CN102203277A

CN102203277A - 微流装置筛选方法

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Publication number: CN102203277A
Application number: CN200980141800.2A
Authority: CN
Inventors: 托马斯.伦哈德; 马兹.E.比约恩瓦德; 波尔.E.佩德森
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2008-08-21
Filing date: 2009-08-14
Publication date: 2011-09-28
Anticipated expiration: 2029-08-14
Also published as: US8871441B2; EP2315841A1; WO2010020589A1; CN102203277B; US20110159511A1; DK2315841T3; EP2315841B1

Abstract

本发明涉及在微流装置中就感兴趣的特性筛选微生物宿主细胞的方法，所述方法包括下述步骤：a)用包含下述的多核苷酸构建体转化D-丙氨酸消旋酶缺陷的微生物宿主细胞：i)一个或多个多核苷酸区，当其存在于宿主细胞时，提供所述感兴趣的特性，和ii)至少一个多核苷酸区，当其存在于宿主细胞时，补足所述D-丙氨酸消旋酶缺陷；和b)在不存在外源提供的D-丙氨酸的情况下，在微流装置中就所述感兴趣的特性筛选所述转化的宿主细胞。

Description

微流装置筛选方法

技术领域

本发明涉及在微流装置(microfluidic device)中就感兴趣的特性筛选微生物宿主细胞的方法，所述方法包括下述步骤：

a)用包含下述的多核苷酸构建体转化D-丙氨酸消旋酶缺陷的微生物宿主细胞：

i)一个或多个多核苷酸区，当其存在于宿主细胞时，提供所述感兴趣的特性，和

ii)至少一个多核苷酸区，当其存在于宿主细胞时，补足(complement)所述D-丙氨酸消旋酶缺陷；和

b)在不存在外源提供的D-丙氨酸的情况下，在微流装置中就所述感兴趣的特性筛选所述转化的宿主细胞。

背景技术

微流技术，即在可丢弃的芯片之上或之中用于生物化学分析的纳升至皮升大小的小滴，随着证明小通道网络(network of small channels)为精确操纵上述少量流体的灵活平台而变得越来越流行。

一种操作微流试剂的方式是通过在不混溶、惰性的载流体(carrier fluid)中产生水性小滴，如WO 2007081385、WO 2007081386、WO 2007081387、WO 2007133710和WO 2008063227(Raindance Technologies Inc)中公开的。这些悬浮的小滴提供了完善限定的(well defined)、包封(encapsulated)的微环境，其消除了交叉污染，并允许试剂的连续循环。其可用于分离反应性材料、细胞、蛋白质或小颗粒以供进一步操纵和研究，且可从小滴群中选择性去除和收集具有特定特性的小滴。

对于使用蛋白质细胞表达的微生物应用，可将小滴大小调为含有一个细胞，且同时使胞外体积变为最小，导致蛋白质的高胞外浓度，并因此导致快速和敏感的测定。这些小滴可用于富集文库成员，并可对其进行二次发掘以优化广泛范围的蛋白质特征。超高通量筛选(ultra-high throughput screening)合并了前筛选技术(pre-screening techniques)的使用和计算搜索方法以最大程度进行文库分析，导致对非常广大的蛋白质序列空间的探索。

微流装置的制造和使用是周知的，其用于筛选化学文库例如包含多核苷酸的化学文库的用途也是周知的，所述多核苷酸在微流筛选和/或分选(sorting)之后转化入宿主细胞以供表达。

在常规的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)转化过程中，10000个细胞中仅约1个细胞实际上被转化。一般而言，将抗生素抗性基因与目标基因一同提供，从而阻止未转化的细胞在添加的抗生素存在下生长。尽管未转化的细胞不能在抗生素应激下生长或分裂，其在暴露于常用的抗生素时通常仍会存活，一旦去除抗生素则继续生长。事实上，许多常用的抗生素就其并非杀灭细胞的意义上而言并非确实是真抗生素；大部分所谓抗生素应更准确地称为抑菌剂(bacteriostatics)。

由于相对较低的转化效率，基因文库必须为50000倍过筛选的才能补足总变体的稀释。这叠加于多样性文库的冗余度之上，所述文库本身即须为5倍过筛选的以覆盖多样性。

理论上，纳米至皮米大小的小滴微流技术允许每秒筛选多至1000个细胞。然而，在实际应用中，该数值由于细胞在小滴包装(droplet packaging)的过程中被稀释从而使得在5个小滴中仅约1个含有细胞的事实而减少。这是为了增加小滴在接种时最多仅含有一个细胞的可能性而进行的。其后果为必需筛选无法控制地大量的细胞以覆盖整个基因文库。

一种在微生物转化中增加转化对未转化细胞比例的方式应为使用下述选择原理，其中未转化的细胞实际上被杀灭，优选无需向生长培养基添加任何物质。所述对转化效率的改进在微流应用中可具有特别的相关性。

