和细胞参与者(cellular participant)，包括间充质干细胞。但是，不充分和/或不彻底的伤口愈合会引起严重的个体病态，包括生活质量的极度下降。疮口能变得感染，坏疽，有时需要截肢。例如，由于不充分的伤口愈合而进行的非创伤性截肢的一个主要原因是糖尿病。在美国有近1600万糖尿病人。每年，超过67000的糖尿病人需要外科手术截肢，不得不进行长期和高价的复原。对于许多人，活动和自理受到影响，永久地改变了他们的生活质量。更甚者，不良的伤口愈合可能成为死亡的根源。

对于患有有难以愈合的慢性伤口的病人，基本的药物和外科手术护理是必须的，但这些是不够的。目前对于伤口愈合的治疗包括非健康组织的切取，使用生长因子，高压(高压力)氧治疗，高级伤口敷料，抗生素治疗，常规的伤口敷料，营养学建议，教育/预防，外科手术和物理疗法。例如，单一或多参与分子联合的操作，包括但不限于PDGF-BB和bFGF，可以用来加强自发的伤口愈合。另外，还可以使用“工程设计的(engineered)”细胞产物(

和

)，作为引起生长因子表达的另一种生理模式的途径。已经证明，使用如Regranex，一种血小板来源的刺激愈合的生长因子的治疗，对于合适病人的伤口护理是有益的。

与上述单一或联合的分子治疗相比，再生细胞的方法也享有相对的成功。在临床的目标方式中，再生药物控制干细胞(即，身体非特定性的主要细胞)的不定性自我更新并发育成为成熟的特定细胞的能力。但是，再生细胞治疗的广泛应用受到细胞保存和与大量体外处理有关的高费用问题的阻碍。然而，虽然已经表明干细胞群存在于一种以上的骨髓，皮肤，肌肉，肝和脑中(Jiang等人，2002b；Alison，1998；Crosby和Strain，2001)，但是它们在这些组织中的分布频率是很低的。例如，间充质干细胞在骨髓中的分布频率估计在1/100,000与有核细胞的1/1,000,000之间(D′Ippolito等人，1999；Banff等人，2001；Falla等人.1993)。相似地，从皮肤中提取成体干细胞(ASC)涉及一系列复杂的要花费几周时间的细胞培养步骤(Toma等人，2001)，并且骨骼肌肉干细胞的临床应用需要2到3周的培养阶段(Hagege等人，2003)。因此，已知的任何来自这样的组织的干细胞的临床应用，都需要通过细胞纯化和细胞培养过程来提高细胞数量、纯度和成熟度。

虽然细胞培养提高了细胞数量、纯度和成熟度，但也提高了成本。该成本可能包括一种以上以下的技术困难：由于细胞老化引起的细胞功能丧失，潜在有益的非干细胞群的丢失，细胞对病人的潜在应用的延迟，增加了资金成本，增加了细胞被环境微生物污染的风险。近来调查骨髓ASC治疗效果的研究在本质上使用全骨髓来避开与细胞培养有关的问题(Horwitz等人，2001；Orlic等人，2001；Stamm等人，2003；Strauer等人，2002)。但是，临床疗效并不理想，结果很可能与骨髓中有限的ASC剂量和可利用的固有纯度有关。

最近已经表明，脂肪组织是干细胞的一个来源(Zuk等人，2001；Zuk等人，2002)。脂肪组织(不同于骨髓，皮肤，肌肉，肝和脑)相对容易以较大数量较低发病率获得(Commons等人，2001；Katz等人，2001b)。但是技术上缺少获得脂肪来源的干细胞的适宜方法。现存的方法存在很多缺点。例如，现存方法没有部分或全部的自动控制，部分或全部密闭的系统，组件的一次性等。

考虑到脂肪来源的干细胞对伤口愈合的治疗潜力，则在技术上需要从脂肪组织中获得细胞的方法，其需要快速可靠地以更高的产率、浓度和/或纯度产生成体干细胞群，并且减少或不存在对过去的提取处理的需要。

发明内容

本发明涉及再生细胞，例如成体干细胞和祖细胞，其能够用于促进伤口愈合。本发明还涉及从组织，例如脂肪组织中分离和浓缩再生细胞的系统和方法。本发明进一步涉及用于伤口愈合的再生细胞的组合物。所以，在一般的实施方式中，本发明主要涉及使用来自组织的再生细胞的组合物，方法和系统，这些再生细胞与必要的添加剂一同被直接放入接受者体内，来促进、引起或维持伤口愈合的治疗效果。

在特定的实施方式中，本发明主要涉及，通过施加一定浓度的再生细胞来促进伤口愈合的方法。该再生细胞可以包括例如干细胞、祖细胞或其联合体。在一些实施方式中，需要再生细胞的多剂量给药，以产生治疗效果。另外，可以与该再生细胞一同施加添加剂，例如一种以上的生长因子。在优选实施方式中，该再生细胞单独或与其他添加剂一起，与血管生长因子一同给药。该再生细胞也可以与一种以上的免疫抑制药一同给药。

再生细胞的给药途径为技术上已知的，并包括距离损伤部位较远处的皮下、真皮或肌肉注射，或使用基于导管的机制进行的局部血管导入。例如该细胞可以对于病人的脉管系统给药。该细胞也可以经由技术上已知的可以被再吸收的支架(sacaffold)或绷带给药。

在对病人给药之前，再生细胞可以被培养在细胞培养基中，以便例如促进向表皮和/或内皮表现型的分化。细胞培养可以是在支架材料，例如可以被再吸收的支架上进行的，以形成能够被放置在病人身体上或身体内的二维或三维空间结构。在对病人给药之前，也可以通过转基因来修饰该细胞，以改变被修饰的再生细胞中的一种以上基因，例如血管生长基因的表达。

本发明还涉及能够从所给的组织分离和浓缩再生细胞，例如干细胞和祖细胞的通用性高的系统和方法，其适于再灌注入受试者。在优选实施方式中，该系统是自动控制的。本发明的系统一般包括一个以上的收集室，一个处理室，一个废物室，一个导出室和一个样品室。多个室由一根以上的导管相连，以便包括生物材料的流体可以在密闭、无菌的流体/组织路径中从一个室流到另一个室。在一些实施方式中，废物室，导出室和样品室是可选的。在一个实施方式中，从组织提取，到处理，和将该发明物放入接受者的整个程序都是在相同设备中进行的，甚至是在接受该程序的病人的相同场所进行的。

所以，在一个实施方式中，促进病人伤口愈合的方法包括步骤：a)提供一个组织切取系统；b)使用该组织切取系统从病人切取脂肪组织，该脂肪组织具有一个干细胞浓度；c)对该脂肪组织的至少一部分进行处理以得到一个再生细胞浓度，其不同于处理前该脂肪组织的再生细胞的浓度；以及d)将该再生细胞施加给病人，并且在被施加给病人前不从该组织切取系统中除去该再生细胞。

这里描述的任何特征或特征的结合都包括在本发明的范围内，只要这样的结合中所包括的特征如上下文，本说明书和本领域普通技术知识那样，不相互矛盾即可。本发明的其他优点和内容如下所述。

附图说明

图1是一个用于从组织中分离再生细胞的系统的图，该系统包括一个过滤装置。

图2是与图1相似的系统的图，该系统具有连续配置的多个过滤装置。

图3是与图1相似的系统的图，该系统具有平行配置的多个过滤装置。

图4是一个用于从组织中分离再生细胞的系统的图，该系统包括一个离心分离室。

图5是一个收集室的剖视图，该收集室包括预先固定了一个用于从组织中分离再生细胞的系统中利用的过滤器。

图6是一个用于从组织中分离再生细胞的系统的处理室的剖视图，其利用了渗滤的过滤器系统。

图7是一个用于从组织中分离再生细胞的系统的处理室的剖视图，其利用了一个离心分离设备用来浓缩该再生细胞。

图8是图7的处理室的另一个剖视图。

图9A，B，C是表示使用本发明的系统淘析组分的图。

图10是用于从组织中分离再生细胞的系统的图，其利用真空压力使流体穿过该系统移动。真空系统可以是通过在系统出口使用真空泵或真空源而构成的，其控制在预先确定的速度下来拖动组织和流体通过，并使用一个活塞、排放口和夹子的系统来控制流动方向和流动时间。

图11是用于从组织中分离再生细胞的系统的图，其利用正压力使流体穿过该系统移动。正压力系统使用机械方式例如蠕动泵来推动或推进流体和组织以确定的速度穿过该系统，使用阀门、活塞、排放口和夹子来控制流动方向和流动时间。

图12A是表示过滤过程的图，其中流体的物料流的流动与过滤器孔相切。12B表示过滤过程的图，其中流体的物料流的流动与过滤器孔垂直。

图13是示范性的用于本发明系统的一次性装置的图。

图14是示范性的用于本发明系统的可再利用的零件的图。

图15A是示范性的本发明的设备的图，其为使用图13的一次性装置和图14的可再利用的零件装配的。

图15B是示范性的预排程序的步骤流程图，是通过软件程序实现的，其控制本发明的一个系统的自动化实施方式。所显示的两个可选的处理参数指示了该系统的多功能性。

图16A和16B通过培养的脂肪来源的干细胞描述了VEGF(5A)和PIGF(5B)蛋白的表达。

图17表示的是，脂肪来源的干细胞群中内皮祖细胞的检测。

图18A和18B表示的是，在正常小鼠和经链脲霉素处理的小鼠中血管结构的体内发育。

图19表示的是，与阴性对照相比，用脂肪来源的干细胞处理的下肢缺血小鼠中血流的平均恢复增加。

图20A和20B表示脂肪来源的干细胞增加改善移植的存活率和血管生成(20A)，并描绘了组织样品中脂肪组织结构的保持(20B)。

图21表示不同培养基中小鼠成纤维细胞和ADC的胶原蛋白分泌。

图22表示经STZ处理的糖尿病小鼠的伤口愈合进程。

具体实施方式

本发明提供了使用脂肪再生细胞(“ADC”)促进伤口愈合的方法。本发明部分地基于以下发现，即本发明的再生细胞(1)表达包括PIGF、VEGF、bFGF、IGF-II、嗜酸粒细胞趋化因子(eotaxin)、G-CSF、GM-CSF、IL-12p40/p7O、IL-12p70、IL-13、IL-6、IL-9、瘦素(Leptin)、MCP-1、M-CSF、MIG、PF-4、TIMP-1、TIMP-2、TNF-α和血小板生成素(Thrombopoetin)的血管生长因子和细胞因子，(2)分泌与伤口愈合有关的细胞因子包括MIP-1α、RANTES、MCP-1、MIG、TARC、MIP-1、KC和TIMP，(3)体内分泌胶原蛋白，并且(4)促进体外伤口愈合。所以，来源于脂肪组织的再生细胞，例如具有通常认为是间充质干细胞特征，即表达细胞表面分子的干细胞，具有促进新血管形成和伤口愈合的功能。

本发明还涉及用于从多种组织中分离和浓缩再生细胞，例如干细胞和/或祖细胞的快速可靠的系统和方法，分离再生细胞的组织包括但不限于脂肪，骨髓，血液，皮肤，肌肉，肝，结缔组织，筋膜，脑和其他神经系统组织，血管和其他软组织或液体组织，或者组织成分或组织混合物(例如包括皮，血管，脂肪和结缔组织的组织混合物)。在一个优选实施方式中，该系统从脂肪组织中分离并浓缩再生细胞。在另一个优选的实施方式中，该系统是自动控制的，以便整个方法可以以最少的使用者干涉或专门知识来进行。在一个特别优选的实施方式中，使用本发明的系统和方法得到的再生细胞适于直接放置于患病的接受者体内。

优选，从组织提取，到分离，浓缩，和将再生细胞放入接受者体内的整个程序是在相同设备中进行的，甚至是在经历该程序的病人的相同场所进行的。该再生细胞在提取和浓缩后较短的时间内就可以被使用。例如，该再生细胞在从病人获取组织约1小时后就可以使用，在一些情况下，获取组织约10到40分钟后就可以使用。在一个优选的实施方式中，该再生细胞在获取组织约20分钟后即可使用。从提取，到分离和浓缩的程序的整个长度可以依赖多种因素而有所变化，这些因素包括病人状况，被获取的组织类型和特定治疗应用所需要的再生细胞数量。就以产生对接受者的治疗，构成或修饰效果为目的的单个实施的程序而言，该细胞也可以与其他细胞、组织、组织片段、支架或其他细胞生长和/或细胞分化的刺激物一同放入接受者体内。可以理解的是，在该系统的分离和浓缩阶段之上的任何再生细胞的进一步处理都将需要与处理方式相应的时间。

为了使本发明更易于理解，首先定义一些术语。更多的定义在具体说明的过程中给出。

“再生细胞”是指，使用本发明的系统和方法得到的任何异源或同源细胞，其引起或有助于完全或部分地再生、恢复或替代器官、组织或生理单元或系统的结构或功能，从而提供治疗，构成或修饰效果。再生细胞的例子包括ASC，内皮细胞，内皮前体细胞，内皮祖细胞，巨噬细胞，成纤维细胞，周细胞，平滑肌细胞，前脂肪细胞，分化或去分化的脂肪细胞，角化细胞，单能和多能祖细胞和前体细胞(和它们的后代)，和淋巴细胞。

再生细胞可以提供治疗，构成或修饰效果的一个机制是，将其自身或其后代合并成为新生的，现存的或经修复的组织或组织成分。例如，ASC和/或它们的后代可以合并成为新生的骨骼，肌肉或其他结构性或功能性组织，并从而引起或有助于治疗，构成或修饰的促进。类似地，内皮细胞或内皮前体细胞或内皮祖细胞和它们的后代可以合并成为现存的，新产生的，经修复的或延伸的血管，从而引起或有助于治疗，构成或修饰效果。

再生细胞可以提供治疗，构成或修饰效果的另一个机制是，表达和/或分泌促进特定组织或组织成分的结构或功能的产生、保持、恢复和/或再生的分子，例如生长因子。例如，再生细胞可以表达和/或分泌导致组织或细胞生长增强的分子，然后这些组织或细胞直接或间接参与改善结构或功能。再生细胞可以表达和/或分泌生长因子，包括例如血管内皮生长因子(VEGF)、胎盘生长因子(PIGF)、bFGF、IGF-II、嗜酸粒细胞趋化因子(eotaxin)、G-CSF、GM-CSF、IL-12 p40/p7O、IL-12 p70、IL13、IL-6、IL-9、瘦素(Leptin)、MCP-1、M-CSF、MIG、PF-4、TIMP-1、TIMP-2、TNF-α、血小板生成素和它们的异构体，它们可以完成一种以上的以下功能：刺激新血管的发育，即促进血管生成；通过扩大它们的血液运输能力来改善已有小血管的供氧(间接)；诱导再生细胞从距离损伤远的部位向外运动，从而加强这些细胞向损伤部位的导引和迁移；刺激损伤部位细胞的生长和/或强化其生存，从而促进功能或结构的保持；释放具有抗凋亡能力的分子，从而减少细胞死亡和永久丧失功能的几率或可能性；与内源性再生细胞和/或其他生理机制相互作用。

正如进一步的描述，再生细胞可以以它们存在或利用本发明的系统和方法从组织中分离和浓缩的本来形式被使用，或者它们可以通过以下方式被修饰，即通过刺激或注入生长因子或其他生物反应修饰剂，通过基因转移(短暂的或稳定的转移)，通过根据主要成分或物理性质(例如样品大小或密度)、对固相物质的不同黏附、细胞表面或细胞内分子的表达、细胞培养或其他体外或体内处理、修饰或分馏而对得到的种群的进一步细分馏。如进一步的描述，再生细胞也可以与其他细胞或装置如人造或生物的支架，释放修饰或加强相应的细胞特性的因子、药物、化学物质和其他制剂的材料或装置联合使用。

这里所使用的术语“再生细胞组合物”是指，一种组织例如脂肪组织被清洗或至少部分地分解后，具有代表性地存在于一定体积液体中的细胞的组合物。例如，本发明的再生细胞组合物含有多种不同类型的再生细胞，包ASC，内皮细胞，内皮前体细胞，内皮祖细胞，巨噬细胞，成纤维细胞，周细胞，平滑肌细胞，前脂肪细胞，分化或去分化的脂肪细胞，角化细胞，单能和多能祖细胞和前体细胞(和它们的后代)，和淋巴细胞。再生细胞组合物还可能包括一种以上污染物，例如胶原蛋白，其可能存在于组织片段、或残留的胶原蛋白酶或其他的酶或使用的媒介中，或者来自这里所述的组织分解过程。

这里所使用的术语“伤口愈合”包括皮肤的所有病症，其特征为，皮肤和/或其下的结缔组织的任何疾病、紊乱、综合征、不正常、病理或异常状态，例如手术后的皮肤伤口，机械性外伤引起的皮肤磨损，腐蚀或灼烧，白内障手术或角膜移植后的角膜，感染或药物治疗后的黏膜上皮的伤口(例如呼吸道，胃肠道，泌尿生殖系统，乳腺，口腔，眼组织，肝和肾)，糖尿病伤口，移植后的皮肤伤口，血管修复术后的血管的再生长。伤口、疾病或紊乱的治疗是再生治疗的开始。