发明内容

D-丙氨酸是许多微生物包括芽孢杆菌属(Bacillus)菌种细胞壁中的化合物；其在细胞中由酶D-丙氨酸消旋酶合成。编码D-丙氨酸消旋酶的基因在许多种和属中是周知的(见下)。之前，已显示其存在于枯草芽孢杆菌DN1686中，其为在D-丙氨酸消旋酶编码基因中含有染色体缺失的衍生物，该基因的截短导致D-丙氨酸消旋酶缺陷。上述细胞生长于不含D-丙氨酸的液体培养基或琼脂板上时不能存活，除非补充以D-丙氨酸，否则其迅速裂解并死亡。

使用D-丙氨酸消旋酶缺陷宿主细胞与不含D-丙氨酸的生长培养基以及补足该缺陷的转化多核苷酸构建体的组合，提供了极大地改进微流筛选方法的效率而无需使用抗生素的良好方式。

本发明人将转化对未转化微生物细胞的比例减少为低至1∶2，其表明仅需筛选少至1/3300的细胞，从而使其能够在微流装置(setup)中采用对转化的微生物细胞的直接筛选。

该巧妙组合甚至允许高度感受态宿主细胞的原位微流转化，从而回避了通常的前筛选转化方案。

相应地，在第一个方面，本发明提供了在微流装置中就感兴趣的特性筛选微生物宿主细胞的方法，所述方法包括下述步骤：

ii)至少一个多核苷酸区，当其存在于宿主细胞时，补足所述D-丙氨酸消旋酶缺陷；和

本发明的第二个方面涉及D-丙氨酸消旋酶缺陷微生物宿主细胞在用于感兴趣的特性的微流装置筛选方法中的用途。

附图简述

图1显示4054碱基对枯草芽孢杆菌DN1686 alr-基因座的示意。

图2显示5226碱基对alr缺失构建体的示意。

图3显示9761碱基对感受性(compentence)构建体的示意；将枯草芽孢杆菌的pel-基因座用于引入盒以供异源表达。将由强CryIIIa启动子驱动的comS基因和卡那霉素抗性引入所述pel-位点，确保高度感受态细胞并提供选择性标记。此外，所述盒特征为氯霉素抗性基因的C端部分和供同源交换的区。

图4显示最终基因组布置的示意，其中包含alr ORF的经转化的DNA已与其它组分一同插入pel位点，从而补足了alr-缺陷。

发明详述

本发明的第一个方面涉及在微流装置中就感兴趣的特性筛选微生物宿主细胞的方法，所述方法包括下述步骤：

微流装置

本文中所述的微流装置和使用方法基于完全包封于惰性氟碳油流中的水相小滴的构建和电操纵。该组合使得可电寻址的小滴生成(addressable droplet generation)、高效小滴汇聚(highly efficient droplet coalescence)、精确小滴打破(precision droplet breaking)和再充电(recharging)，以及可控制的单一小滴分选(controllable single droplet sorting)成为可能。附加的惰性模块包括多流小滴形成(multi-stream droplet formulation)、混合模块和精确破碎模块(precision break-up module)。这些模块的整合对于基于小滴的高通量微流反应器系统而言是实施必需的技术。

微流装置可使用流聚焦几何形状(flow-focusing geometry)来形成小滴。例如，可将水流从一个通道通过狭窄收束(constriction)灌注；在水流通过所述收束时，反向扩散的油流(优选为氟化的油(fluorinated oil))流体动力学地聚焦水流，并将其稳定地解体为微米大小的小滴。为了形成小滴，由油对水流施加的粘性力必须克服水的表面张力。水小滴的生成速率、间隔和大小是由油和水流的相对流速以及喷口的几何形状来控制的。虽然该乳化技术极其稳固(robust)，但是小滴大小和速率与流体流速和通道尺寸紧密偶联。而且，无法控制小滴产生的时机和阶段。为了克服这些限制，本发明的微流装置可掺入整合的电场，从而构建了可电寻址的乳化系统，在一个实施方案中，其可通过将高电压施于水流并使油水界面充电来实现。水流表现为导体，而油为绝缘体；电化学反应使流体界面像电容一般充电。在突然分离(snap-off)时，界面上的电荷留在小滴上。随着场强度增加小滴大小减少。在施加低电压时，电场的作用可以忽略，而小滴形成完全是由表面张力和粘性流之间的竞争驱动的，如上所述。

该微流的、基于小滴的反应-限制系统还可包含混合器，其合并两种以上试剂以起始化学反应。多组分小滴可容易地通过将物质流在小滴形成的位置合流来生成。然而，除了最简单的反应，所有反应均需要多重步骤，其中新试剂在每个步骤过程中添加。在基于小滴的微流装置中，这可最佳地通过合并(即，汇聚)分别含有单独的反应物的不同小滴来实现。然而，在微流装置中实现这一点是特别困难的，因为表面张力、表面活性剂的稳定作用和排水力(drainage force)均妨碍小滴的汇聚；而且，小滴必须穿过限定其各自流动的流线，且必须完美地同步以到达准确的位置以供汇聚。本发明的微流装置通过利用静电电荷克服了这些困难，即，将符号相反的电荷置于每个小滴上，并施加电场迫使其汇聚。

用于使小滴在形成时充电的电极还提供了用于迫使小滴穿过流线从而导致汇聚的电场。在电场不存在时，通常两个流的小滴无法在准确相同的时点抵达汇流点。当其确实同步抵达时，分隔小滴的油层无法足够快地排开以促使汇聚，其结果为小滴并不汇聚。与之相对，当施加电场时，小滴形成变得精确同步，保证每个小滴均同时抵达汇流点(即配对小滴)。

而且，因为所述小滴带相反电荷，所以其相互吸引，迫使其穿过流体流线并彼此接触，从而导致其汇聚。小滴形成的同步化来自于由所述电场介导的小滴对中每一个小滴解体的偶联。使用带相反电荷的小滴和使用电场合并并混合试剂是极稳固的，且100％的小滴与其来自相反流的配偶体汇聚。

所述微流装置还可包含小滴分选器。必须探测单个小滴的内容物，并将所选的小滴分选至不同的流中。在一个实施方案中，上述在微流装置中的分选可通过使用机械阀来实现。使用对小滴静电充电提供了替代的分选手段，其可精确控制，可以以高频率切换，并无需任何移动部件。小滴上的静电电荷使得基于将电荷对外部电场的线性偶联的逐滴分选成为可能。举例而言，将载流平均分开的T形接头分歧也会随机地将小滴群平均分成两个流。然而，在分歧处施加的小电场准确地决定小滴进入哪个通道。变化场的反向改变分选的小滴的方向。可施于小滴的巨大的力和切换场所需的短时间使其为不具移动部件的快速而稳固的分选驱动装置；因此处理速率仅受限于小滴生成的速率和电场切换的时间，且可容易地超过每秒20000。

“分析单元”是具有至少一个进入通道、至少一个主通道、至少一个汇聚模块和至少一个检测模块的微装配的(microfabricated)基底，例如微装配的芯片。该分析单元还可含有一个或多个分选模块。所述分选模块可与分支通道流体联通，所述分支通道与一个或多个排出模块(收集模块或废物模块)联通。对于分选，至少一个检测模块与至少一个分选模块共同作用通过检测器生成的信号来使流转向。其应理解为所述“模块”和“通道”彼此流体联通，因此可相互重叠，即，模块或通道开始或结束处可能并无清晰的边界。本发明的装置可包含多个分析单元。

多个用于样品流和混合的通道可微装配在单一芯片上，且可位于芯片上的任何位置(检测或分选模块亦同)，例如，用于动力学研究。多个本发明的分析单元可组合于一个装置中。根据本发明施用的微装配消除了常规电泳或流式细胞术动力学研究中出现的死时间，并实现了更佳的时间分辨率(time resolution)。此外，通道在单一芯片上的线性排列，即多道系统(multiplex system)，可通过使用用于平行分析不同通道的光电倍增管(PMT)阵列来同时检测并分选样品。该配置可用于改进通量或用于连续的样品富集，且可适用于向微流装置提供非常高的通量，其超过了常规流分选器(fluid sorter)所能达到的容量。可将循环系统与本发明的这些和其它特征共同使用。由正排替压力(positive displacement pressure)驱动的流是控制液体流的优选方式，而电场和电场梯度是在该流中操纵小滴的优选方式。

微装配使得其它技术如PCR、使用光学镊子(optical tweezer)/细胞俘获(cell trapping)移动细胞、通过电穿孔转化细胞、μTAS和DNA杂交能够与流式细胞术在单一芯片上整合或组合。用于检测报道蛋白(reporter)的细胞特征的检测器和/或滤光器还可直接装配至芯片上。优选地，检测器为芯片外(off-chip)自由空间的光学元件(free space optics)或具有芯片上导联(on-chip leads)的芯片外电子元件。

如本文中使用的“通道”意指装置(例如基底)之上或之中至少部分地引导流体流动的特征。在一些情况下，所述通道至少可部分地由单一组件形成，例如蚀刻的基底或模制的单元。所述通道可具有任何截面形状，例如环状、椭圆形、三角形、不规则、正方形或矩形(具有任意长宽比)等，且可为覆盖或未覆盖的(即，对围绕通道的外部环境是开放的)。在通道完全被覆盖的实施方案中，所述通道的至少一部分具有被完全围绕的截面，和/或整个通道可除了其进入和排出部分之外沿其整个长度均被完全围绕。通道可具有至少2∶1，更通常至少3∶1、5∶1或10∶1的长宽比(长度对平均截面尺寸的比)。如本文中使用的“截面尺寸”在指流体通道或微流通道时，是以一般垂直于通道内流体流的方向测量的。开放通道一般会包含协助控制流体转运的特征，例如，结构特征(伸长的缺口(indentation))和/或物理或化学特征(疏水性对亲水性)和/或其它可对流体施力(例如，抑制力(containing force))的特征。通道内的流体可部分地或全部地填充通道。在一些情况下，流体可以以某些例如使用表面张力(例如，从而使得流体在通道内容纳于弯月面(meniscus)之内，如凹或凸弯月面之内)的方式被控制或容纳在通道内或通道一部分内。在制品或基底中，部分(或全部)通道可为特定的尺寸或更小，例如在一些情况下，其具有小于约5mm、小于约2mm、小于约1mm、小于约500微米、小于约200微米、小于约100微米、小于约60微米、小于约50微米、小于约40微米、小于约30微米、小于约25微米、小于约10微米、小于约3微米、小于约1微米、小于约300nm、小于约100nm、小于约30nm或小于约10nm更小的与流体流垂直的最大尺寸。在一个实施方案中，所述通道是毛细管。当然，在一些情况下，更大的通道、管等可用于大量储藏流体和/或将流体递送至通道。在一些实施方案中，通道的尺寸可选为使得流体能够自由地流经通道，例如，若所述流体含有细胞。通道的尺寸还可选为例如使得通道中流体具有某些体积或线性流速。当然，通道的数量和通道的形状可由本领域普通技术人员已知的任何方法加以改变。在一些情况下，可使用多于一个通道或毛细管。例如，可使用两个或更多个通道，其中它们彼此位于对方之内，或彼此邻接等。