这里所使用的术语“缺血”是指，由于血液流入或流出的减少而导致的任何局部组织缺血。“缺血性伤口”是指，由于氧不足而导致伤口不能收紧和表皮不能再生。伤口愈合还包括非愈合伤口。一些内科和外科的情况形成非愈合伤口的高风险有关，例如糖尿病(I和II型)，慢性外周血管疾病，风湿性关节炎，充血性心力衰竭，动脉或静脉溃疡，淋巴水肿，肥胖，使用外因性类固醇，脉管疾病伤口，手术伤口恶化，化学创伤，和化学治疗或其他免疫抑制疗法导致的伤口。

这里所使用的术语“血管生成”是指，从现存的血管和组织中产生新的血管的过程(Folkman，1995)。“修复或重塑”是指，现存血管的改造。组织缺血的缓和极度依赖血管生成。新血管的自发生长在缺血区域提供间接的循环，改善血流，并减轻缺血引起的症状。血管生成解决了一些疾病和紊乱，包括急性心肌梗塞，缺血性心肌病，外周血管疾病，缺血性休克，急性肾小管坏死，包括AFT的缺血性伤口，脓血症，慢性肠道疾病，糖尿病视网膜病，神经病和肾病，脉管炎(vasculitidies)，缺血性脑病，生理性勃起功能障碍，缺血性或创伤性脊髓外伤，多器官功能衰竭，缺血性牙龈疾病，和与移植有关的缺血。

这里所使用的术语“干细胞”是指，具有分化成多种其他细胞类型潜能的多能再生细胞，其完成一种以上的特定功能并具有自我更新的能力。在此公开的一些干细胞可以是多功能的。

这里所使用的术语“祖细胞”是指，具有分化成多于一种细胞类型的多能再生细胞，并具有有限的活没有自我更新的能力。这里所用的“祖细胞”也指，具有只能分化成一种细胞类型潜能的单能细胞，其完成一种以上特定功能并具有有限的或没有自我更新能力。特别地，这里使用的“内皮祖细胞”是指，具有分化成血管内皮细胞潜能的多能或单能细胞。

这里所使用的术语“前体细胞”是指，具有分化成一种细胞类型潜能的单能再生细胞。前体细胞和它们的后代可以保持广泛的增生能力，例如在适宜条件下能够增生的淋巴细胞和内皮细胞。

“血管生长因子”或“血管生长蛋白”是指，任何已知的蛋白质，多肽或其他能够促进从现存血管生长新的血管的物质(“血管生成”)。本发明使用的适宜的血管生长因子包括但不限于，胎盘生长因子(Luttun等人，2002)，巨噬细胞集落刺激因子(Aharinejad等人，1995)，粒细胞-巨噬细胞集落因子(Busclunann等人，2003)，血管内皮生长因子(VEGF)-A，VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，VEGF-E(Mints等人，2002)，神经纤维蛋白(Wang等人，252003)，成纤维细胞生长因子(FGF)-1，FGF-2(bFGF)，FGF-3，FGF-4，FGF-5，FGF-6(Botta等人，2000)，血管生成素1，血管生成素2(Sundberg等人，2002)，红细胞生成素(Ribatti等人，2003)，BMP-2，BMP-4，BMP-7(Carano andFilvaroff，2003)，TGF-β(Xiong等人，2002)，IGF-1(Shigematsu等人，1999)，骨桥蛋白(Asou等人，2001)，Pleiotropin(Beecken等人，2000)，激活素(Lamouille等人，2002)，内皮素-1(Bagnato and Spinella，2003)和它们的联合体。血管生长因子能够独立地发挥作用，或者与彼此联合发挥作用。当联合时，血管生长因子也能够协同地发挥作用，因此因子的联合效果大于因子单独产生的效果的合计。“血管生长因子”或“血管生长蛋白”也这些因子的功能性类似物。功能性类似物包括，例如该等因子的功能性蛋白。功能性类似物还包括抗独特型抗体，其连接该等因子的受体，并因此在促进血管生成和/或组织重塑方面模拟了该等因子的活性。产生这样地抗独特型抗体的方法为本领域已知，并且例如在WO 97/23510中有所描述，其内容被本文的文献引用。

本发明中使用的血管生长因子可以制造从或任何适宜的来源得到。例如，该等因子可以从它们的天然来源纯化，或人工制造或通过重组细胞表达。该等因子可以作为蛋白质组合物被施加给病人。或者，该等因子可以以编码该等因子的表达质粒的形式被施加给病人。适宜的表达质粒的构建在本领域中是熟知的。用于构建表达质粒的适宜的载体包括，例如腺病毒载体，逆转录病毒载体，腺相关病毒载体，RNA载体，脂质体，阳离子脂质体，慢病毒载体和转位子。

这里所使用的术语“干细胞数”或“干细胞频率”是指，在细胞群落分析中观察到的群落数量，在该分析中，脂肪细胞(ADC)以低密度(＜10.000细胞/孔)覆盖并在支持MSC生长的生长培养基(例如，含有10％胎牛血清，5％马血清和15抗生物/抗真菌物质的DMEM/F12培养基)中生长。细胞培养2周，然后用苏木精染色，数出超过50个细胞群落则为CFU-F。干细胞频率的计算式，覆盖的每100个有核细胞中观察到的CFU-F的数量(例如，初始有核再生细胞数量为1000的板中数出15个群落，则其干细胞频率为1.5％)。干细胞数量的计算是，干细胞频率乘以得到的有核ADC细胞的总数。很高比例(～100％)的由再生细胞培养的CFU-F表达细胞表面分子CD105，该分子也被骨髓来源的干细胞表达(Barry等人，1999)。CD105也被脂肪组织来源的干细胞表达(Zuk等人，2002)。

这里所使用的术语“脂肪组织”是指，包括储存脂肪的结缔组织的脂肪。脂肪组织含有多种再生细胞类型，包括ASC和内皮祖细胞和内皮前体细胞。

这里所使用的术语“脂肪组织单位”是指，不连续的或可测量的脂肪组织的总数。可以通过确定一个脂肪组织单位的重量和/或体积来测量该脂肪组织单位。基于上述确定的数据，一个单位的脂肪抽吸细胞(processedlipoaspirate)，如从病人身上取下，具有至少0.1％的细胞成分是干细胞的细胞成分。关于本发明，一个脂肪组织单位可以是指，从病人身上取下的全部脂肪组织，或者是少于从病人身上取下的全部脂肪组织的数量。因此，一个脂肪组织单位可以与另一个脂肪组织单位结合，形成的脂肪组织单位具有各自单位的总数的重量或体积。

这里所使用的术语“部分”是指，少于全部的材料的数量。较小部分是指，小于50％的数量，较大部分是指大于50％的数量。因此，一个少于从病人身上取下的脂肪组织全部数量的脂肪组织单位就是取下的脂肪组织的一部分。

这里所使用的术语“脂肪抽吸细胞”是指，为了从成熟的脂肪细胞和结缔组织中分离活性细胞成分(例如，包括再生的成分)而经处理的脂肪组织。该片段在此是指，“脂肪来源的细胞”或“ADC”。典型地，ADC是指通过对来自脂肪组织的细胞进行冲洗和分离和浓缩而得到的再生细胞团块。典型地，通过离心分离细胞悬浮液而获得该团块，以便该等细胞聚集在离心室或细胞收集器的底部。

这里所使用的术语“给药”、“引入”、“释放”、“放置”和“转移”交替使用，是指通过导致至少再生细胞部分地定位在期望部位的方法或途径，将本发明的再生细胞放入受试者体内。该等再生细胞可以通过任何适当的途径给药，其导致向受试者的期望位置的释放，在此位置至少一部分细胞或细胞成分是维持有效的。对受试者给药后的细胞有效期间可以短为数小时，例如24小时，至数天，长至数年。

这里所使用的术语“处理”包括减少或减轻疾病或紊乱的至少一种不良作用或症状。

这里所使用的术语“再生细胞的治疗有效剂量”是指，足够带来有益或期望的临床效果的再生细胞的数量。所述剂量可以通过一次以上的给药方式来提供。但是，有效剂量的准确确定可能是以每个病人的个体因素为基础的，包括但不限于病人的年龄，身高，疾病的类型或程度，疾病的阶段，再生细胞的给药途径，所用的辅助治疗的类型或程度，正在进行的疾病处理和期望的治疗类型(例如，与常规治疗相对的有创见的治疗)。

这里所使用的术语“受试者”包括恒温动物，优选哺乳动物，包括人。在一个优选的实施方式中，该受试者是灵长类。在更优选的实施方式中，该受试者是人。

如上所述，再生细胞，例如干细胞和祖细胞可以从多种组织中获得。本发明的系统可以用于所有这样的组织。但是，脂肪组织是再生细胞的一个特别丰富的来源。所以，在此对本发明的系统进行图示说明，优选但不限于通过实施例的方式，使用脂肪组织作为再生细胞的来源。

脂肪细胞可以通过任何本领域技术人员已知的方法得到。例如，可以通过抽脂(辅助以注射器或动力)或脂肪切取，例如负压抽脂术，超声抽脂术，和脂肪切取术或其联用而从病人取下脂肪组织。脂肪组织被取下并收集，并可以按照所述的本发明系统的任意实施方式进行处理。所收集的组织的数量依赖多种因素，包括身体质量指数和提供者的年龄，收集的时间，可到达的脂肪组织采集部位的可用性，伴随和预先存在的药物治疗和生理状况(如抗凝血剂治疗)，和收集该组织的临床目的。例如，从瘦个体提取的100ml脂肪组织的再生细胞比例高于从胖提供者提取得到的(表1)。这很可能反映胖个体的更多的脂肪容量的稀释效果。因此，根据本发明的一个方面，可以期待从超重提供者得到与从较瘦病人抽取的数量相比更多的组织。这一发现也表明，本发明的应用并不限于具有大量脂肪组织的个体。

表1：身体质量指数对组织和细胞收率的影响

身体质量指数状况	得到的组织的数量(g)	总再生细胞
			正常	641±142	2.1±0.4
肥胖	1,225±173	2.4±0.5
			p值	0.03	0.6

对脂肪组织进行处理后，得到的再生细胞从成熟的脂肪细胞和结缔组织中充分游离。所以，本发明的系统产生大量不同种类的脂肪来源的再生细胞，其可以用于研究和/或治疗目的。在一个优选的实施方式中，该等细胞适于在接受者体内放置或再灌注。在其他实施方式中，该等细胞可以用于研究，例如该等细胞被用来建立能够长期存活、用于进一步研究的干细胞或祖细胞系。

下面具体说明本发明的优选实施方式，其例子结合附图说明。附图和说明书中尽可能地使用了相同或相似的标记数字，以指示相同或相似的部分。应该注意的是，附图为简化形式并不是准确比例。关于此处的公开，为了简单明了的目的，关于附图只使用了方向术语，如顶部，底部，左，右，上，下，上方，之上，之下，下方，后，前，末端，和最接近。这样的方向术语不以任何方式限制本发明。

虽然此处的公开涉及某些图示说明的实施方式，但应该理解为这些实施方式仅为举例而并非限制。以下具体说明尽管讨论的是例示的实施方式，但其目的是，覆盖能够落入权利要求所定义的本发明主旨和范围内的所有修改、选择和等同的实施方式。本发明可以与本领域常规使用的多种医疗程序联合使用。

参考附图，本发明的系统10一般包括组织收集室20，处理室30，废物室40，导出室50和样品室60中的一个以上。多种室由一根以上的导管12相连，以便包括生物材料的流体可以在密闭、无菌的流体/组织路径中从一个室流到另一个室。导管可以包括此处交替提到的刚性体或柔性体，分别如腔(lumens)和管(tubing)。在一些实施方式中，导管是软管的形式，如临床设备中常规使用的聚乙烯管，硅树脂或其他本领域中已知的材料。导管12可以根据是希望流体通过还是希望组织通过而改变其尺寸。导管12也可以根据通过系统循环的组织或流体的数量而改变其尺寸。例如，为了使流体通过，导管的尺寸可以具有约0.060至0.750英寸的直径范围，为了使组织通过，导管的尺寸可以具有约0.312至0.750英寸的直径范围。通常，选择导管尺寸来平衡导管能够提供的体积和运输组织或流体通过所述导管需要的时间。在自动控制的系统的实施方式中，必须确定所述参数，即体积和运输时间，以便适宜的信号能够被传递到该系统的处理装置。软管也应该能够承受正压力，该压力由例如可以在该系统中使用的正排气泵(positive displacementpumps)产生。

系统的所有室可以包括一个以上的接口，例如出口22或入口21，其接受标准IV注射器和抽吸管连接。这些接口可以是密封接口，如橡胶隔膜密封的注射器针头连接接口51。入口接口可以通过导管方式与一个以上的套管(没有表示)连接。例如，组织入口接口21可以与一个完整单独使用的抽脂套管连接，并且该导管可以是一软管。一般设置这些导管来提供流体从系统的一个室到另一个室的通路。在其末端，这些导管和接口可以与，例如可以手动或自动控制的抽吸装置(没有表示)连接。该抽吸装置可以是，例如注射器或电泵。该抽吸装置应该能够提供足够的负压来从病人身上抽取组织。通常可以使用本领域普通技术人员，例如外科医生已知的任何合适的抽吸装置。

导管12可以进一步包括一个以上的夹子(没有表示)来控制该系统多种成分的材料流。这些夹子通过有效地密封该系统的不同区域，用于维持该系统的无菌性。或者，导管12可以包括一个以上的控制通过该系统的材料流的阀门14。阀门12确定如附图中的开口圆环(open circles)。在优选的实施方式中，这些阀门可以是电动阀门(electromechanical pinch valves)。在其他实施方式中，这些阀门可以是气动阀门(pneumatic valves)。在另一些实施方式中，这些阀门可以是水压阀门(hydraulic valves)或机械阀门(mechanicalvalves)。这样的阀门优选通过可以与控制杆连接的控制系统来启动。这些控制杆可以手动操纵，以便启动这些控制杆。在自动控制的实施方式中，该控制系统可以与控制杆和以预先确定的启动条件启动阀门的处理装置连接。在一些自动控制的实施方式中，阀门的启动可以是一部分自动、一部分按照使用者的爱好，以便该处理可以被最优化。在另一些实施方式中，一些阀门可以被手动启动，另一些通过处理装置被自动启动。阀门14也可以与一个以上的泵，例如联合使用蠕动泵34或正排气泵(没有表示)连接。导管12和/或阀门14也可以包括传感器29，例如光传感器，超声传感器，压力传感器或本领域已知的其他形式的监控器，其能够区分流过该系统多种流体成分和流体级别。在一个优选的实施方式中，传感器29可以是光学传感器。

该系统可以包括多个过滤器36。在一些实施方式中，这些过滤器可以是在系统28的一个室内。系统的不同的室可以包括不同的过滤器。这些过滤器可以有效地将再生细胞，例如干细胞和/或祖细胞与不期望的细胞和可以按照该系统使用的未分解物质分离开。在一个实施方式中，过滤器部件36包括一个中空纤维过滤装置。在另一个实施方式中，过滤器部件36包括一个渗滤的过滤装置，其可以使用或不使用沉淀处理。在进一步的实施方式中，过滤器36包括一个离心装置，其可以使用或不使用淘析装置和处理。在另一个实施方式中，该系统包括这些过滤装置的联用。本发明的过滤功能可以是双重的，一些过滤器从最终的浓缩液中去除物质，如胶原蛋白、游离脂质体、游离脂肪细胞和残留的胶原蛋白酶，另一些过滤器用来浓缩最终产物。该系统的过滤器可以包括多个直径和/或长度范围为20到800μm的孔。在一个优选的实施方式中，收集室20有一个预先固定的过滤器，其具有多个范围为80到400μm孔。在另一个优选的实施方式中，收集室20有一个预先固定的过滤器，其具有多个265gm的孔。在其他实施方式中，这些过滤器可以是可分离的和/或一次性的。

该系统还可以包括一个以上的控温装置(没有表示)，其用来调节该系统的一个以上的室中含有的材料的温度。该控温装置可以是加热器，冷却器或这两者，即它可以能够在加热器和冷却器之间转换。该控温装置可以调节经过该系统的任何物质的温度，包括组织、未分解的物质，悬浮物质，残渣物质，清洗物质或添加剂。例如脂肪细胞的受热促进分解，而再生细胞产物的冷却被期望用来维持其存活。而且，如果优选的组织处理需要预温的试剂，那么该控温装置的作用就是维持该预先确定的温度，而不是提高或降低该温度。

为了维持一个密闭、无菌的流体/组织通路，所有接口和阀门可以包括一个维持该系统密闭结构的封闭物。该封闭物可以是不能渗透液体、空气和其他污染物的薄膜，或者是任何本领域中已知的适当的封闭物。而且，该系统的所有的接口设计用来容纳注射器、针头或其他用于抽出室中材料的装置，而不危及该系统的无菌性。

如上所述，组织可以经由任何技术上认可的方法从病人身上提取。抽出的组织可以在被放置于处理系统之前被提取。典型地，抽出的组织通过导管12，经密闭的进入接口，如橡胶隔膜密封的注射器针头连接接口(没有表示在收集室上)被转移到收集室20。或者，该组织提取步骤可以是该系统的一。例如，该收集室20可以包括一个真空管11，其使用插入病人体内的一个标准套管促进组织移动。因此，在该实施方式中，整个系统与病人相连。该组织可以通过一个入口接口21，经由导管，如作为密闭无菌通路的一部分的12a，被导入收集室20。收集室20可以包括多个柔性或刚性的罐或筒或其联合体。例如，收集室20可以包括一个以上不同尺寸的刚性罐。收集室20还可以包括一个以上的软袋子。在这样的系统中，最好该袋子具有支持物，如内部或外部的框架，其有助于在对袋子应用吸力时，减少袋子折叠的可能性。收集室20的制造尺寸是，用以容纳在处理室30中进行清洗和浓缩处理阶段前用于适当清洗和分解该组织所需要的生理盐水的数量。优选，收集室20中存在的组织或流体的体积是可以容易裸眼确定的。例如，为了从脂肪组织中得到再生细胞，适宜的收集室具有容纳800ml抽出脂肪和1200ml生理盐水的容量。所以，在一个实施方式中，收集室20具有至少2升的容纳容量。在另一个实施方式中，为了从血液中分离和浓缩血红细胞，收集室20具有至少1.5升的容量。通常，收集室20的尺寸依据从病人收集的组织的类型和数量而不同。收集室20的制造尺寸可以容纳小至约5ml大至约2升的组织。对于较小的组织体积，例如5ml到100ml，该组织可以在转移到收集室20之前被聚集。

收集室20可以是使用任何适宜的能够被消毒的生物适应的材料构建的。在一个优选的实施方式中，收集室20是使用符合ISO 10993标准中所述的血管内接触生物适应性需要的一次性的材料构建的。例如，可以使用聚碳酸酯丙烯酸(polycarbonate acrylic)或ABS。收集室20的流体路径优选是无热源的，即适于没有疾病传播危险的血液使用。在一个实施方式中，收集室20是使用使使用者能够在视觉上确定室中存在的组织的大概体积的材料构建的。在其他实施方式中，收集室20中组织和/或流体的体积是由自动传感器29确定的。收集室20的优选设计便于在自动控制的实施方式中，该系统能够以一个合理程度的准确度确定室中存在的组织和/或流体的体积。在一个优选的实施方式中，该系统以正负15％的准确度感知收集室内的体积。

在仅以实施例方式提供的特定实施方式中，收集室20是刚性室的形式，例如一个由医用等级的聚碳酸酯构建的室，其含有一个预先固定的医用等级聚酯材料的略圆锥性过滤器28，其网孔尺寸为265μm(见图5)。刚性组织收集器可以具有约8英寸高，约5英寸直径的尺寸；壁厚可以为约0.125英寸。可以通过例如一个以上用于抽吸管的接口，一个以上带有用于利用无菌对接技术收集的管的接口，和/或一个以上用于针头刺破橡胶隔膜连通的接口进入该筒内部。收集室20内部预先固定的过滤器28优选的结构是用于保留脂肪组织而滤去非脂肪组织，例如从病人身上取下的组织。更具体地，过滤器28使脂质体，血液和生理盐水能够通过，而保留脂肪组织的片段，这在该实施方式中是在脂肪组织最初获取的期间，在另一个实施方式中是在脂肪组织最初获取之后。因此，过滤器28包括多个孔，尺寸相同或不同，但尺寸范围为约20μm到约5mm。在一个优选实施方式中，过滤器28包括多个400μm孔。在一个优选实施方式中，过滤器28为约200μm厚的医用等级聚酯网，其具有约265μm的孔尺寸和约47％的开放区域。在冲洗期间，该材料保留组织但组织分解后允许细胞通过网。因此，当从病人抽取组织时，非脂肪组织可以从从脂肪组织中分离。使用不同材料、网尺寸和接口数量和类型可以获得相同功能。例如，网孔尺寸小于100μm或大到几千微米都将获得相同目的，即允许生理盐水和血细胞通过而保留总脂肪组织或脂肪组织片段。类似地，通过使用可选的刚性塑料材料或通过本领域技术人员已知的许多其他变体，可以获得相同目的。

系统10也可以包括一个以上的溶液源(solution sources)22。该溶液源可以包括一个清洗溶液源23，和一个组织分解剂来源24，如胶原蛋白酶。收集室29包括密闭液体通路，该通路允许清洗和分解溶液或制剂以无菌的方式加入该组织。

清洗溶液23和分解剂24的容器可以是能够以无菌方式容纳其内容物的任何适宜容器，例如折叠式袋子，如临床上使用的IV袋。这些容器可以具有与收集室20相连的导管12，如导管12e，以便可以通过任何技术上认可的方式将清洗溶液和分解剂运送到收集室20内部，这样的方式包括通过容器外边使用的用于生理盐水23和/或分解剂24的简单重力压，或通过在导管例如图4中的导管12d上设置正排气泵。在自动控制的实施方式中，该系统的处理装置参考多种参数，例如，生理盐水的体积，清洗和浓缩需要的循环的时间或次数，或分解剂数量，和以使用者初始输入信息为基础的分解需要的时间(例如，被处理组织的体积)。或者，该数量，时间等可以通过使用者手动控制。

收集室内的组织和/或流体应该维持在范围30℃到40℃。在一个优选的实施方式中，收集室内悬浮液的温度维持在37℃。在一些实施方式中，如果外科处理或治疗应用需要延迟，则所选择的组织可以被储存在收集室中待用。该组织在约室温下或约4℃最多可以被储存96小时。该清洗溶液可以是任何本领域技术人员已知的适宜溶液，包括生理盐水或其他缓冲液或非缓冲电解液。被处理的组织的类型决定所用的清洗溶液的类型或其联用。典型地，脂肪组织被从病人身体取下并放在收集室内后，向收集室20中加入该清洗溶液，如生理盐水。但是，清洗溶液可以在脂肪组织被提取前加入收集室20，或者可以和脂肪组织同时加入收集室20。在收集室20中，清洗溶液和提取的脂肪组织可以利用包括下述方法的任何手段被混合。

例如，该组织可以被搅动清洗(其使细胞存活最大化并使释放的游离脂质体最小化)。在一个实施方式中，该组织的搅动是通过以不同弧度(例如，通过约45度到约90度)，不同速度例如每分钟约30转，旋转整个收集室20而进行的。在其他实施方式中，该组织的搅动是通过以不同弧度(例如，通过约45度到约90度)，不同速度例如每分钟约30转，旋转整个收集室20而进行的，其中，该收集室20包括一个以上的桨或紧贴在收集室内表面的突起。上述收集室20的旋转可以是借助与收集室20相连或邻近的驱动装置完成的。该驱动装置可以是一个简单的皮带或齿轮或本领域已知的其他装置。旋转速度可以是，例如，每分钟30转。通常，更高的速度产生更大体积的游离脂质体，是不理想的。

在其他实施方式中，该组织的搅动是通过在收集室20内放置一个可旋转杆25，其中，该可旋转杆包括一个以上的桨25a或紧贴于可旋转杆25的突起，当杆旋转时其经过混合物。在一些实施方式中，具有紧贴的25a桨的可旋转杆25可以被置于收集室20的底部。例如，这可以通过将桨状装置放置于旋转的磁性区域(例如，磁力搅拌器)。或者，该组织的搅动可以使用本领域已知的简单的搅拌器，即进行上下摇动而非旋转的装置。该组织也可以使用包括摇晃，搅拌，倒置等任何技术上认可的其他方法进行清洗。

在期望数量的循环后，可以向收集室20中加入组织分解剂，从残留的脂肪组织成分中分离再生细胞。分解剂可以是本领域技术人员已知的任何分解剂。可以使用的分解剂包括中性蛋白酶，胶原蛋白酶，胰岛素，脂肪酶，透明质酸酶，脱氧核糖核酸酶，混合酶酶混合物族成员，例如Liberase H1，胃蛋白酶，超声或其他物理能量，激光，微波，其他机械装置和/或其联合。本发明优选的分解剂为胶原蛋白酶。分解剂可以与其他溶液一起加入。例如，生理盐水，如从上述生理盐水源23释放的生理盐水，可以与或胶原蛋白酶一同或在胶原蛋白酶加入后即刻加入。在一个实施方式中，被清洗的脂肪组织在约37℃与含有胶原蛋白酶的酶溶液混合约20-60分钟。在其他实施方式中，可以加入更高浓度的胶原蛋白酶或类似物质来减少分解时间。然后，被清洗的脂肪组织和该组织分解剂可以通过与上述搅动方式类似的方法搅动，直至被清洗的脂肪组织被分解。例如，被清洗的脂肪组织和该组织分解剂的搅动可以是，通过以大约90度的弧度旋转整个收集室而进行，通过使用包括一个以上桨的旋转杆而进行，该桨当旋转杆旋转时经过该溶液，和/或通过旋转整个收集室而进行，该收集室包括桨或收集室内表面的突起。

根据脂肪来源的细胞的使用目的，脂肪组织可以被部分分解，或完全分解。例如，在脂肪来源的细胞与脂肪组织单位连接的实施方式中，期望获得的脂肪组织部分地分解，以去除一部分部分性分解的脂肪组织，然后对残留在收集室中的剩余部分的脂肪继续进行分解。或者，在任何分解之前，一部分经清洗的脂肪组织可以被清除并留在样品容器中。在另一个实施方式中，在再导回病人体内之前，获得的脂肪组织被部分地分解，浓缩细胞。在一个实施方式中，脂肪组织与一种组织分解剂混合一段时间，通常小于约20分钟。然后，可以从收集室清除一部分部分分解的组织，并通过将该脂肪组织与脂肪组织分解剂再混合40分钟，以保持剩余的部分分解的脂肪组织可以进一步被分解。当脂肪来源的细胞作为必需的纯再生细胞群使用时，脂肪组织可以被充分分解。

分解后，该组织和分解剂溶液可以充分静置一段时间，以使溶液中易浮起和不易浮起的成分在收集室中分化。典型地，在改进的实施方式中，可以施行约15秒到几分钟的时间范围，而非其他时间。易浮起层包括需要进一步清洗和浓缩的再生细胞。不易浮起层包括血液，胶原蛋白，脂质体和组织的其他非再生细胞成分。不易浮起层应该被清除到废物室。

所以，优选收集室20在该室的最低点包括一个出口接口22，以发便血液和组织的其他不易浮起成分经一个以上的导管12，可以被排出到一个以上的废物容器40。收集室20通常位于(或可以被放置于)垂直位置，以便出口接口22被置于收集室的底部。这样的排出可以是被动的或主动的。例如，利用重力，通过使用正或负压力，通过使用泵34或通过使用排放口32，上述不易浮起成分可以被排出。在自动控制的实施方式中，处理装置可以发出信号指示一些阀门和/或泵，从收集室20中排出不易浮起层。这些自动控制的实施方式还可以包括传感器29，其能够检测易浮起液体和不易浮起液体界面的形成。自动控制的实施方式还可以包括传感器29，例如光学传感器，其能够检测经导管流出收集室的排出物的光折射的变化。光折射可以以信号表明导出导管中不易浮起层的存在，这说明不易浮起层已经排出。然后，传感器29能够发出信号指示处理装置继续进行下一步。

但是，在一些实施方式中，该组织可以经处理重新得到组织的非再生细胞成分。例如，在一些治疗或研究应用中，可以期望的是胶原蛋白，蛋白质，间质或基质成分，脂质体，脂肪细胞或该组织的其他成分。在这样的实施方式中，包括再生细胞的易浮起层如上所述必须被清除到废物室。那么，不易浮起层被保持在系统中用于根据需要的进一步处理。

一旦不易浮起层被清除，则包括再生细胞的易浮起层可以进行一次以上的清洗，以清除残留污染物。所以，典型地，收集室20包括一个以上用于向该室内部运送清洗溶液的接口21，和一个以上用于将废物和其他物质从收集室20中直接排出的接口22。例如，收集室可以包括一个以上所述的密闭的入口接口。收集室20还可以包括一个以上盖子(没有表示)，例如顶盖和底盖，用来进一步保证该系统在废物溶液被运送进入收集室和/或废物被排出时，能够维持无菌状态。接口21可以位于收集室盖子上或收集室的侧壁上。

可以使用新鲜洗液反复进行清洗处理，直至该溶液中的不易浮起污染物残留容量达到预先确定的水平。换言之，收集室中剩余的物质可以被额外清洗一次以上，直至不期望的物质的数量减少到期望的预先确定的水平，其中，收集室中剩余的物质含有包括脂肪组织片段的上述易浮起物质的混合物。确定清洗终点的一个方法是测量组织溶液中血红细胞的数量。其可以通过测量540nm波长下的吸光度而完成。在一个优选实施方式中，约0.546到约0.842是可以接受的。

在清洗和/或分解期间，可以按需要向多个容器中加入一种以上添加剂来强化结果。添加剂的一些例子包括，优化清洗和分解的物质，增强处理期间活性细胞群存活能力的添加剂，抗菌剂(例如，抗生素)，溶解脂肪细胞和/或血红细胞的添加剂，或丰富细胞群益处的添加剂(通过对固定相部分不同的附着性或其他方式促进实质性减少或丰富细胞群)。其他可能的添加剂包括促进再生细胞恢复和生存发育的添加剂(例如，凋亡酶抑制剂)或减少对灌注或设置(emplacement)的不良反应的可能性(例如，细胞或结缔组织凝集的抑制剂)。

充分静置后，得到的被清洗的脂肪组织片段和组织分解剂的混合物的不易浮起部分将含有再生细胞，例如，干细胞和其他脂肪来源的祖细胞。如上所述，含有再生细胞的不易浮起部分将被输送到处理室30，在这里，有益的再生细胞，例如脂肪来源的干细胞，将与该混合物的不易浮起部分的其他细胞和物质分离。该不易浮起部分是指再生细胞组合物，并含有多种不同类型的细胞，包括干细胞，祖细胞，内皮前体细胞，脂肪细胞和此处所述的其他再生细胞。再生细胞组合物还可以包括一种以上的污染物，如存在于脂肪组织片段中的胶原蛋白和其他结缔组织蛋白质及其片段，或来自组织分解过程的残留的胶原蛋白酶。

本发明的处理室30优选设置在系统内，以便再生细胞组合物通过导管12，阀门14和泵34，以无菌方式从收集室20移动到处理室30。设计处理室的尺寸以适应10ml到1.2L范围的组织/流体混合物。在一个优选实施方式中，设计该处理室的尺寸以适应800ml。在一些实施方式中，全部再生细胞组合物从收集室20导入处理室30。但是，在其他实施方式中，再生细胞组合物的一部分被导入处理室30，另一部分被导入系统的不同区域，例如样品室60，稍后与在处理室30中被处理的细胞重新组合。处理室30可以使用任何适宜的可以消毒的生物适应性材料构建。在一个优选的实施方式中，处理室30是使用符合ISO 10993标准中所述的血管内接触生物适应性需要的一次性的材料构建的。例如可以使用聚碳酸酯、丙烯酸、ABS、乙烯乙酸乙烯酯共聚物或苯乙烯-丁二烯共聚物(SBC)。在另一个实施方式中，该一次性处理室的流体通路是无热源的。该处理室可以是塑料袋的形式，例如血库中处理血时常规使用的塑料袋；或在其他实施方式中，其在结构上可以使刚性的(图6)。在一个实施方式中，处理室30可以与2001年12月7日提交的U.S.申请No.10/316,127和2002年12月20日提交的U.S.申请No.10/325.728中公开的处理室类似，其内容作为文献全部引用。

处理室30可以以任何适于分离和浓缩细胞的方式，包括过滤和离心和/或它们的联合来构建。在一些实施方式中，再生细胞组合物被从收集室20导入处理室30，在那里，该组合物被过滤来分离和/或浓缩特定的再生细胞群。细胞分离是一种从其他不同成分或类型细胞中分离特定成分和细胞的方法。例如，本发明的再生细胞组合物含有多种不同类型的细胞，包括干细胞，祖细胞和脂肪细胞，以及一种以上的污染物，如存在于脂肪组织片段中的胶原蛋白，或来自组织分解过程的残留的胶原蛋白酶。存在于处理室30中的过滤器36可以分离和浓缩再生细胞的特定亚群，例如干细胞或内皮祖细胞等。

与细胞从液体中的过滤有关的一些变量包括但不限于，过滤器介质的孔径，孔的几何学(形状)，过滤器的表面积，被过滤溶液的流动方向，跨膜压力，该特定细胞群的稀释，微粒尺寸和形状，以及细胞尺寸和细胞活性。根据这里公开的内容，典型地，期望分离或过滤的特定细胞是脂肪来源的干细胞。但是，在一些实施方式中，特定细胞可以包括单独的或与干细胞结合的脂肪来源的祖细胞，如内皮前体细胞，。