“主通道”为本发明装置的下述通道，其使得分子、细胞、小分子或颗粒流经汇聚模块以供汇集一个或多个小滴，流经检测模块以供检测(鉴定)或测量小滴，以及流经分选模块(若存在)以供基于在检测模块中的检测来分选小滴。所述汇聚、检测和/或分选模块可置于或装配于主通道中。主通道通常与进入通道或进入模块流体联通。“进入通道”允许分子、细胞、小分子或颗粒流入主通道。一个或多个进入通道与一个或多个用于将样品引入本发明装置的工具(means)联通。进入通道与主通道在进入模块联通。主通道通常还与排出模块以及任选地与分支通道流体联通，其每一个可具有收集模块或废物模块。这些通道允许细胞流出主通道。

微流装置可包含分歧的几何形状，其设计方式使得分选过程中对小滴的流体剪力最小。已知的装置描述了其中显著的剪力在分选过程中影响小滴的分歧几何形状。具体而言，当小滴在遇到分歧之前移至横跨输入通道宽度的分选力影响下时，其可遭受剪力，且小滴可在分歧点遭受剪力，其施加方式可使得小滴伸长甚至将小滴撕裂。

包含具有分歧几何形状的通道的微流装置可通过下述方式使得这些剪力变为最小：(i)在输入通道中诊断小滴作出分选决定的分歧处上游包含垂颈(necked-down)段，和/或(ii)在输入通道紧接着分歧之前包括外展(flaired-out)段，和/或(iii)在分歧的远侧壁包含分叉。组件(i)可使剪力最小化，因为分选场是在小滴位于垂颈段时施加的。因此当小滴离开垂颈段时，小滴位于流体流线中，其将小滴携带出分歧的所需分支。此外，小滴不显著地遭遇流向分歧的不需要分支的流体流线。组件(ii)可使剪力最小化，因为小滴并不显著地冲击分歧的远侧壁，而不会在该处遭受流向分歧的不需要分支的液体流线。组件(iii)可使剪力最小化，因为所述分叉使得两组流体流线(即流向分歧一个分支的组和流向分歧另一分支的组)集中并彼此分开。

微流装置可含有特定的几何形状，其设计方式使其在包封于小滴之前阻止生物/化学物质的积聚并保持生物/化学物质彼此分离。可改变通道尺寸的几何形状以扰乱积聚物并通过多种方法将其解体，其包括但不限于几何挤捏(以迫使细胞穿过一个(或一系列)狭窄区，其尺寸小于或类似于单细胞的尺寸)，或隔板(将一系列隔板置于移动细胞的路径上以扰乱其运动并使得细胞积聚物破碎)。

通道设计可迫使生物/化学物质沿中央流线移动通过流焦点(flow focus)，例如，在通道入口使用两个稀释通道以防止其附于通道表面。这也可用于防止细胞的表面附着。这些尺寸的小滴趋于与通道的大小和性状相符，而保持其相应的体积。因此，当小滴从较宽的通道移至较窄的通道时，其可变得较长和较细，反之亦然。小滴的长度可为其宽度的至少四倍。该小滴形状(其可视为锭状)使其平滑并良好地流经通道。产生于较窄通道中的较长的小滴提供了较高的剪切，意指小滴可更容易地(即，使用更小的力)从流中被剪切或脱离(break off)。小滴还趋于粘在通道表面，其可减缓或阻遏流，或产生湍流。当小滴与通道尺寸相比足够大而脱离时，克服了小滴粘着。因此，如果存在多种大小的小滴，其可合并形成均一的小滴，所述小滴具有所谓临界质量或体积，其导致平滑即层状的小滴流。长度大于宽度的小滴，优选长度约为宽度四倍以上的小滴一般具有克服通道粘着的能力，并自由地移动通过微流装置。因此，在一个使用60微米通道的示例性实施方案中，通常为自由流动的小滴为约60微米宽和240微米长。可根据需要影响小滴的尺寸和流动特征，部分是通过改变通道的尺寸例如通道宽度。