再生细胞组合物可以被引导经过过滤装置，如过滤装置36。在一些实施方式中，过滤装置36包括多个过滤器，其设置是为了完成不同功能和将再生细胞分成不同部分。例如，一个过滤器可以被设置用于从再生细胞组合物中分离胶原蛋白，一个过滤器可以被设置用于从再生细胞组合物中分离脂肪细胞和/或脂质体，一个过滤器可以被设置用于从再生细胞中分离残留的酶，如组织分解剂。在一些实施方式中，一个过滤器能够完成两项功能，例如从组合物中分离胶原蛋白和组织分解剂。典型地，多个过滤器为连续设置；但是，最好至少一部分过滤器可以平行设置。过滤装置36的连续设置的过滤器如图2所示。过滤装置36的平行设置的过滤器如图3所示。

在一个实施方式中，过滤装置36包括第一过滤器，第二过滤器，和第三过滤器。第一过滤器被设置用来清除再生细胞组合物中存在的胶原蛋白微粒。典型地，这些胶原蛋白微粒为直径约0.1微米，长度最长20微米。这些胶原蛋白微粒根据分解而有各种不同的尺寸。它们还可以是纤维，意味着它们具有螺旋和扭曲。此处所述的任何过滤器可以是由聚醚砜、聚酯，PTFE，聚丙烯，PVDF，或可能的纤维素制造的。过滤胶原蛋白有两种可能。一种是，先除去较大微粒，让细胞通过，这需要约10微米范围的过滤器的例子。第二种方法是，使用较小尺寸的过滤器，如4.5微米，目的是胶原蛋白被良好地分解，以便捕获细胞，让胶原蛋白通过。这需要使细胞流回过滤器的方式。还有一种完成过滤的可能是吸引并保留胶原蛋白纤维。

第二过滤器被设置用来清除游离的不成熟的脂肪细胞，其在再生细胞组合物中不浮起。在一个实施方式中，第二过滤器可以由聚酯材料构建并具有约30到约50微米之间的孔径，优选孔径为约40微米。尽管作为第二过滤器被提到，但这样的装置的设置可以是在第一位置，而非第二位置，来进行初始的较大细胞和微粒的清除。第三过滤器被设置用来清除未被使用的或残留的胶原蛋白酶或组合物中存在的其他组织分解剂。在一个优选的实施方式中，胶原蛋白酶可能经时降解。在一个实施方式中，第三过滤器包括多个直径或长度小于1μm的孔。在一些实施方式中，孔径可以小于1μm。在其他实施方式中，孔径在10kD和5之间。在一些实施方式中，第三过滤器可以被设置用来将再生细胞群浓缩进入如上所述的小体积的生理盐水或其他清洗溶液中。优选，只有最后的过滤器是中空的纤维单元。不必所有过滤器都是中空的纤维类型。在优选的实施中，中空纤维单元被用于最后的过滤器，这是因为其最有效地清除胶原蛋白酶并具有对再生细胞的最小损害效果。在该装置是分离隔板集合体的一个实施方式中，三个过滤器在分离的框架中。如果中空的纤维单元被用于第三过滤器，则将第一和第二过滤器合并在一个框架中就是可行的。如果最后的过滤器不是中空纤维构成的，那么所有的三个过滤器都可以被包含在一个框架中。

过滤装置36的过滤器可以设置于处理室30中或作为与处理室30分离的组成而被提供。另外，过滤装置36的过滤器可以被提供在多个处理室中或以内部连接(inline)的形式提供。在一些实施方式中，导管或通道可以用作一个或多个处理室。可以减小处理室的尺寸以便其成为连接过滤器的导管的内部体积。如果组织溶液的体积大小适宜，则此类型的系统经正确地发挥作用。因此，当细胞流流过过滤器时，通过容纳细胞流而作为处理室发挥作用。注意使导管体积最小化，以便在填装和运行该系统时，细胞/组织不会不必要的损失。

关于上述实施方式，包括被清洗的细胞和残留胶原蛋白、脂肪细胞、和/或未分解的组织分解剂的再生细胞组合物，可以被导入第一过滤器，用以从组合物中清除至少一部分，优选全部胶原蛋白微粒，以便极少，优选没有胶原蛋白微粒存在于被过滤的溶液中。然后，含有脂肪细胞和/或未分解的组织分解剂的被过滤的再生细胞组合物，可以被导入第二过滤器，用以从经过滤的再生细胞中清除至少一部分，优选全部游离脂肪细胞。随后，经两次过滤的再生细胞被导入第三过滤器，例如所述的中空纤维过滤装置，用以从再生细胞组合物中清除或减少未分解的组织分解剂。经三次过滤的再生细胞组合物(即，经过第一、第二、第三过滤器后残留的组合物)可以被导向多个出口，其可以包括具有多个出口的处理室30的一部分。这些出口能够帮助维持必要的压力，和提供经由导管与其他容器的连接，容器可以包括收集室20，导出室50，和/或废物容器40。

在一个实施方式中，过滤装置36的过滤器包括一个中空纤维过滤器成员。或者，换言之，该过滤器包括由纤维介质形成的中空管的集合体。可以在公开的系统10中使用的过滤器介质的例子包括聚砜，聚醚砜或混合的酯材料等。过滤介质的这些中空纤维或中空管可以被包含在过滤装置36的一个圆柱筒中。典型地，过滤介质的单个管道或纤维具有范围约0.1mn到约1mm的内径，优选约0.5mm。适宜的圆柱筒的直径和长度将决定能放置在圆筒内的的过滤介质单个管道的的数量。一个适宜的中空纤维过滤器筒的的例子是

Tangential Flow Filter，批号：#M-C-050K(Minntech，Minneapolis，Minnesota)。过滤器介质的孔的尺寸范围为约10kilo Daltons到约5微米，优选约0.5微米。

在中空纤维过滤器中，每个中空管的管身都具有第一末端和第二末端，以及位于管身内并在第一末端和第二末端之间延伸的内腔。每个中空管的管身包括多个孔。通常确定这些孔的方向，以便再生细胞组合物通过流经管身内腔而被过滤，并且如图12A所示，要过滤的产物切向通过这些孔。换言之，液体中的较小微粒切向通过这些孔，相对地，流体通过管身内腔。当再生细胞组合物被过滤时，该组合物通过每个中空管的内腔。优选，组合物流与每个中空管的管身是相切的。通过使用切线流体，与其他过滤技术相比，可以增强干细胞的过滤效果。例如，根据一些过滤技术，过滤介质孔的设置方式是，过滤器的方向与流体垂直，以致过滤介质阻碍被过滤流体的通路，如图12B所示。在这样的过滤中，被过滤离开再生细胞组合物的微粒，例如干细胞，往往堵塞在过滤器的另一侧而阻碍流体通过孔。这样的阻碍降低过滤效果。另外，细部一直受到流体压力加上细胞的重量，导致其聚集在过滤器的上游侧。这可能导致增加干细胞溶解。因此，在这样流体与过滤器孔方向平行的过滤技术中，当流体通过孔时，大细胞和小微粒的导向都与过滤器相反，只是不期望的。结果，液体中的较大产物，如细胞，可能阻塞孔，因而降低过滤效果并增加细胞破裂或损伤的发生。

相反，在本系统10的中空纤维结构中，被过滤的流体在中空管内腔流动。在流体施加于管身内侧的正压力和管身外侧的负压力的作用下，部分流体能够通过过滤器管身的孔。在该实施方式中，细部没有承受流体压力或其他细胞的重量，因而干细胞上的剪应力强度减小。因此，通过堵塞率和再生细胞溶解的减少，可以增加过滤效率。由于生理盐水和多余蛋白质的大小，过滤过程中，这些分子和其他小组分通过中空管管身的孔，到达中空管外侧，并被导向废物室40。在一个实施方式中，通过中空管过滤介质外侧形成真空而使过滤加强。由于再生细胞的大小，例如干细胞或祖细胞，这戏细胞不能通过管身的孔并因而保留的中空管过滤器的内侧(例如，在管腔内)，并经由过滤器和处理室之间的导管被导回处理室30或导出室50。

在特定的实施方式中，中空纤维过滤器具有约0.05微米的孔经，并包括大约550cm2表面积的过滤介质。单个介质管道具有约0.5mm的直径。在130ml再生细胞组合物的处理中，可以加入约120ml额外的生理盐水。处理或过滤时间约8分钟。中空纤维管管身两侧的压力差(例如，管身腔内的压力和管身外的压力)即被认为是跨膜压力。该跨膜压力的范围为约1mmHg到约500mmHg，优选约200mmHg。使用中空纤维过滤器，有核细胞的平均修复和存活能力可以是可存活细胞的约80％。

在这样一个系统中减少的胶原蛋白酶的数量等于对数上降低3(three logreduction)。例如，如果从收集室输送到处理室的再生细胞组合物中初始胶原蛋白酶浓度是0.078U/ml，那么最终再生细胞组合物中的胶原蛋白酶浓度则是0.00078U/ml。胶原蛋白酶在中空纤维过滤器中被清除，该中空纤维过滤器相当于上述的第三过滤器。

图示说明一种以上的上述细胞过滤方法的处理室如附图所示，特别是附图1-3。关于附图1-3，在处理室30和过滤装置36的过滤室之间可以安装一个泵，如泵34。另外，排放口和压力传感器，如排放口32和压力传感器39可以与处理室30和过滤装置36线形排放。还可以装配导出室50。在处理室30和过滤装置36之间可以提供这些可选组成(例如，泵34，排放口32，压力传感器39和配置导出室50)，以便处理室30中的液体可以在流过过滤装置36之前从这些可选组成的一个流向另一个。例如，液体在通过过滤装置36之前可以流经泵34。或者，在该系统中，液体可以在通过过滤装置之前通过压力传感器30，以获得一个过滤前液压。在一些情况下，也可以提供一个以上的这些组成作为处理室30的一部分，如图6中所示的排放口32。在图示的实施方式中，压力传感器30线形排列，用来确定再生细胞组合物进入过滤装置36的过滤室时由泵34产生的再生细胞组合物的压力。这一构造有助于监测跨越滤膜的跨膜压力。可以向再生细胞组合物中加入额外的生理盐水或其他缓冲液或洗液，用以在该组合物通过过滤装置36进行过滤时，协助清除多余蛋白质。可以进行反复多次的清洗来提高再生细胞的纯度。在一些实施方式中，可以在任何步骤中加入生理盐水，这被认为对于增强过滤是必须的。

在一个以实施例方式提供但不限于实施例的特定实施方式中，多余蛋白质和生理盐水或其他洗液以下述方式被清除。含有再生细胞、胶原蛋白、结缔组织颗粒或片段的组合物通过一系列过滤器循环，直至得到最小体积。该最小体积是由总的滞留体积(hold up volume)决定的，是一些预先确定的常量。滞留体积就是当所有处理室空时，保留在通道和导管中的液体体积。在一个实施方式中，最小体积是15ml。当达到该最小体积时，预先确定体积的清洗液被导入该系统并与再生细胞组合物混合。然后，该清洗液和再生细胞组合物的混合物通过过滤器循环，直至再次达到最小体积。可以多次重复该循环以提高在世细胞的纯度，或者换句话，是为了提高组合物中再生细胞向对于其他物质的比例。见图10和11。

根据特定的实施方式，确定再生细胞组合物已经洗去多余蛋白并被充分浓缩(在例示的实施方式中，可以使用约1×10⁵到约1×10⁷细胞/ml范围的最小浓度，在优选实施方式中，最小浓度可以是约1×10⁷细胞/ml)后，可以将导出室50，例如一个导出袋与处理室30和/或过滤装置36的出口接口连接。然后，可以打开排放口32促使浓缩的再生细胞排出。在一个实施方式中，在实验运行并被安排进入电子控制的设备后，根据经验确定何时达到最小浓度。该确定可以是期望得到的-即期望得到多少干/祖细胞，或细胞浓度的范围-的处理过程的输入值。基于科学数据，需要获得预先确定数量的脂肪组织，并放入系统以获得期望的输出。随着排放口32的打开，泵，如泵34可以发挥作用将浓缩的再生细胞输送到导出袋。在一个实施方式中，导出袋50与具有一端带配件的导管的空血袋相似。导出袋上的配件可以以无菌方式与出口接口连接，浓缩的再生细胞可以被输送到导出袋。

如图1-3所示，系统10中可以安装真空泵26，来改变系统内的压力。例如，真空泵26可以经由导管，如导管12b，与收集室20相连，以引起收集室20内的压力降低。真空泵26还可以经导管，如导管12g与处理室30相连。关于与泵34连接的真空泵26的操作，，可以装备两个分开的真空泵或真空源，或者通过使用阀门装备一个单个真空泵，该阀门在处理过程的特定点将真空引力导向需要它的不同的导管。另外，真空泵26可以经由导管，如导管12f，与废物室40相连。

关于图10和11，由真空泵26产生的压力可以被用来通过导管引导流体，包括再生细胞。该压力可以在多个方向上供应，例如，通过自动或手动控制系统10中一个以上的阀门14的位置。可以通过使用正压力或使用负压力，或者两者的结合，使系统10发挥作用。例如，再生细胞被拉动经过上述第一和第二过滤器进入一个与第三过滤器相连的有支撑的软容器中。该有支撑的软容器可以是与第三过滤器的前部线形(连续)连接。最终的导出室可以是位于第三过滤器的另一侧(例如，下游侧)的一个有支撑的软容器。在这一实施方式中，利用压力，经过过滤器将再生细胞从一个有支撑的柔软容器移动到另一个有支撑的柔软容器中。

在系统10的另一个实施方式中，可以利用渗滤和沉降相结合，完成干细胞和/或脂肪来源的祖细胞的过滤。例如，这样的系统使用先经过再生细胞组合物(例如，包括干细胞和/或脂肪来源的祖细胞的组合物)，再经过过滤器的生理盐水。一些与细胞从再生细胞中的渗滤过滤有关的变量包括但不限于，过滤介质的孔径，孔的几何学或形状，过滤器的表面积，被过滤的再生细胞组合物的流动方向，灌注的生理盐水的流速，跨膜压力，细胞群的稀释，细部大小和活性。

在系统10的一个实施方式中，处理室30使用了一个过滤装置36，其进行渗滤和沉降来分离和浓缩再生细胞。借助但不限于实施例的方式，处理室30被定义为如图6所示的具有侧壁30a，顶面30b，底面30c的圆柱体。顶面30b安装有一个无菌排放口32。

在图6的实施方式中，对包括过滤装置的处理室30进行了图示说明，其包括两个过滤器，如大孔过滤器36a和小孔过滤器36b。过滤器36a和过滤器36b的孔的大小范围为约0.05微米到约10微米之间。大孔过滤器36a可以包括直径约5μm的孔，小孔过滤器36b可以包括直径约1-3μm的孔。在一个实施方式中，过滤器具有约785mm2的表面积。过滤器36a和36b将处理室30的内部分成第一室37a，第二室37b，和第三室37c。如图6所示，第一室37a位于第二室37b和第三室37c之间。而且，所示第一室37a是处理室30中具有入口接口31a和出口接口31b的区域。图示的处理室30包括提供由处理室30外向处理室30内的流通路径的多个接口，如接口31a，3b和31c。如图所示，接口31a，3b和31c被安装在处理室30室体的侧壁30a。但是，接口31a，3b和31c也可以被设置在其他区域。图示的接口31a是入口接口的例子，其与一个导管相连以便含有再生细胞的组合物能够通过并进入处理室30内。图示的接口3b是出口接口，其连有导管以便被分离和浓缩的细胞可以从处理室30排出。图示的接口31c是入口接口，其连有导管以便将新鲜的清洗液，如生理盐水输入处理室30内。

使用时，可以将再生细胞经入口接口31a导入中央室37a。生理盐水或其他缓冲液经入口接口31c被导入底部室37b。生理盐水也可以以约10ml/min的速率被引导通过室37a中的再生细胞组合物。使生理盐水的流速可以抵消重力。生理盐水的流动使室内的细胞能够基于细胞密度进行分离。典型地，当生理盐水被向上推动经过组合物时，组合物中的较大细胞会沉到中央室37a的底部，而较小细胞和蛋白质将被运载经过第二过滤器36b进入顶部室37c。进行过滤时调整生理盐水的流速，以便较大细胞被带动到能使较小微粒被释放并被生理盐水带走的位置。处理室30中还包括无菌阀门32，以保证在该处理装置的三个室中维持适当的压力梯度。37c可以包括吸收介质33。该吸收介质的目的是捕捉溶液中的多于蛋白质，以保证如果生理盐水流速降低的话，它们不会越过过滤器返回处理溶液。吸收介质可以是一种类型的过滤材料，其具有对物质的吸收性或捕捉被滤除的物质或成分。在顶部过滤器上可以加装流出接口，帮助废物流出。其另一个实施方式是在顶部应用缓和的真空状态，推动废物排出。如图示的实施方式，吸收介质可以在流速相对小时使用。然后，多余的生理盐水和蛋白质被运到废物容器。