术语“乳剂”指一种液体以小球状物(本文中也称作滴、小滴或纳米反应器(nanoreactor))分配于另一种液体实体内的制备物。所述第一和第二流体彼此不相混溶。例如，间断相可为水溶液而连续相可为疏水流体如油。这称为油包水乳剂。或者，所述乳剂可为水包油乳剂，在该实例中，第一液体以球状物分散，称作间断相，而第二液体称作连续相或分散介质。连续相可为水溶液而间断相为疏水流体，如油(例如癸烷、十四烷或十六烷)。水包油乳剂中的油的小滴或球状物在本文中也称作“胶团”，而油包水乳剂中的水的球状物可称作“反胶团”。

如本文中使用的术语“纳米反应器”及其复数形式涵盖了本文中定义的术语“小滴”、“微滴”或“微小滴”，以及如本文中详述的用于操纵并探测小滴的整合系统。本文中所述的纳米反应器可为0-100μm(例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100)。形成小滴的液体通常是水性缓冲溶液，如超纯水(例如，具有18兆欧姆阻抗的超纯水，其例如通过柱层析法获得)、10mM Tris HCl和1mM EDTA(TE)缓冲液、磷酸盐缓冲盐水(PBS)或乙酸盐缓冲液。

可使用任何与待分析和/或分选的分子、细胞或颗粒的群体生理上相容的液体或缓冲液。流体经过主通道，且于其中形成小滴，该流体不与形成小滴液体混溶。经过主通道的流体可为非极性溶剂，最优选为癸烷(例如，十四烷或十六烷)，氟碳油或其它的油(例如矿物油)。

分散相流体还可含有生物/化学物质(例如，分子、细胞或其它颗粒)以供在装置中组合、分析和/或分选。分散相流体的小滴可含有超过一个颗粒或可含有不超过一个颗粒。例如，当所述生物物质包含细胞时，每个小滴优选含有平均不超过一个细胞。小滴可根据其内容物加以检测和/或分选。

用于本发明的流体可含有一种或多种添加剂，如减少表面张力的试剂(表面活性剂)。表面活性剂可包括Tween、Span、含氟表面活性剂(fluorosurfactant)和其它可溶于油(相对于水)的试剂。表面活性剂可协助控制或优化小滴大小、流动和均一性，例如通过减少挤出小滴或将小滴注入横贯通道所需的剪力来进行。这可影响小滴的体积和周期性，或小滴脱离进入横贯通道的速率或频率。此外，表面活性剂可在氟化油中起稳定水性乳剂避免其汇聚的作用。

小滴可包覆以表面活性剂。优选的可添加至连续相流体的表面活性剂包括但不仅限于表面活性剂如基于山梨聚糖的羧酸酯(例如，“Span”表面活性剂，Fluka Chemika)，包括单月桂山梨坦(Span 20)、单棕榈山梨坦(Span 40)、单硬脂山梨坦(Span 60)和单油酸山梨坦(Span 80)，以及全氟聚乙烯(例如，DuPont Krytox 157 FSL、FSM和/或FSH)。其它可使用的非离子型表面活性剂的非限定性实例包括聚氧乙烯化烷基酚(polyoxyethylenated alkylphenols)(例如，壬基酚、对十二烷基酚和二壬基酚)、聚氧乙烯化直链醇、聚氧乙烯化聚氧丙二醇、聚氧乙烯化硫醇、长链羧酸酯(例如，天然脂肪酸的甘油或多甘油酯，聚丙二醇，山梨醇，聚氧乙烯化山梨醇酯，聚氧乙烯二醇酯等)和烷醇胺(例如二乙醇胺-脂肪酸缩合物和异丙醇胺-脂肪酸缩合物)。此外，还可使用离子型表面活性剂如十二烷基硫酸钠(SDS)。然而，该类表面活性剂对于本发明的许多实施方案而言一般是较不优选的。例如，在使用水性小滴作为纳米反应器以供化学反应(包括生物化学反应)或者用于分析和/或分选生物材料的实施方案中，水溶性表面活性剂如SDS可使得小滴内容物变性或失活。

载流体可为含有表面活性剂(例如，非离子型表面活性剂如Span表面活性剂)作为添加剂(优选按体积计约0.2至5％，更优选约2％)的油(例如，癸烷、十四烷或十六烷)或氟碳油。使用者可优选地使得载流体流经微流装置的通道从而使得载流体中的表面活性剂包覆通道壁。

在一个实施方案中，含氟表面活性剂可通过将全氟聚乙烯DuPont Krytox 157 FSL、FSM或FSH与氢氧化铵水溶液在挥发性氟化溶剂中反应来制备。溶剂和剩余的水和氨可用旋转蒸发器来去除。然后将表面活性剂(例如，2.5wt％)溶解于氟化油(例如，Fluorinert(3M))，其然后充当乳剂的连续相。

本发明可使用压力驱动的流控制，例如，利用阀和泵来操纵细胞、颗粒、分子、酶或试剂向一个或多个方向和/或进入微流装置一个或多个通道的流动。然而，还可将其它方法单独使用或与泵和阀组合使用，如电渗透流控制、电泳和介电电泳(Fulwyer，Science 156，910(1974)；Li和Harrison，Analytical Chemistry 69，1564(1997)；Fiedler等Analytical Chemistry 70，1909-1915(1998)；美国专利5,656,155号)。根据本发明应用这些技术提供了更加迅速和精确的装置和方法以供分析或分选，例如，因为分选发生于分选模块处或分选模块中，该模块可置于检测模块处或紧接其后，这使得分子或细胞需要移动较短距离，其可更加迅速的移动，并具有较少的湍流，且可容易地以一纵列(single file)进行(即，一次一个)移动、检查并分选。