如上所述，当较大细胞(例如，脂肪来源的干细胞和/或祖细胞)与较小细胞和蛋白质充分分离后，含有被分离细胞的组合物就可以被浓缩。该组合物在经出口接口31b从室37a移出后或在室37a中时，可以被进一步浓缩。在一个实施方式中，以下述方式使组合物中细胞的浓度提高。细胞被充分分离后，过滤器，如过滤器36a和36b可以向彼此移动。此移动具有使两过滤器间的体积(例如，室37a的体积)减小的作用。还可以提供一个与处理室30连接的振动部分，来促进组合物内细胞的浓缩。在一个实施方式中，该振动部分可以与过滤器36b(例如，小孔过滤器)连接。振动可以减少过滤器中细胞溶解的发生。组合物体积的减少使多余的生理盐水能够作为废物排出，并且细胞被浓缩为更小的体积。

在另一个实施方式中，再生细胞的浓缩是以下述方式实现的。细胞被充分分离后，再生细胞组合物可以被运送到另一个室(没有表示)，其利用重力滤除多余的生理盐水。在优选的实施方式中，可以在渗滤的同时发生沉降。该沉降可以通过在过滤器顶部引入该组合物而实现，该过滤器的孔的尺寸范围是约10kD到约2微米。在一个实施方式中，适宜的过滤器具有约1微米的孔。重力使生理盐水和较小微粒通过过滤器而阻止该组合物中的细胞流过该过滤器。在得到期望的细胞浓度并且被过滤的较小微粒已经被从下方的过滤器清除后，可以搅动再生细胞组合物使其离开过滤器，接着该被浓缩得再生细胞可以被输送到导出袋。较小微粒可以作为废物经出口被排出。

在一个特定的实施方式中，来自收集室20的再生细胞组合物被运送到处理室30，在那里该组合物被离心来分离和浓缩再生细胞。离心的原理为本领域已知，出于简略的目的，在此不再重复。这里使用的是标准的、经认可的离心分离设备，成分和变量。一个用作离心分离设备部分的例示的处理室如图7和8所示。典型地，离心设备使离心室(如图7所示)绕轴旋转，因而使加在溶液中细胞上的力大于重力。溶液中浓重的物质沉淀到离心室的一端，即图7的导出室50，形成再生细胞团块。然后，该团块被再次悬浮以获得具有期望浓度的细胞和/或期望体积的细胞和溶剂的溶液。图7所示的处理室使用离心和重力两者来分离和浓缩细胞。具体地，离心过程中，离心力引导再生细胞组合物中较浓的成分，例如再生细胞向着离心室的远端。当离心室变慢并最终停止时，重力帮助该再生细胞停留在该离心室的远端并形成细胞团块。所以，再生细胞组合物的多余成分，即废物可以被清除而不会破坏细胞团块。

在本发明的另一个实施方式中，处理室可以包括一个旋转薄膜过滤器形式的细胞浓缩器。在离心处理的进一步的实施方式中，也可以使用离心淘洗法。在此实施方式中，可以基于单个细胞的沉降率进行细胞分离，以便离心所使用的定向力(例如，向外)使细胞和溶质以不同的速度沉降。淘析中，靶细胞群的沉降速度与一个相反流速(例如，向内)对抗，该相反流速是由与离心力反向注入的溶液产生的。调整改逆流，以便使该溶液中的细胞和微粒分离。淘析已经被应用在许多细胞分离的例子中(Inoue，Carsten等人1981；Hayner，Braun等人1984；Noga 1999)，并且根据本发明的公开，本领域技术人员可以在此应用用于优化流动和离心参数的理论和实践。

图9说明与本发明的淘析有关的原理。该淘析的实施方式在使用旋转转子对溶液施加力的方面与离心是类似的。一些与本发明的淘析分离有关的变量包括但不限于，旋转室的大小和形状，转子的直径，转子的速度，逆流管的直径，逆流的流速，和从溶液中清除的细胞和微粒的大小和密度。离心时，再生细胞可以基于单个细胞的密度而被分离。在一个实施方式中，再生细胞组合物，例如含有再生细胞和胶原蛋白的溶液，如图9.1所示，被导入旋转子的室中。该溶液被加入该室中后，以预先确定的速度向该室中加入生理盐水。该生理盐水流速的预先确定取决于转子速度，细胞直径，和以经验确定的该室的常数。例如，可以使用一个类似于IV泵的设备控制流速。额外的生理盐水的目的是在转子内提供一个环境，在那里较大微粒将移动到该室的一端，而较小微粒将移动到另一端，如图9.2所示。应用时，调整生理盐水流，以便较小微粒离开该室，移动到废物容器，如图9.3所示。该运动导致大体同源的细胞群，如干细胞。确定干细胞已经同溶液中的其他物质分离后(多余蛋白质和游离脂质体被从该室清除)，停止该逆流。然后，室内的细胞会在该室的外侧壁上形成浓缩的团块。倒转逆流，细胞团块被运送到导出袋。

如上所述，处理室30或导出室50可以包括一个以上的接口，例如接口51或52。一个以上的这些接口被设计用来将再生细胞或其一部分经由导管运送到其他外科设备，细胞培养设备，细胞浸泡(cell marinading)设备，基因治疗设备或纯化设备中，这些再生细胞是使用上述任何方法的联合得到的。这些接口也可以被设计用来将再生细胞经由导管运送到该系统中附加的室或容器中，或为了与上述相同的目的作为另一个系统的一部分。这些接口和导管也可以用来添加一种以上的添加剂，例如生长因子，再悬浮流体，细胞培养剂，细胞扩张剂，细胞保存剂或细胞修饰剂，包括将基因转入细胞的制剂。这些接口和导管也可以用来将再生细胞运送到其他目标，如植入材料(例如，支架或骨架片段(bone fragments)和其他外科植入物和设备。

还可以通过重新组装现存系统的一次性部件的相互连接，通过重新设计现存系统的处理方案，通过为现存系统提供不同或额外的容器和/或室，通过将细胞运送到一个以上附加系统或设备和/或它们的联合，从而开始对细胞的进一步处理。例如，该系统可以通过上述的任何方式进行重组，以便使用该系统得到的再生细胞可以经受如下的一种以上：细胞扩张(一种以上的再生细胞类型)和细胞维持(cell maintenance)(包括细胞片清洗和介质更换)；移种；细胞接种；瞬时转染(包括来自大量供应的转染细胞的接种)；或取(包括酶或取，非酶或取和机械刮擦获取)；测量细胞活性；细胞平埋(例如，在微量滴定板上，包括从单个孔采摘细胞用于扩张，细胞扩张进入新的孔)；高通量筛选；细胞治疗用；基因治疗用；组织工程学应用；治疗蛋白用；病毒疫苗用；获取再生细胞或悬浮液用于储备或筛选，细胞生长、溶解、接种、传染、诱导的测量；细胞系的产生(包括杂交瘤细胞)；用于渗透性研究的西部的培养；用于RNAi和抗病毒研究的细胞；用于基因敲除和转基因动物研究的细胞；亲和纯化研究；结构生物学应用；化验开发和蛋白质工程应用。

例如，如果为了特定的使用而需要再生细胞的扩张，则可以使用以下方法，即利用培养条件优先扩张该群而其他群由于缺少生长条件而或者维持或者丧失。Sekiya等人已经描述了相关的可以用于骨髓来源的干细胞的条件(Sekiya等人，2002)。该方法(有或没有对组织培养塑料品的不同黏附性)可以用于本发明的更多的实施方式。在该实施方式中，最终的再生细胞团块被从导出室清除并被置于另一个系统，提供细胞培养成分。这可以是以常规的实验室组织培养孵育器方式或生物反应器型设备，如Tsao等人，美国专利No.6,001,642，或Armstrong等人，美国专利No.6,238,908中所述。在另一个备选的实施方式中，细胞扩张货细胞培养成分可以被加入到现存的系统中，例如，加入到处室，提供短期黏附和脂肪来源的细胞群的细胞培养。该备选的实施方式允许细胞培养和/或细胞扩张成分的结合，并排除了从该系统中清除该细胞并放置在另一系统内的需要。

处理期间，可以根据需要加入一种以上的添加剂或提供多个室或容器，以强化结果。这些添加剂也可以作为与现存系统有关的或与现存系统分离的另一系统的一部分被提供。例如，在一些实施方式中，添加剂被加入或提供，并不需要从该系统中清除再生细胞。在另一些实施方式中，通过以无菌的方式将含有添加剂的容器或室与该系统未使用的接口连接，添加或提供添加剂。在其他实施方式中，添加剂被加入或提供在另一个系统或设备中，其并不语本发明的系统相连。一些添加剂的例子包括优化清洗和分解的制剂，增强活性细胞群在处理过程中的存活能力的添加剂，抗菌剂(例如，抗生素)，溶解脂肪细胞和/或血红细胞的添加剂，或丰富细胞群益处的添加剂(通过对固定相部分不同的附着性或其他方式促进实质性减少或丰富细胞群)。

例如，为了得到同源再生细胞群，可以使用用于分离和浓缩特定再生细胞类型的任何适当的方法，例如使用识别并结合抗原的细胞特异性抗体，该抗原存在于例如干细胞或祖细胞上，例如内皮前体细胞。这些既包括阳性选择(选择靶细胞)也包括阴性选择(选择性去除多余细胞)，或它们的结合。使用与特定酶作用发出荧光的分子，则细胞内标记，如酶也可以用在选择中。另外，在本系统的到处室中可以附有具有粘性的固相材料，其用来提供最终细胞团块中特定再生细胞群的特异性黏附和/或洗脱。

该特异性黏附方法的一个备选实施方式包括，使用特异性表达在靶再生细胞和多余细胞表面的分子的抗体和/或抗体的结合物。另一项普遍应用的技术是，基于特定细胞表面标记物(或其结合物)的表达的选择，其中，抗体附于固相支持结构上(Geiselhart等人，1996；Formanek等人，1998；Graepler等人，1998；Kobari等人，2001；Mohr等人，2001)。

在另一个实施方式中，细胞团块可以被再悬浮，在流体物质上(或下)成层，形成连续或不连续的密度梯度，并被置于离心机中，根据细胞密度进行分离。在类似的实施方式中，可以使用连续流动方法，如血浆分离置换法(Smith，1997)和淘析法(有或没有逆流)(Lasch等人，2000)(Ito和Shinomiya，2001)。

添加剂的其他例子包括附加的生物或结构成分，例如所述的细胞分化因子，生长促进剂，免疫抑制剂，医疗设备，或它们的连用。例如，可以加入其他的细胞，组织，组织片段，生长因子，如VEGF和其他已知的血管或动脉(arteriogenic)生长因子，生物活性或惰性化合物，吸收性支架，或其他能够增强再生细胞群的传递性，有效性，耐受性或功能的添加剂。也可以通过DNA插入或通过放置于细胞培养系统(如本文所述或已知技术)中，而在改变，增强，或补充再生细胞用于结构或治疗目的所需的功能方面，使再生细胞群得到改进。例如本领域普通技术人员已知的干细胞的基因移植技术，如(Morizono等人，2003；Mosca等人，2000)中的公开，并可以包括病毒转染技术，和更具体的，腺相关病毒基因移植技术，如(Walther和Stein，2000)和(Athanasopoulos等人，2000)中的公开。也可以施用(Muramatsu等人，1998)中公开的基于非病毒的技术。还可以加入一个基因编码的一种以上的细胞分化因子，例如，生长因子或细胞因子。(Gimble等人，1995；Lennon等人，1995；Majumdar等人，1998；Caplan和Goldberg，1999；Ohgushi和Caplan，1999；Pittenger等人，1999；Caplan和Bruder，2001；Fukuda，2001；Worster等人，2001；Zuk等人，202001)中公开了多个细胞分化剂的例子。也可以加入多个基因编码的抗调亡因子或物质。基因增加(或基因结合)可以是通过本领域已知的任何技术，包括但不限于腺病毒转导，“基因枪”，脂质体介导的转导，和反转录病毒或慢病毒介导的转导，质粒，腺相关病毒。然后，这些再生细胞可以与携带基因传递媒介的载体材料一同被灌注，这些基因传递媒介能够经时将基因释放和/或提供给细胞，以便转导能够在原位继续或被启动。

当细胞和/或含有该细胞的组织被施加该细胞和/或组织来源病人以外的病人时，可以对接受该细胞和/或组织的病人施加一种以上的免疫抑制剂，以便减轻，优选阻止移植排斥。这里所用的术语“免疫抑制药或免疫抑制剂”是指，抑制或干扰正常免疫功能的药物。适用于此处公开的方法的免疫抑制剂的例子包括，抑制T细胞/B细胞协同刺激途径的物质，如美国专利公开No.20020182211中公开的，干扰T细胞和B细胞经CTLA4和B7偶联的途径。优选的免疫抑制剂为环孢霉素A。其他例子包括霉酚酸酯、纳巴霉素(rapamicin)和抗胸腺细胞球蛋白。在一个实施方式中，免疫抑制药与至少一种其他治疗剂一同给药。免疫抑制药以与药途径相匹配的方式和足以得到期望疗效的剂量被施加。在另一个实施方式中，免疫抑制药被短期地施加足够的时间，以引起对本发明的再生细胞的耐受性。

在这些实施方式中，可以通过任何公认的方式，包括装置如搅拌装置和这里所述的有关方法，将再生细胞与添加剂接触，合并，混合或添加。例如，可以使用摇动，倒置，脉冲加压或移动滚筒。

另一方面，细胞群可以被放入接收者体内，并被可再吸收的塑料外壳或其他材料和有关成分，如MacroPore Biosurgery，Inc制造的材料(见例如，美国专利Nos.6,269,716；5.919,234；6,673,362；6,635,064；6,653,146；6,391,059；6,343,531；6,280,473)所包围。

在上述所有的实施方式中，至少一部分被分离和浓缩的再生细胞可以被低温保存，如2002年9月12日提出的美国专利申请No.10/242,094，题目是来自非造血组织的非胚胎细胞的保存(PRESERVATION OF NONEMBRYONIC CELLS FROM NON HEMATOPOIETIC TISSUES)，其要求保护2001年9月14日提出的美国临时专利申请60/322,070的权利，其被普遍发行，且其全部内容在此被清楚地引用。

处理结束，再生细胞可以被手动地从到处室取回。该细胞可以被装入一个传递释放设备，如注射器，通过皮下注射、肌肉注射、或其他能够使该细胞释放到病人体内目标部位的技术，被放入接收者体内。换言之，可以通过本领域技术人员已知的任何方式将细胞放入病人体内。优选的实施方式包括，通过针头或导管，或直接的外科植入方式。在其他实施方式中，该细胞可以被自动输送到导出室，导出室可以是容器、注射器或导管等形式，其可以用来将细胞放入病人体内。容器也可以用来为以后的使用或低温保存而储藏细胞。全部取回方式都是以无菌方式完成的。在外科植入的实施方式中，西部可以与添加剂，如所述预成型的模具或支架联合使用。

在本发明优选的实施方式中(例如，图4所示的实施方式)，该系统是自动控制的。在另一个实施方式中，该系统既是自动控制也是手动控制的组件。该系统可以包括一个以上一次性构件，其连接于或安装在可重复使用的金属构架或组合部件内。本发明的自动控制的系统提供提示系统正确操作的屏幕显示(见图16)。自动控制系统还可以提供一个提供屏幕，其提供程序状况和/或关于正确建立该系统的一次性构造一步一步的指示。如果系统中发生问题或错误时，该屏幕还可以进行指示，并提供“故障判断并排除”的指导。在一个实施方式中，该屏幕一个使用者的界面屏幕，它允许使用者通过例如触摸屏，向该系统中输入参数。

部分或全部自动控制系统可以包括一个处理设备(例如，微处理器或个人电脑)和有关软件程序，其基于使用者的输入为系统提供控制逻辑来操作和自动控制一个以上的处理步骤。在一些实施方式中，一项以上的内容是使用者可以利用处理设备内的软件进行预先编程的。该处理设备在只读存储器中可以具有一个以上预先编程的软件程序。例如，该处理设备可以具有适合处理血液的预先编程的软件，用于处理脂肪组织来获得小体积的再生细胞的另一个程序，和用于处理脂肪组织来获得大体积的再生细胞的另一程序。该处理设备还可以具有如下预先编程的软件，其根据使用者输入的相关信息，如所需要的再生细胞数量，被处理的组织类型，所需要的后处理操作的类型，质量应用的类型等，为使用者提供合适的参数来优化该处理。

该软件还可以提供一些自动控制步骤，例如通过控制泵和系统的阀门控制流体和组织沿特定通道的出入；控制活化的正确顺序和/或方向；用压力传感器检测障碍；混合机构，使用测定体积的机构测量沿特定通路移动的组织和/或流体的数量；使用热控装置保持多种成分的温度；和利用定时和软件机制合并分离和浓缩处理。该处理设备还能够根据被处理的组织类型和/或被获得的细胞群或亚群，和被执行的程序的类型(例如，使用再生细胞扩张的脂肪组织的脂肪增加，或用于使用再生细胞涂覆的骨移植进行骨修复的细胞的处理)，对离心的速度进行控制。该处理设备还可以包括标准的平行或连续的接口或者与其他计算机或网络连通的其他方式。所以，该处理设备可以使一个单独的单元，或与一个以上用于这里所述的进一步处理方法的附加设备相连。

软件可以允许“运行数据”的自动采集，包括例如一次性成分的份数，测量的温度和体积，组织体积和细胞数量参数，所用酶的剂量，孵育时间，操作者身份，日期和时间，病人身份等。在被设备的一个优选实施方式中，将引入一个特征识别系统，如条码读解系统，来准许这些变量(例如一次性装置的份数和有效日期，胶原蛋白酶的份数和有效期，病人/样品标识符等)的数据作为处理文件的一部分输入该处理设备。这将减少数据输入错误的机会。使用USB或其他本领域已知的界面接口和系统，这样的条码读解系统可以被很容易地引入。以此方式，该设备将提供数据输入和文件处理的综合控制。这些参数的打印输入报告将是该系统变成操作中由使用者定义的参数的一部分。自然地，这将需要打印机部分(硬件和驱动程序)或软件中的打印机驱动加上设备硬件中连接打印机的端口输出(例如，USB接口)。

在一些实施方式中，该系统为全自动系统。例如，使用者可以初始选择被处理组织的数量，将该系统与病人相连，该系统可以自动抽取所需组织，并以不间断的顺序分离和浓缩再生细胞，而不需要使用者的进一步输入。使用者也可以输入所需要的再生细胞的数量，并允许该系统抽取需要数量的组织并进行处理。全自动系统还包括，能够根据多个(例如，两个以上)使用者输入的参数，例如清洗循环的数量、离心速度等，进行重组的系统。该系统也可以以半自动的模式运行，运行过程中该系统一些步骤的进行可以不需要使用者的干涉，但某些处理的发生需要使用者的干涉。其他实施方式中，该系统是一个单个完整的系统，其显示指令来指导使用者在预先确定的时间完成预先确定的操作。例如，处理设备可以提示使用者导管、室和系统其他构造正确插入所必需的步骤。所以，使用者能够确保操作正确顺序的进行。这样地系统可能额外需要使用者确认每个操作步骤，以防止处理中的疏忽行为或终止步骤。在另一个实施方式中，该系统可以启动自动检测来确定导管、室的正确插入，无障碍等。在另一个实施方式中，本发明的系统能够被编程，自动控制流经系统的组织，来完成多个分离和浓缩处理。这一特点在例如在对病人进行的外科手术中是很重要的，其将可能流失的组织收集到系统中，并再生细胞从该组织中分离和浓缩，返回病人。

如上所述，该系统的组件可以是一次性的(这里称为“一次性装置”)，以便该系统的部分在一次使用后可以被除去。这一操作能够帮助保证，与病人的组织接触的任何表面在使用后被适当处理掉。一个示范的一次性装置如图13所示。在优选的实施方式中，系统的一次性构造被预先消毒并包装，以成为可以使用的“现成”产品，其便于使用和装载，并且排除了对于许多管道连接和管道连接的复杂线路的需要。这样的一次性构造相对于产品是比较便宜的，并因为它们的可一次使用性而不造成实质的费用。在一个实施方式中，该一次性系统(交替称为“一次性装置”)包括收集室20，处理室30，废物室40，导出室50，过滤装置36，样品袋60和有关导管12或管道，基本由这些组成，或由这些组成。在本系统一次性装置的优选实施方式中，收集室20和处理室30由导管12连接，并被安装在一个刚性框架中。处理室30的旋转密闭网(图7和8)也可以被安装在相同的刚性框架中。在另一优选实施方式中，一次性装置的多个室和容器包括能够与该系统的处理设备连通的必需的端口，以便泵、阀门、传感器和自动控制该系统的其他设备可以根据需要启动或不启动，而无需使用者的干预。该端口也可以减少建立该系统需要的时间和专门技术，并通过指示如何正确安装该系统和在错误发生时发出信号而减少错误的发生。

本发明的多数一次性装置具有许多普通元件。但是，普通技术人员会认识到，该系统的不同应用可能需要额外的构造，其也许是一次性装置的一部分。所以，该一次性装置可以进一步包括，一个以上适于从病人获得脂肪或其他组织并将再生细胞返回病人的针头或注射器。所包括的针头和注射器的型号、数量和种类依赖于被处理的组织的类型和数量。该一次性装置可以进一步包括一个以上刚性或柔性容器，来容纳洗液和系统中使用的其他处理试剂。例如，该一次性装置可以包括容纳生理盐水、酶和过程需要的任何其他处理或置换的液体。另外，适宜的洗液、再悬浮流体、添加剂、试剂或移植材料可以与该一次性装置一起提供，协助本发明的系统和方法的使用。

可以以试剂盒的形式提供实施本发明所需要的系统构造、装备或所述增补品的合并等。例如，本发明的试剂盒可以包括，例如用于吸脂注射器的最佳长度和定量的针头，和包括能够处理小体积组织的优选过滤介质的注射器。其他例示的可以用于本发明并且也可以被包括在本发明的试剂盒中的装备和增补品如表II和III所列。

表II以下确定了能够用于根据本发明的系统和方法获得脂肪来源的再生细胞的物品：

表II

表III以下确定了能够用于发明的系统和方法的设备：

该系统中可重复使用的构造包括收集室的搅拌装置，泵，启动阀门和泵控制器的多种传感器，离心机，离心机的旋转框，使用者端口屏幕和USB接口，用来连接一次性装置的连锁或对接设备或配置，以便该一次性装置可以安全地与可重复使用的金属结构和其他相关设备连接。一个例示的可重复使用的结构如图14所示。在优选实施方式中，该可重复使用的结构包括，用于从再生细胞组合物中分离和浓缩再生细胞的手段，例如旋转离心。在该实施方式中，该可重复使用的结构被设计与如图15所示的一次性装置的处理室(包括离心室)的一部分相连。可以理解的是，该可重复使用的结构中用于分离和浓缩再生细胞的方法不限于旋转离心，还可以包括其他任何离心，包括旋转薄膜过滤器。该可重复使用的结构也可以安装有所述的处理设备，其包括预编程的软件，用于执行几个不同组织处理过程和选择性地启动该系统的多个泵。该处理器也可以包括数据存储器，能够用于存储提供者/病人信息，处理或采集信息和其他用于之后下载或编辑的数据。该可重复使用的结构可以与多种一次性装置一同使用。该一次性装置与该可重复使用结构的连接是通过，例如一个对于该一次性设备的连锁配置或构造，以便该一次性设备安全地与可重复使用的金属结构相连，连接方式是存在于该可重复使用结构上的处理设备能够控制，即向该一次性装置的多个部件和该可重复使用结构的多个部件以及相关设备和系统发射和从其接收信号。

在一个实施方式中，该系统中使用的一个一次性设备包括，能够容纳约800mL组织的收集室20；一个能够处理由约800mL在收集室20中清洗和分解的组织产生的再生细胞组合物的处理室30；一个能够容纳至少0.5mL再生细胞的导出室50；一个能够容纳约10L废物的废物容器40。在该实施方式中，该金属设备不大于24″L×18″W×36″H。可以根据需要构建可选尺寸的一次性装置和金属设备的多个构造，并非限制性地包括在本发明的范围内。

该系统的一次性构造很容易安装在该设备上。被使用与相应可重复使用部件一同装配的一次性装置如图15A所示。该系统优选设计能够用来检测一个不正确安装的一次性组件。例如，每个一次性装置的组成可以具有颜色标记，来正确地将导管，室等排列和插入到系统的适当位置。在其他实施方式中，此处公开的系统是一个便携式部件。例如，该便携式部件可以能够从一个已经发生了脂肪组织收获的位置移走，到另一个位置用于脂肪组织的收获。在一些实施方式中，该便携式部件适合于在病人的床侧收获和处理脂肪组织。因此，一个便携式部件可以是一个能够从一个病人转移到另一个病人的系统的一部分。所以，该便携式部件可以是在固定于适当位置的轮子上，并因此在整个程序中，易于在方便的位置放置和在稳定可靠的位置使用。在其他实施方式中，该便携式部件被设计用来在一个平面，例如桌面上搭建和操作。该便携式部件也利用被密封在一个机架部件中。该便携式可以进一步包括吊架，吊钩，标签，标尺和其他有助于该程序的装置。所有上述的可重复使用的系统组件，例如离心机、处理设备、显示屏都可以组装在该便携式部件中。

用于得到再生细胞的其他手动实施方式也包括在本发明的范围内。例如，在一个实施方式中，可以使用上述任何该系统的组件，装备和/或增补物对脂肪组织进行处理。

本发明的系统的一个手动实施方式可以依据以下步骤和信息进行，其以实施例的方式提供但并不限于实施例。首先，从病人收集脂肪组织。打开组织重获线路或采样点连接物，将一根针插入600ml血袋的一个侧接口。通过钝套管，在10ml注射器中收集大约10ml脂肪组织。用一个相对尖的针头(14G)代替该钝套管。用碘酒擦拭采样点。通过采样点，脂肪组织被注射到600ml袋中。然后，该注射器和针头被弃于一个夏普室(sharps chamber)中。重复这些步骤以便将足够的组织房入该袋中。基于临床上的具体病人和应用，足够的组织是依情况而定的。

第二，清洗抽吸得到的脂肪组织。一个预温(37℃)的生理盐水袋被吊在作业面的上方。一个兰色止血钳夹子放在600ml袋和针之间的管道上。关闭该夹子密闭管道。600ml袋上的阵用于进入生理盐水袋(在该装置中，使用600ml袋上的针头用来通过橡胶隔膜进入生理盐水袋，针头插入前用碘酒擦拭该隔膜)。释放该兰色夹子，使大约150ml生理盐水能够进入600ml袋中。当期望体积的生理盐水已经进入600ml袋中时，关闭该兰色夹子。该600ml袋被倒转10-15次，经历约15秒。另一个兰色夹子被用于将3L废物袋至针的管道。3L袋上是针被用于进入600ml袋。该600ml袋被倒挂在作业面之上，并被允许放置约1分钟。释放导向3L袋的兰色夹子。使废物流能够流入该3L袋中。组织进入管道前，该兰色夹子用于停止该流动。重复这些步骤两次以上。如果生理盐水废液呈现显著的红色，则提示需要第三个循环。一个热封被用于蜜蜂3L废物袋和600ml袋之间的管道。该密封位于管道的大约中点处。该3L废物袋被移走并丢弃。该600ml袋返回作业面。

第三，经清洗的脂肪组织被分解。生理盐水和600ml袋之间的管道上的兰色夹子被释放，使大约150ml生理盐水能够进入该600ml袋中。用碘酒擦拭该600ml袋上的采样点。通过该采样点，向600ml袋中注射胶原蛋白酶。该胶原蛋白酶的制备是通过37℃水浴或类似方式溶解一瓶胶原蛋白，而不是使用微波。一个带有22G针头的1ml注射器被插入该瓶。胶原蛋白酶被吸如针头。移开针头，换上一个0.2μm的过滤器，和另一个22G针头。然后，从注射器中排出胶原蛋白酶，通过0.2μm过滤器和针头。以最终胶原蛋白浓度0.1-0.2Wiiusch单位/ml，进行脂肪组织的分解。将一个加热板放在摇杆上。在此期间，将仍被连接的生理盐水袋置于摇杆的一侧。注意保证通向生理盐水袋的管道处于这样一种状态，即运动时其不会接触摇杆。将加热板控制器设置为37℃。将600ml袋放在摇杆上。该摇杆调至最大。观测该袋以保证其稳定，并使其摇动大约1小时(55±10min)。

第四，重新获得再生细胞。从摇杆上移开袋。在原来通向废物袋的关闭的管道上使用一个兰色夹子。使用无菌连接的设备将方袋组(按照以下指示预先制备)连在原来与废物袋相连的管道上。所述的方袋组可以被认为是两个连接的方袋。确定该管道运送它进入两个包，管道本身回折并将一个金属环滑动在折叠的管道上(管道的两根上)。将该环向下滑动约0.5英寸。弯曲处形成的褶皱起到密闭管道的作用。用一个止血钳将该闭合的环部分弄皱。该环没有被弯皱得太紧，因为在处理期间需要除去该环。将600ml袋倒挂在作业面上方，并被允许放置约3分钟。释放导向方袋组的兰色夹子，将细胞部分(黄色/橙色脂肪层下的层)排到该方袋组中。注意防止脂肪层进入管道。在该处理期间，该管道可以被手动弄皱，以便当脂肪层接近管道时，减慢流动。然后，用兰色夹子关闭通向方袋组的管道，600ml袋返回作业面，并挂起生理盐水袋。生理盐水和600ml袋之间的管道上的兰色夹子被释放，使大约150ml生理盐水能够进入该600ml袋中。该600ml袋被倒转10-15次，经历约15秒。然后，将600ml袋倒挂在作业面上方，并被允许放置约3-5分钟。通向方袋组的管道上的兰色夹子被释放，使细胞部分(黄色/橙色脂肪层下的层)排到该方袋组中。注意防止脂肪层进入管道。例如，当脂肪层接近管道时，通过手动弄皱该管道而减慢流动。然后，用兰色夹子关闭通向方袋组的管道。然后，将由方袋组到600ml袋的管道热密封。然后，将600ml袋移开并丢弃。

第五.清洗再生细胞组合物。在两个充满物质的袋间的管道上放一个金属回形针，将方袋组放在天平上。向另一个虚拟的方袋组中加入水以平衡该方袋组。将该方袋组和平衡物放在离心机的对称的桶中。对于中空过滤器，该细胞被清洗并放在袋中，并且密封上述袋与中空过滤器之间的管道。使用蠕动泵，该流体通过过滤器，细胞浓缩液被收集在下游的袋中。注意保证方袋组不受压并方向向上。400xg离心10分钟。从离心机移除该方袋组，并放在血浆压榨器(plasma expressor)中。注意放置将该袋放置在血浆压榨器中的方式是，该袋顶部的硬管道正是在后板的顶部。如果该袋太高，则保留过多的生理盐水，如果过低，则该管道会干扰前板的关闭，而也保留过多的生理盐水。由充满的方袋组到空方袋组的每个线路上使用一个兰色夹子。移除该金属环和兰色夹子，使上清液能够流入空的方袋组。使尽量多的生理盐水被压榨掉，但注意不驱散细胞团块。通向每个含有上清液的袋的管道被热密封。移除含有上清液的废物袋。在通向每个含有细胞的方袋组的管道上使用兰色夹子。从血浆压榨器中取出这些袋。使用无菌连接设备将通向quad pack的管道与生理盐水袋连接起来。移除通向一个方袋组的兰色夹子，使大约150ml生理盐水流入该袋中，然后再次使用该夹子使生理盐水流停止。然后，将充满的方袋组倒转约10-15次，经历约15秒。然后，移去通向空方袋组的夹子，充满的袋中的全部内容物被排到空袋中。再次使用金属环密封两个方袋组之间的管道。然后，该管道被热密封，并移去生理盐水袋。然后，将充满的方袋组倒转约10-15次，经历约15秒。将另一个虚拟的方袋组放在天平上，与细胞方袋组平衡。将方袋组(一个满，一个空)放入离心机，保证方袋组不受压并方向向上。

400xg离心10分钟。从离心机移除该方袋组，并放在血浆压榨器中。注意放置将该袋放置在血浆压榨器中的方式是，该袋顶部的硬管道正是在后板的顶部。如果该袋太高，则保留过多的生理盐水，如果过低，则该管道会干扰前板的关闭，而也保留过多的生理盐水。移开金属环，使所有上清液从满袋流向空袋，注意不驱散再生细胞团块。将袋间的管道密封，移除满袋(废物)并丢弃。然后，将一个新的采样点连接器插入剩余的袋。然后，细胞团块的细胞被再次悬浮在残留的生理盐水中(即便要)，以得到一定浓度的再生细胞。该再悬浮可以通过袋的柔和操作(例如，挤压和摩擦)而完成。

本发明系统实施方式的一个特定实施例如图4所示。图4说明的是一个自动控制系统和用于从组织，例如脂肪组织中分离和浓缩再生细胞的方法，适合于病人体内的再灌注。在图4所示系统的一些实施方式中，该系统进一步包括用于从病人抽吸给定数量的组织的自动控制步骤。图4所示系统包括图13所示的一次性设备，其与图14所示的可重复使用的组件相连，以形成图15所示的自动控制系统的实施方式。该一次性装置与该可重复使用结构的连接是通过，例如一个对于该一次性设备的连锁配置或构造，以便该一次性设备安全地与可重复使用的金属结构相连，连接方式是存在于该可重复使用结构上的处理设备能够控制，即向该一次性装置的多个部件和该可重复使用结构的多个部件以及相关设备和系统发射和从其接收信号。

使用者可以将一次性装置与可重复使用的组件连接，使用使用者端口，输入一定的参数，例如被收集的组织的体积，使该系统与病人相连，则该系统可以使用预先编程和/或使用者输入的参数，以无间断的顺序自动完成图4所示的所有步骤。一个这样的顺序如图15B所示。或者，该组织可以被使用者手动地从病人体内抽取，并运送到用于处理的系统，即再生细胞的分离和浓缩。