本发明的微流装置的制造和用途的细节可容易地从WO 2007081385、WO 2007081386、WO 2007081387、WO 2007133710和WO 2008063227(Raindance Technologies Inc)获得。

宿主细胞

本文中使用的术语“微生物宿主细胞”包括任何细胞类型，其对于使用核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。

将包含提供目标活性的多核苷酸(例如，一个或多个编码酶活性的基因)的载体或构建体引入宿主细胞，从而使得载体作为染色体整合体或自主复制的染色体外载体而保持。术语“宿主细胞”包括亲本细胞的任何后代，其可由于复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。宿主细胞的选择很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是可用于本发明的多肽的重组生产的任何细胞，例如，原核或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不仅限于，芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)和海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)。革兰氏阴性细菌包括但不仅限于，大肠杆菌(E.coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)和脲原体属(Ureaplasma)。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞。可用于实施本发明的芽孢杆菌属细胞包括但不仅限于，嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)细胞。

在一个优选的方面，细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在一个更优选的方面，细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是克劳氏芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是地衣芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是枯草芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞。可用于实施本发明的链球菌属细胞包括但不仅限于，似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)和马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)细胞。

在一个优选的方面，细菌宿主细胞是似马链球菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是酿脓链球菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是乳房链球菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是马链球菌兽瘟亚种细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞。可用于实施本发明的链霉菌属细胞包括但不仅限于，不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)和浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)细胞。

在一个优选的方面，细菌宿主细胞是不产色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是除虫链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是天蓝色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是灰色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是浅青紫链霉菌细胞。

可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen，1979，Molecular General Genetics 168：111-115)，使用感受态细胞(参见，例如，Young和Spizizen，1961，Journal of Bacteriology 81：823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology 56：209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6：742-751)或接合(参见，例如，Koehler和Thorne，1987，Journal of Bacteriology 169：5771-5278)。可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Hanahan，1983，J.Mol.Biol.166：557-580)或电穿孔(参见，例如，Dower等，1988，Nucleic Acids Res.16：6127-6145)。可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞：例如原生质体转化和电穿孔(参见，例如，Gong等，2004，Folia Microbiol.(Praha)49：399-405)，接合(参见，例如，Mazodier等，1989，J.Bacteriol.171：3583-3585)，或转导(参见，例如，Burke等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞：例如电穿孔(参见，例如，Choi等，2006，J.Microbiol.Methods 64：391-397)或接合(参见，例如，Pinedo和Smets，2005，Appl.Environ.Microbiol.71：51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：例如天然感受态(natural competence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu，1981，Infect.Immum.32：1295-1297)，原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick，1991，Microbios.68：189-207)，电穿孔(参见，例如，Buckley等，1999，Appl.Environ.Microbiol.65：3800-3804)或接合(参见，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.45：409-436)。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞的任何方法。

如上所述，D-丙氨酸是许多微生物包括芽孢杆菌属菌种的细胞壁的化合物；其在细胞中由酶D-丙氨酸消旋酶合成。在枯草芽孢杆菌中编码D-丙氨酸消旋酶的基因(UNIPROT：P10725)是alr(alanine racemase)，对于该基因使用的另一个术语是dal(d-alanine racemase)(Ferrari，E.等1985. Isolation of an alanine racemase gene from Bacillus subtilis and its use for plasmid maintenance in

之前，显示在枯草芽孢杆菌DN1686中，衍生物在所述alr基因中含有染色体缺失，该基因的截短导致D-丙氨酸消旋酶缺陷。上述细胞生长于不含D-丙氨酸的液体培养基或琼脂板上时不能存活，除非补充以D-丙氨酸，否则其迅速裂解并死亡。然而，转化入alr敲除菌株的编码活性D-丙氨酸消旋酶的多核苷酸能够补足该缺陷(Diderichsen B，1986，A genetic system for stabilization of cloned genes in Bacillus subtilis.Bacillus Molecular Genetics and Biotechnology Applications，pp.35-46)。

最近公开了枯草芽孢杆菌除了alr之外包含第二个D-丙氨酸消旋酶(UNIPROT：P94494)编码基因，yncD，其通常不表达，但在某些情况下可变为组成型表达，由此允许原本是D-丙氨酸消旋酶缺陷细胞的生长。从鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、植物乳细菌(Lactobacillus plantarum)、嗜热脂肪芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌提供了多种D-丙氨酸消旋酶的氨基酸序列的比较。此外，广泛的系统进化分析揭示了革兰氏阳性酶(Dal和YncD)与革兰氏阴性酶(Air和DadX)进化上是迥然有别的，尽管其在体内可互相补足，且来自不同芽孢杆菌属菌种的Dal和YncD蛋白明显地在进化树的革兰氏阳性侧上在分叉的组中簇集在一起(参见Pierce K J等，2008， Gene cloning and characterization of a second alanine racemase from Bacillus subtilis encoded by ync