具体地，如图4所示，可以使用导管12从病人体内抽出组织，例如脂肪组织，并导入收集室20。图4的收集室的详细的图如图5所示。如图5所示，收集室20可以包括一个真空线路11，其使用一个标准套管促进组织的移动。这时，使用者可以向收集室20加入估计体积的组织。该组织可以通过一个入口接口21被导入收集室20，该接口是密闭流体通路的一部分，其允许组织，生理盐水和其他试剂已无菌的方式被加入到该组织。该系统的一个光学传感器，例如传感器29能够检测什么时间使用者输入体积的组织存在于收集室20中。在一些实施方式中，如果收集室中存在的组织少于使用者的输入，则使用者可以选择开始处理收集室20中存在的组织。在一些实施方式中，通过使用一个泵，例如蠕动泵，可以将从病人体内取出的组织的一部分经导管导入样品室60，该导管可以由使用者利用使用者端口的输入而被激活。

传感器29能够向可重复使用的组件中存在的处理设备传递信号，激活清洗和分解组织所需的步骤。例如，处理设备可以基于所收集组织的体积，使用自动控制的阀门和泵引入预设体积的清洗试剂。该循环可以在收集室中反复，直至光学传感器确定流出的液体足够清澈且没有多余物质。例如，沿着从收集室12b或12d导出的导管的光学传感器29能够检测到多余物质已经被清除，并且能够向处理设备发出信号关闭所需的阀门，开始下一步骤。

接着，处理设备可以基于所收集组织的体积，引入预先设定数量的分解剂。该处理设备还可以基于所收集组织的初始体积或基于使用者的输入，启动收集室中的组织的搅拌。在图4所示的实施方式中，一旦分解剂，例如胶原蛋白酶经胶原蛋白酶源24而被加入到收集室20中，则收集室中的发动机就由处理室启动。该发动机带动可旋转的轴25，其包括一个磁力搅拌器和一个桨状装置，其中一个以上的桨25a牢固地系在预先安装于收集室28的过滤器的过滤网27上。这些桨在分解剂的存在下搅动，以便再生细胞从组织中分离出来。

收集室20中的溶液可以静置预先设定的一段时间。溶液中易浮起部分可以上升到溶液的顶部。一旦预设的这段时间结束，必需的阀门和泵就被处理设备激活，将不易浮起的部分排入废物室40。向废物室的这一转运一直持续，直到沿着从收集室12b或12d导出的导管的光学传感器29能够检测到溶液中易浮起的部分将被转运到废物室30中。例如，沿着从收集室12b或12d导出的导管的光学传感器29能够检测到多余物质已经被清除，并且能够向处理设备发出信号关闭所需的阀门。

这时，溶液不易浮起的部分，即再生细胞组合物被转移到处理室30。这是通过使用必要的阀门和蠕动泵完成的。在一些实施方式中，在再生细胞组合物转移到处理室30之前，可以向残留在收集室20中的溶液易浮起部分加入额外体积的生理盐水。另一个清洗循环可以被重复。该循环结束后，该溶液可以被静置，不易浮起部分(含有再生细胞)被运送到处理室30，而易浮起部分被排入废物室40。利用额外的清洗循环，使被分离的再生细胞向处理室30的转移最优化。

一旦再生细胞组合物经导管12被运送到处理室30，则在浓缩阶段开始前，该组合物可能经历一个以上的额外的清洗步骤。这保证来自收集室20的废物和残留的杂质能够被清除。相似地，接下来的浓缩步骤中，再生细胞组合物可能经历一个以上额外的清洗步骤，来清除残留的杂质。以同样的方式，即如上所述，处理设备发出信号对阀门和泵的控制，多余的物质可以被从处理室30移出到废物室40。

以下对图4所示的处理室30的多个实施方式进行具体说明。图4所示的处理室30是离心室的形式。图4的处理室的详细图示如图7和8。这样的处理室30通常包括一个包括一个外部机架30.2的旋转式密封网30.1，一个以上密封条30.3，一个以上轴承30.4，和一个连接点30.6，其用于连接处理室和系统的可重复使用组件中的离心设备；一个以上流路30.5，其为起于旋转密封终于离心室的导管形式，其导出室50形式的每一端都被收纳在框架53中，其中该框架包括一个以上接口52和一个以上用于手动重新配置导出室50的操纵杆。

包括旋转密封网30.1用来保证处理室的流路能够维持在无菌状态。另外，可以在任何时候以无菌的方式进入处理室的流路(例如，加入试剂或洗液)，甚至在处理室的离心室正在旋转时也可以。

图7和8所示的旋转密封网包括一个旋转轴，其包括两个以上轴承30.4，三个以上密封条，和外部机架30.2。在该实施方式中，轴承30.4进一步包括一个外轴和内轴(没有表示)，这里被称为沟槽(race)。这些购藏可以被精确研磨的球分开。包括沟槽和球的轴承优选由适于与体液接触的材料制成，或涂有适于与体液接触的材料。

在一个优选的实施方式中，沟槽和球是使用例如，氮化硅酮(siliconenitride)或氧化锆制成的。而且，在该实施方式中，三个密封条包括一个环形的″U″形沟(没有表示)和一个环形的弯曲(没有表示)。该环形的″U″形沟优选使用柔软的材料制成，以便于形成与旋转密封网的旋转轴的防渗漏连接。另外，该密封条优选的导向方式为，流过该处理室的再生细胞组合物的压力引起密封装置借助加大的压力加紧其与旋转轴的连接。可以利用一个以上圆形回形针(没有表示)保证该密封在适当的位置，该回形针能够根据需要张开或折叠而使沟槽咬合在旋转密封网30.1的外部机架30.2中。必须控制在旋转密封网30.1处或其附近产生的热，以防止通过该通路移动的溶液中细胞的溶解。例如，这可以通过选择一种用于构建旋转轴的硬质材料，打磨与密封条接触的转轴区域，并尽量减少转轴和密封条之间的接触而实现。

在另一个实施方式中，该旋转密封网30.1包括一个单独的橡胶密封圈30.3和一个气垫圈(没有表示)。该密封圈和气垫圈为任何可能危及系统无菌状态的生物物质提供了弯曲的路径。在另一个实施方式中，旋转密封网30.1包括多个装有弹簧的密封条30.3，其使每个流路相隔离。密封条30.3由能够被消毒并且不使用润滑剂密封转轴的材料制成。在另一个实施方式中，旋转密封网30.1包括一对陶瓷圆片(没有表示)，其产生不同的流路并能够承受系统旋转而不导致细胞溶解。在另一个实施方式中，该流路是柔软的，并能够根据处理室而卷曲或不卷曲。这是通过每隔处理室30的两个螺旋使柔软的流路旋转一次来完成的。这消除了对于旋转密封条的需要。

再生细胞组合物从收集室20沿流路，经旋转密封网30.1的转轴被抽出，然后分成最少两个流路30.5，每个流路由处理室30的中轴向外辐射并终止于处理室30外侧端附近，即在收纳了导出室50的离心室内(图7和8)。所以，在优选实施方式中，处理室30包括两个以上如图7和8所示的导出室50。安放这些导出室50使其在处理期间是一个方向30.7，而在浓缩的再生细胞的再回收时是另一个方向。例如，导出变化是处理期间倾斜为一个角度，而细胞再获取时是另一个角度。细胞再获取的角度比处理的角度更接近垂直。可以通过突出处理室30的操纵杆53手动控制导出室50的两个位置。当它们在再获取的方向30.8时，可以手动地从导出室50中重新获得再生细胞。在另一个实施方式中，构建流路30.5使其分离出处理室，并与处理室30的外侧端相连，即在收纳了导出室50的离心室中(没有表示)。在该实施方式中，大体积的再生细胞组合物和/或添加剂、溶液等可以被直接转移到离心室和/或到处室。

关于图4和7-9，收集室20和处理室30之间，可以提供一个泵34和一个以上阀门14。在一个优选的实施方式中，阀门14为电动阀门。另外，传感器，如压力传感器29，其与处理室30和收集室20线形排列。阀门、泵和传感器与可重复使用的组件上的处理设备(图14)一同作用自动控制系统的浓缩步骤。

传感器检测离心室中再生细胞组合物的存在，并通过与系统的处理设备的信息交换而启动离心设备。然后，基于初始收集的组织的数量和/或使用者的输入，该再生细胞组合物在预先编程的时间内，经历预编程的负载。在一些实施方式中，该步骤可以自动或借助使用者的输入而被重复。例如，该组合物在约5分钟的时间内，经历约为重力的400倍的力的负载。建造导出室50使该室的外端形成一个浓重的微粒和细胞用的小蓄积池。该导出室50保留浓重的微粒，该微粒被称为“细胞团块”的术语，而使得轻的上清液通过流路被转移，例如通过沿着旋转密封网30.1的旋转轴的流路和从处理室30中央低处经旋转密封网30.1到废物室40的路径。阀门14和泵34向处理设备发出信号，启动将上清液转移到废物容器40的步骤，而不干扰导出室50中的细胞团块。

使用图4所示的系统得到的细胞团块包括浓缩的再生细胞。在一些实施方式中，上清液被转移并导向废物室40后，流路30.5可以被用来使细胞团块再悬浮，该细胞团块是与额外的溶液和/或其他添加剂一起离心得到的。细胞团块以此方式的再悬浮允许进一步清洗再生细胞来除去多余的蛋白质和化合物以及提高流向细胞的氧气。得到的悬浮液可以经历另一次为重力的400倍的力的负载，时间大约5分钟。另一个细胞团块形成后，得到的上清液被转移到废物室40，可以用生理盐水或其他一些适宜的缓冲液，以上述方式进行最终清洗。可以进行反复的清洗来提高再生细胞溶液的纯度。在一些实施方式中，可以根据需要加入生理盐水来加强处理。使用图4所示的系统得到的再生细胞的浓度可以根据所收集组织的数量、病人年龄、病人体型等而变化。表1提供了例示的收率。

然后，在导出室50被安放在适于细胞清除的方向后，可以使用适宜的注射器重新得到导出室中最终的团块。在其他实施方式中，最终的团块可以被自动转移到导出室50的容器中，其可以根据需要转移并储存或使用。该容器可以是任何适宜的形式或尺寸。例如，该容器可以是注射器。在一些实施方式中，导出室50本身可以被热封闭(自动或手动)，并与处理室的其他组件隔离，这些组件用于随后的重获取和再生细胞在如上所述包括再灌注给病人的治疗用途。这些细胞还可能在从导出室重新获取前或转移到另一个系统或设备后，接受进一步处理。建造图14所示的可以重复使用的组件，使其可以根据需要与一个以上用于进一步处理的额外系统或设备相连。

如上所述，使用本发明的系统和方法得到的再生细胞，基于其如实施例所述的特性，可以用于伤口愈合。例如，再生细胞能够表达血管生长因子和细胞因子，分泌与伤口愈合有关的细胞因子，体外分泌胶原蛋白，和促进体内伤口愈合。所以，本发明的一个方面为，使用本发明的系统和方法从提供者的脂肪组织提取再生细胞，并通过一种以上此处所述的机制使伤口愈合。在一个优选的实施方式中，该细胞从一个人的脂肪组织提取，又灌注回这个人，因而减少了潜在的与对植入物的抗原和/或免疫反应有关的并发症。典型地，病人受到评测来评定伤口愈合紊乱，例如体检和病人的病史。

在一个优选实施方式中，在病人接受任何意图减少凝血的产物前，进行收获步骤。但是，在一些实施方式中，在收获步骤前病人可能已经服用了阿斯匹林。另外，一个优选的方法包括，在尝试任何步骤前收集脂肪组织。但是，本领域技术人员应该理解的是，收集时间被期望改变并依赖于若干因素，包括与其他物质的联合，病人的稳定性，病人的凝血特征，供应者的可用性，和质量管理标准。最终，收集时间将由负责对患者给药的从业者确定。

从病人收集的脂肪组织的体积可以从约0cc到约2000cc变化，并在一些实施方式中最多达3000cc。被取出的脂肪的体积根据病人而有所不同，并且依赖于多个因素，包括但不限于例如体质，凝血特征，血液动力学稳定性，疾病的严重程度，共病，和医生的倾向。

细胞可以被施加给处于任何发生异常伤口愈合情况下的病人。该细胞抗原提前提取并以低温方式储藏，或者它们可以在需要或即将需要时被提取。如上所述，这些细胞可以被施加给病人，或者直接用于损伤组织、或接近损伤组织的部位，而没有进一步处理或随后的额外步骤来进一步纯化、修饰、刺激或改变细胞。例如，从病人获得的细胞可以根据需要被施加给病人，而在将它们施加给病人前不进行细胞培养。在一个实施方式中，脂肪组织的收集将在病人的床边进行。可以使用血液动力学监测仪监测病人的临床状况。

根据本发明，再生细胞可以在收获来自病人的脂肪组织后不久被施加给病人。例如，细胞可以在处理脂肪组织得到再生细胞组合物后立即施加给病人。在一个实施方式中，如果被再灌注给病人的细胞经历额外的修饰，纯化，刺激或上述的其他处理的话，则可能变化。而且，再生细胞可以多次给药。例如，细胞可以在一段长时间内连续给药(例如，小时)，或者可以在一段长时间内多剂量注射给药。在一些实施方式中，在约12小时内，如6小时进行初始给药，并且每隔12小时施加一个以上剂量的细胞。

被施加给病人的细胞数量可能与例如脂肪组织处理后的收率有关。细胞总数的一部分可以留待后用或低温保存。另外，给药剂量将依赖于细胞的给药途径。

细胞还可以与添加剂一同使用，来加强，控制指导意图的治疗效果。例如，在一个实施方式中，如这里所述，可以使用抗体介导的阳性或阴性细胞选择来对细胞进一步纯化，来浓缩富细胞群以提高疗效，减少发病率，或促进该步骤的简易性。类似地，细胞可以与生物适应性基质一同使用，该基质通过支持和/或指导植入细胞的命运，而帮助管理体内组织。以相同的方式，细胞可以在基因处理后被施加，以便它们表达被认为或意图促进细胞提供的治疗效果的基因产物。处理的例子包括控制(增加或减少)促进血管形成或动脉形成的因子(例如VEGF)的表达。如上所述被植入前，该细胞还可以经历在一种支架材料上的细胞培养。在一个实施方式中，优选细胞被直接施加给预期产生疗效的部位。这可以通过静脉注射而实现。本领域技术人员一直的给药途径包括但不限于，皮下，真皮或肌肉内，并且可以包括或不包括基于导管的给药机制。则细胞可以通过缓慢输液或交错的一系列应用进行单剂量注射，如果细胞被适当保存几天或几周，该系列应用可以被数小时间隔开。在一个实施方式中，给药途径将包括通过标准外周静脉导管或中央静脉导管的静脉给药。通过被放置在病人体脉管系统内的末梢或近中央的气囊的连续膨胀/收缩，可以控制细胞流，从而产生促进细胞灌输或细胞治疗活动的暂时的无流动区域。在另一个实施方式中，细胞在被施加给病人之前可以在人造或天然的培养基或组织支架中再悬浮。系统治疗涉及向血管系统的注射。

被处理的抽吸脂肪的一部分在被施加给病人前，可用被储存。对于短期储存(少于6小时)，细胞可以在室温或低于室温下储存于密闭容器中，有或没有营养液的供给。中期储存(少于48小时)优选于2-8℃的等渗缓冲液(例如Plasmalyte

)的容器中进行，该容器由防止细胞粘连的材料过程或涂敷有该材料。更长时间储存优选在适当的低温冷藏和促进细胞功能的保留的条件下进行，如2002年9月13日提出的PCT申请PCT/US02/29207和2001年9月14日提出的美国临时申请60/322,070中所公开的，因而在此引用了两者的内容。

根据本发明的一个方面，被施加给病人的脂肪组织来源的细胞可以用作生长因子给药的媒介。例如，通过使细胞表达一种以上适于促进伤口愈合的生长因子，该细胞可以被施加给病人并释放一种以上的生长因子。该释放可以收到控制的方式长期提供。例如，该释放可以被控制，以便生长因子可以以脉冲或定期的方式释放，从而在接近受损组织的部位，局部增加生长因子和/或局部减少生长因子的数量。被施加给病人的细胞不仅帮助受损或不健康组织恢复功能，而且能够促进受损组织的重建。细胞给药可以发生在但不限于以下地点：门诊，门诊处，急诊处，医院病房，保健护理单位，手术室，心肺功能室，放射室。该程序后几天到几周的疗程后，细胞治疗的效果显著。但是，早在该程序后的几小时就观察到有益效果，并且可以持续几年。典型地，在细胞传递之前或期间，病人被监测。监测程序包括但不限于：凝结研究，氧饱和度和血液动力学监测。细胞传递后，病人可年需要大约24小时的不良反应监测。

提供以下的例子说明应用该技术的特定情况和背景，但不限制本公开中包括的发明和权力要求的范围，

实施例

下述实施例所使用的ADC或再生细胞可以通过本公开和以下文献中公开的方法获得：美国申请No.10/316,127，题目SYSTEMS AND METHODSFOR TREATING PATIENTS WITH PROCESSED LIPOASPIRATE CELLS，2002年12月9日提出，其要求2001年12月7日提出的美国临时申请No.60/338,856的优先权；以及美国申请No._____，题目SYSTEMS ANDMETHODS FOR SEPARATING AND CONCENTRATING REGENERATIVECELLS FROM TISSUE，2004年6月25日提出，其要求2002年12月9日提出的美国申请No.10/316,127的优先权，题目SYSTEMS AND METHODSFOR TREATING PATIENTS WITH PROCESSED LIPOASPIRATE CELLS，的优先权，它们均被共同转让并全部被在此清楚地引用。

实施例1：借助再生细胞，血管生长因子，VEGF的表达

血管内皮生长因子(VEGF)是心血管形成的关键调节剂之一(Nagy等人，2003；Folkman，1995)。胎盘生长因子，VEGF家族的另一个成员，在血管形成和动脉形成中都表现出类似作用。具体地，将野生型(PIGF+/+)细胞移植到PIGF基因敲除小鼠中，使引起后肢缺血快速复原的能力恢复(Scholz等人，2003)。

已知血管形成和动脉形成对于血管再形成的重要性，利用ELISA分析仪(R&D Systems，Minneapolis，MN)，使用来自三个提供者的脂肪来源的再生细胞，对借助本发明再生细胞的PIGF和VEGF表达进行了检测。一个提供者具有高血糖症和2型糖尿病(与微血管和大血管疾病高度相关的病症)。将来自每个提供者的再生细胞接种在补充10％FCS和5％HS的DMEM/F-12培养基中，并生长至融合。取出上清液，分析PIGF和VEGF蛋白的表达。如图16A和16B所示，结果显示，VEGF(图16A)和PIGF(图16B)均被本发明的脂肪来源的再生细胞充分表达。

在一项独立的研究中，对来自正常成年小鼠的再生细胞培养后分泌的与血管形成有关的细胞因子的相对数量进行了测量。

该再生细胞在具有13％PBS的α-MEM中培养至细胞融合后5天，这时，收获培养基并利用抗体阵列分析(antibody array analysis)(RayBio小鼠细胞因子抗体阵列II(RayBiotech，Inc.))进行评估。检测以下与血管形成有关的生长因子：血管内皮生长因子(VEGF)，bFGF，IGF-II，嗜酸粒细胞趋化因子，G-CSF，GM-CSF.IL-12 p40/p70，IL-12 p70，IL-13，IL-6，IL-9，Leptin，MCP-1，M-CSF，MIG，PF-4，TIMP-1，TIMP-2，TNF-α和血小板生成素。与具有10％PBS的空白培养基相比，以下与血管形成有关的生长因子或细胞因子至少增加两倍：血管内皮生长因子(VEGF)，嗜酸粒细胞趋化因子，G-CSF，IL-6，MCP-1和PF-4。

这些数据表明，本发明的再生细胞表达大量血管和动脉的生长因子。而且，发现糖尿病人对VEGF和PIGF的表达与正常人水平相当，这表示糖尿病人可以是利用自体同源脂肪来源的再生细胞的血管形成治疗的对象。

实施例2：再生细胞包括参与血管形成的细胞群

已知内皮细胞及其前体，内皮祖细胞(EPC)参与血管形成。为了确定EPC是否存在于脂肪来源的再生细胞中，对于人脂肪来源的再生细胞的EPC细胞表面标记物，例如CD-34进行了评价。

通过人皮下脂肪组织的酶降解分离得到ADC。在含有0.2％胎牛血清(FBS)的磷酸盐缓冲液中对ADC(100μl)进行孵育，使用荧光标记的抗体于4℃孵育20到30分钟，该抗体针对人内皮标记物CD31(分化的内皮细胞标记物)和CD34(EPC标记物)以及在多能细胞上选择性表达的人ABCG2(ATP结合框转运子)。清洗后，用FACSAria Sorter(Beckton Dickenson-Inununocytometry)对细胞进行分析。然后，使用FACSDiva软件(BD-Inmmunocytometry，CA)进行数据采集和分析。结果(没有表示)表示，来自健康成人的脂肪来源的再生细胞表达了EPC标记物CD-34和ABCG2，但没有表达内皮细胞标记物CD-31。在来自有糖尿病史的提供者的再生细胞中，表达EPC标记物CD-34和ABCG2的细胞被以相似的频率检测到。

为了确定人脂肪来源的再生细胞在内皮细胞分化培养基中培养后的EPC频率，将再生细胞接种在纤连蛋白覆盖的板上，并在内皮细胞培养基中培养3天，移除成熟的内皮细胞。非黏附细胞被移除并再次接种。14天后，通过使用偶联FITC的Ulex europaeus凝集素-1(Vector Labs，Burlingame，CA)和Dil标记的乙酰化LDL(Molecular Probes，Eugene，OR)进行菌落鉴定。如图17所示，结果表示约500EPC/106ADC细胞的EPC频率。

脂肪组织来源的再生细胞中EPC的存在表明，这些细胞能够直接参与新血管的发育并增强血管形成和再灌注。

实施例3：再生细胞中的血管结构的体外发育

用于血管形成的技术认可的分析法为，其中成纤维细胞给料层上生长的内皮细胞发育成一个CD31-阳性的新生毛细管网络的管状再生物(reminiscent)的复杂网络(Donovan等人，2001)。由于脂肪来源的再生细胞包括内皮细胞、EPC和其他基质细胞前体，因此我们检测了这些再生细胞在缺少给料层时形成毛细管样结构的能力。从正常小鼠腹股沟脂肪层得到的再生细胞在培养2周后，发育成毛细管网(图18A)。特别地，来自链脲霉素(STZ)诱发的1型糖尿病的高血糖小鼠的再生细胞，在给予STZ 8周后形成的毛细管网与正常小鼠细胞相同(图18B)。

在后来的研究中，脂肪来源的再生细胞被培养在完整的培养基(供以10％FCS的MEM培养基)中并且没有额外的生长因子。

这些再生细胞也形成了毛细管网。而且，对于内皮细胞标记物CD31，CD34，VE-钙粘蛋白和von Willebrand因子/因子VIII，而非pan-淋巴细胞标记物，CD45，血管结构形成了阳性染色。

为了比较年轻和年老小鼠的再生细胞形成毛细管网的能力，来自年轻小鼠和年老小鼠(年龄1，12或18个月)的再生细胞被培养在完整的培养基(供以10％FCS的MEM培养基)且没有额外的生长因子，培养2周。在全部提供者的再生细胞的培养中观察到相同的毛细管样网络(没有表示)。

上述数据表明，来自正常和糖尿病，以及年轻和年老病人的脂肪来源的再生细胞能够形成与初生的毛细管网相同的血管结构。所以，本发明的再生细胞可以用于治疗血管形成不足。

实施例4：再生细胞中的血管结构的体内发育

如果细胞没有发挥体内血管形成活性，则体外血管形成潜力，有前景，但几乎没有价值。外科手术诱发后肢缺血是一种能够鉴定特定治疗的血管形成潜力的体内模型。该模型在免疫缺陷小鼠中开发，其中可以观察人细胞推动再灌注的能力。如下所述确定两个后肢的手术前血流值。用4-0丝绷带系住麻醉小鼠的血管的如下部位：1)回肠动脉分支处，2)深股动脉源头的末梢，3)浅股动脉分支处。结扎后，将血管全部切除。伤口愈合前，能粗略看到的股动脉的间接分支也被结扎。24小时后，通过尾部注射，向129S小鼠注射5x106同系小鼠的脂肪来源的再生细胞，向NOD SCID小鼠注射人脂肪来源的再生细胞。手术后即刻和下述处理之间，使用Laser Doppler Flow Imager(Moor Instruments Inc.，Wilmington，DE)反映流动。每周三次，测量24天，将该测量相对于手术前该肢体的值进行标准化，并相对于对照(未手术)肢体提出。

后肢缺血模型对于所用小鼠的染色非常灵敏。NOD SCID小鼠为免疫缺陷动物，缺少激起急性炎症反应的能力。对于这些小鼠，该外科方法引起严重缺血，以致于三分之二的未经处理的动物失去了大腿切除点以下的后肢部分。非细胞处理的动物失去了脚趾以上的全部结构。对于免疫活性的129S小鼠，非细胞处理的动物失去了趾骨以上的全部部分，并表现出内源性的部分再生再灌注的能力。这可能是缘于与急性炎症反应有关的自发的血管形成。这可以解释为什么经处理的动物与不同损伤变形的对照动物比较时，再灌注很少是过激的。

但是，结果显示，用脂肪来源的再生细胞处理的小鼠，与未处理的小鼠比较表现出明显改善的再灌注。到12天，与未处理的小鼠的10±10％相比，用人再生细胞处理的NOD-SCID小鼠血流恢复到50±11％。类似地，与未处理的小鼠的56±4％相比，免疫活性的129S小鼠在14天表现出80±12％的恢复。另外，小鼠解剖揭示了用再生细胞处理的小鼠后肢中间接血管的出现，但在未处理小鼠或任意小鼠的健康后肢中没有出现。

实施例5：增加ADC剂量与移植存活率和血管形成有关

自体脂肪组织的移植在整形和改造的外科手术中是普遍使用的方法(Fulton，1998；Shiffinan.2001)。但是，由于脂肪组织片段移植而没有血管宫养，结果移植存活率依赖于新血管的形成(Coleman，1995；Eppley等人，1990)，因此该方法受到限制。因此，在有限的方式中，该移植组织表现为缺血组织。

进行了Fisher大鼠的研究，其中，脂肪组织片段被移植到大腿外侧肌肉的皮下空间。右腿移植了0.2g单独的脂肪组织片段，左腿移植了0.2g脂肪组织片段并额外添加了3种不同剂量的脂肪来源的干细胞(1.7x105-1.3x106细胞/移植；每个剂量3只动物)；以此方式，对侧的腿作为对照。然后，供养1个月后，无痛处死并重新获得移植物，称重，固定在福尔马林中并以石蜡包裹待组织学分析。

如图9A所示，结果表示对照腿中移植组织的保持最小，且被处理的腿中的移植组织的保持为剂量依赖性增加。进一步，该移植的免疫组织化学分析表示出，脂肪来源的干细胞处理的移植中的大量的新血管形成和再灌注(Figure 20B，箭头)。这也与脂肪组织形态学的保持有关(图20B)。

所以，实施例1-5说明，本发明的脂肪来源的再生细胞分泌血管和动脉生长因子；在体内形成初生毛细管网；提高脂肪移植的存活率；增强了缺血再灌注。因此，本发明的再生细胞能够促进血管形成和动脉形成，并且可以用于治疗具有基本循环不足的多种疾病。

实施例6：再生细胞在体外分泌与伤口愈合有关的细胞因子

趋化因子在皮肤伤口愈合中发挥作用。白细胞亚型的补充受到趋化因子的调节。而且，这些趋化因子也有助于表皮再生，组织改造和血管形成的调节。

所以，对由培养的来自正常成年小鼠的ADC分泌的细胞因子的相对数量进行测量。ADC在有10％FBS的α-MEM中培养到细胞融合后5天这时，收获该细胞培养基，并利用抗体阵列分析(RayBio小鼠细胞因子抗体阵列II(RayBiotech，Inc.))进行评估。

结果(见表A)表明，为了补充嗜中性粒细胞，巨噬细胞，肥大细胞和淋巴细胞，再生细胞在体外分泌生长因子和细胞因子，其有助于伤口愈合过程中的表皮的再形成。具体地，再生细胞分泌有补充巨噬细胞功能的MIP-1α，RANTES和MCP-1；有补充单核细胞和肥大细胞功能的MCP-1；有伤口修复和表皮再生功能的MIP-2和KC；金属蛋白-1组织抑制剂TIMP，它能够逆转慢性伤口中的不平衡的金属蛋白，以帮助愈合。

巨噬细胞和淋巴细胞都产生调节和生长促进因子。另外，肥大细胞释放11-4，其可以刺激成纤维细胞的活性。

表A

	平均值	标准偏差
			IL-4	316.95	38.9
IL-6	12546.2	339.8
			人淋巴细胞趋化因子	673.2	6.7
KC	1154.2	65.4
			LIX	1825	183.8
MCP-1	17259.4	1381.7
			MCP-5	1638.2	6
MIP-ly	6632.4	84.1
			RANTES	401.7	8.1
SDF-1a	950.7	53.4
			TIMP-1	1485.2	234.4

实施例7：再生细胞在体外分泌胶原蛋白

在三种不同培养基即DMEM，McCoy′s 5A和AMEM中，再生细胞与来自Rosa小鼠的新生小鼠成纤维细胞结合。每周换两次培养基，培养2周。该培养基在第三周不更换。

所有培养基被收集并按照标准方法进行胶原蛋白的分析。简言之，100μl上清液+100μl 6N HCI，于100℃孵育16小时，冷却并与氯胺和二甲氨基苯甲醛试剂反应，然后于550nm处检测OD。

在ADC和成纤维细胞之间没有发现胶原蛋白分泌的明显差别，而是发现了不同培养基之间的差别。具体地，在McCoy′s5A培养基中，ADC和成纤维细胞都分泌出多于DMEM或AMEM中的胶原蛋白(p＜0.05)。见图21。

实施例8：再生细胞加速STZ处理的糖尿病小鼠的伤口愈合

为了确定脂肪来源的再生细胞是否能够促进体内伤口愈合，对10只小鼠进行STZ处理7周。处理后，通过打孔组织切片制造双边8mm厚的伤口。然后，通过每个伤口局部直接注射IXIOE6(来自lacZ提供者)5ml，对5只小鼠进行ADC处理，另外5只小鼠用生理盐水处理作为对照。在10天，两组的伤口尺寸出现显著差别(p＝0.002，n＝10伤口，5只小鼠)。见图22。这些结果说明，脂肪来源的再生细胞有助于小鼠的伤口愈合。

另外，为了证明伤口中提供者来源的细胞的移植(engaftment)，在伤口上进行β-半乳糖酶染色。结果(没有表示)证明，提供者ADCβ-半乳糖染色阳性细胞能够定位在注射部位周围，毛细管附近并接近伤口。

实施例9：再生细胞加速有创伤小鼠的毛发再生

用STZ处理10只小鼠7周。用毛发去除剂处理后，通过打孔组织切片制造双边8mm厚的伤口。然后，通过每个伤口局部直接注射IXIOE6(来自lacZ提供者)5ml，对5只小鼠进行ADC处理，另外5只小鼠用生理盐水处理作为对照。对8只正常的B6C57129Fl小鼠进行相同处理，4只用ADC局部处理，另4只用生理盐水处理作为对照。在14天，测量两个实验组的伤口尺寸，造影记录毛发恢复速度。结果(没有表示)证明，脂肪来源的再生细胞不仅有助于小鼠伤口愈合，而且明显加快了毛发生长速度(p＜0.05)。进行的组织学分析显示，来自提供者的脂肪来源的再生细胞在毛囊周围。因此，ADC对正常毛发的修复是有效的，同时促进伤口愈合。

以上引用了大量公开和专利。所引用的每个公开和专利都包括了其全部内容。

等同物

仅使用常识，本领域技术人员将认识到或能够得知很多本发明所述的具体实施方式的等同物。这样的等同物也包括在下述权利要求的范围内。

Claims (13)

1.包含浓缩的脂肪来源的再生细胞群的组合物在制备用于在伤口部位促进上皮形成的药物中的应用，其中，在被配置为维持密闭、无菌的流体/组织路径中分离所述浓缩的脂肪来源的再生细胞群。

2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述药物的制备无需培养所述浓缩的脂肪来源的再生细胞群。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其中，所述脂肪来源的再生细胞群包含脂肪来源的干细胞。

4.根据前述任意一项权利要求所述的应用，其中，所述脂肪来源的再生细胞群包含祖细胞。

5.根据前述任意一项权利要求所述的应用，其中，所述药物还包括添加剂。

6.根据前述任意一项权利要求所述的应用，其中，所述药物在伤口部位促进毛发生长。

7.根据前述任意一项权利要求所述的应用，其中，所述药物被配制用于一团导入。

8.根据前述任意一项权利要求所述的应用，其中，制备所述药物用于皮下、真皮、肌肉内或血管内给药。

9.根据前述任意一项权利要求所述的应用，其中，由得自被给予药物的相同受试者的浓缩的脂肪来源的再生细胞群制备所述药物。

10.根据前述任意一项权利要求所述的应用，其中，所述药物提供每毫升1×10⁵～1×10⁷个脂肪来源的再生细胞的最小浓度。

11.根据前述任意一项权利要求所述的应用，其中，所述伤口选自由下列所组成的组：手术后的皮肤伤口、机械性外伤引起的皮肤擦伤、苛性剂引起的皮肤擦伤、烧伤、角膜擦伤、感染或药物治疗后的粘膜上皮的伤口、糖尿病伤口、移植后的皮肤伤口、缺血性溃疡伤口、糖尿病伤口和外伤性伤口。

12.根据前述任意一项权利要求所述的应用，其中，所述药物促进新皮形成。

13.包含浓缩的脂肪来源的再生细胞群的组合物在制备用于加速毛发再生或修复毛发的药物中的应用，其中，在被配置为维持密闭、无菌的流体/组织路径中分离所述浓缩的脂肪来源的再生细胞群。

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