相应地，在本发明的一个优选实施方案中，D-丙氨酸缺陷宿主细胞在一个或多个编码D-丙氨酸消旋酶的染色体基因上携带至少一个突变，由此该基因被沉默或编码的D-丙氨酸消旋酶失活；优选地，该至少一个突变包含插入、缺失或取代至少一个核苷酸，且最优选地，该至少一个突变包含基因的截短。

多核苷酸构建体

本发明还涉及包含分离的多核苷酸的核酸或多核苷酸构建体，所述分离的多核苷酸当存在于宿主细胞中时，提供感兴趣的特性，通常该多核苷酸编码具有感兴趣特性的多肽，所述多核苷酸可操作地连接于一个或多个(几个)调控序列，所述调控序列在与该调控序列相容的条件下指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。

可以用许多方式操纵编码感兴趣的多肽的分离的多核苷酸以提供多肽的表达。取决于表达载体，在将多核苷酸的序列插入载体之前对其进行操纵可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是本领域周知的。

调控序列可以是适当的启动子序列，其为由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

用于指导核酸构建体转录，特别是在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子：大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA75：3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等，1983，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80：21-25)。另外的启动子在″Useful proteins from recombinant bacteria″于Scientific American，1980，242：74-94中；和在Sambrook等，1989，见上文中描述。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，是由宿主细胞识别以终止转录的序列。所述终止子序列与编码所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地连接。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。

调控序列还可以是合适的前导序列，其为对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的5’-末端。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列用在本发明中。

调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其为与核苷酸序列的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本发明中使用。

调控序列还可以是信号肽编码序列，其编码与多肽的氨基末端相连的氨基酸序列，并且指导编码的多肽进入细胞分泌途径。核苷酸序列的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列，其与编码分泌多肽的编码序列的区段一起天然地连接在翻译阅读框中。或者，编码序列5’端可含有对于所述编码序列外源的信号肽编码序列。外源信号肽编码序列在编码序列不天然地含有信号肽编码序列时可为必需的。或者，外源信号肽编码序列可以简单地取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径(即，分泌至培养基中)的任何信号肽编码序列可在本发明中使用。

对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT，nprS，nprM)、克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews 57：109-137描述。

调控序列还可以是前肽编码序列，其编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为成熟活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)的基因获得前肽编码序列。

当信号肽和前肽序列二者均出现在多肽的氨基末端时，将前肽序列置于紧接着(next to)多肽氨基末端，并且将信号肽序列置于紧接着前肽序列的氨基末端。

还可需要添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac、xyl和trp操纵基因系统。

在本发明第一个方面中的多核苷酸构建体的优选实施方案中，所述提供感兴趣的特性的一个或多个多核苷酸区包括基因组、变体或cDNA文库。

在本发明另一个优选实施方案中，感兴趣的特性是酶活性，优选由步骤i)的一个或多个多核苷酸区编码的酶活性；更优选地，所述酶活性是裂解酶、连接酶、水解酶、氧化还原酶、转移酶或异构酶，或更优选地，所述酶活性是氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、卤过氧化物酶(haloperoxidase)、半纤维素酶、转化酶(invertase)、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、转移酶、转谷氨酰胺酶或者木聚糖酶。

表达载体

本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。本文所述的多种核酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个(几个)方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的核苷酸序列。或者，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸构建体来表达本发明的多核苷酸序列。为了构建表达载体，将编码序列置于载体中，使该编码序列与合适的表达调控序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生核苷酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。

本发明的载体优选地含有一个或多个(几个)选择性标记，其允许容易地选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。

细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性的标记，所述抗生素抗性例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性。

本发明的载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制。

为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的核苷酸序列，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应优选含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，优选400至10,000碱基对，并且最优选800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文定义为能够使质粒或载体体内复制的核苷酸序列。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。

可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加基因产物的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝并由此含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。

用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员周知的(参见，例如，Sambrook等，1989，见上文)。

实施例

实施例1-枯草芽孢杆菌中alr的截短

为了该构建，我们将编码针对四环素的抗生素抗性的基因通过同源重组引入枯草芽孢杆菌DN1686的alr-位点，得到D-丙氨酸消旋酶缺陷菌株。由此，替换了94bp的alr-基因。枯草芽孢杆菌DN1686的alr-位点示于图1。

将图2中所示的以缺失构建体为特征的PCR产物转化入枯草芽孢杆菌MiBg-601(DN1686衍生物)，得到tet-抗性转化体，将其在含有10微克/ml四环素和50微克/ml D-丙氨酸的LB琼脂糖板上选择。转化体无法在不含D-丙氨酸的LB琼脂糖板上生长。选择了一个所得的细胞并命名为HeHe004。

实施例2-表达盒和comS的引入

将用于异源多肽表达的盒通过双重同源重组(double homologous recombination)引入枯草芽孢杆菌HeHe004的pel-位点。该盒包含由强CryIIIa启动子驱动的comS基因，其提供高度感受态细胞，卡那霉素抗性选择性标记，氯霉素抗性基因的C端部分以及适于同源重组的pel-区的上游和下游。所得的基因组的示意概况示于图3。

实施例3-感兴趣的基因的转化

用经工程改造以将comS卡那霉素盒替代为完好的alr-基因和完整氯霉素基因的多核苷酸构建体转化前述实施例的高度感受态和卡那霉素抗性细胞。该构建体的示意概况示于图4。alr-基因与感兴趣的基因(其编码所谓10R蛋白酶)一起共转录表达。转化体为Alr阳性、氯霉素抗性，且其由于10R蛋白酶活性能够在板中降解酪蛋白。

实施例4-D-丙氨酸消旋酶缺陷的补足

在实施例3中的转化之后，我们获得了6*10⁴个原代转化体。转化细胞总数为3*10⁸个，其相当于1个转化细胞对应于每5000个未转化的细胞的比例。

在不含D-丙氨酸的培养基中将转化混合物温育约6小时之后，转化对未转化细胞的比例增加至高达1∶2。与此同时，每个转化细胞进行少量复制，从而增加了文库的冗余度。

1∶2的转化对未转化细胞的比例可容易地在纳米小滴筛选方法中进行操作，因此D-丙氨酸缺陷的补足是高度适用于纳米小滴筛选的选择原则。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种在微流装置中就感兴趣的特性筛选芽孢杆菌属宿主细胞的方法，所述方法包括下述步骤：

a)用包含下述的多核苷酸构建体转化D-丙氨酸消旋酶缺陷的芽孢杆菌属宿主细胞：

2.权利要求1的方法，其中所述芽孢杆菌属细胞选自下组：嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。

3.权利要求1-2任一项的方法，其中所述一个或多个提供感兴趣的特性的多核苷酸区包含基因组、变体或cDNA文库。

4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述感兴趣的特性是酶活性。

5.权利要求4的方法，其中所述酶活性是由步骤i)中一个或多个多核苷酸区编码的。

6.权利要求4或5的方法，其中所述酶活性是裂解酶、连接酶、水解酶、氧化还原酶、转移酶或异构酶。

7.权利要求6的方法，其中所述酶活性是氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、卤过氧化物酶(haloperoxidase)、半纤维素酶、转化酶(invertase)、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、转移酶、转谷氨酰胺酶或者木聚糖酶。

8.权利要求1-7任一项的方法，其中所述芽孢杆菌属宿主细胞在一个或多个编码D-丙氨酸消旋酶的染色体基因中携带至少一个突变，由此该基因被沉默或编码的D-丙氨酸消旋酶失活。

9.权利要求8的方法，其中所述至少一个突变包含插入、缺失或取代至少一个核苷酸。

10.权利要求9的方法，其中所述至少一个突变包含基因的截短。

Claims

1.一种在微流装置中就感兴趣的特性筛选微生物宿主细胞的方法，所述方法包括下述步骤：

2.权利要求1的方法，其中所述微生物宿主细胞是革兰氏阳性细胞。

3.权利要求2的方法，其中所述革兰氏阳性细胞是芽孢杆菌属(Bacillus)细胞。

4.权利要求3的方法，其中所述芽孢杆菌属细胞选自下组：嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。

5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述一个或多个提供感兴趣的特性的多核苷酸区包含基因组、变体或cDNA文库。

6.权利要求1-5任一项的方法，其中所述感兴趣的特性是酶活性。

7.权利要求6的方法，其中所述酶活性是由步骤i)中一个或多个多核苷酸区编码的。

8.权利要求6或7的方法，其中所述酶活性是裂解酶、连接酶、水解酶、氧化还原酶、转移酶或异构酶。

9.权利要求8的方法，其中所述酶活性是氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、卤过氧化物酶(haloperoxidase)、半纤维素酶、转化酶(invertase)、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、转移酶、转谷氨酰胺酶或者木聚糖酶。

10.权利要求1-9任一项的方法，其中所述微生物宿主细胞在一个或多个编码D-丙氨酸消旋酶的染色体基因中携带至少一个突变，由此该基因被沉默或编码的D-丙氨酸消旋酶失活。

11.权利要求10的方法，其中所述至少一个突变包含插入、缺失或取代至少一个核苷酸。

12.权利要求11的方法，其中所述至少一个突变包含基因的截短。

13.D-丙氨酸消旋酶缺陷微生物宿主细胞在感兴趣的特性的微流装置筛选方法中的用途。

14.权利要求13的用途，其中所述微生物宿主细胞是革兰氏阳性细胞。

15.权利要求14的用途，其中所述革兰氏阳性细胞是芽孢杆菌属(Bacillus)细胞。

16.权利要求15的用途，其中所述芽孢杆菌属细胞选自下组：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。

17.权利要求13-16任一项的用途，其中所述感兴趣的特性是酶活性。

18.权利要求17的用途，其中所述酶活性是裂解酶、连接酶、水解酶、氧化还原酶、转移酶或异构酶。

19.权利要求18的用途，其中所述酶活性是氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、卤过氧化物酶、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、转移酶、转谷氨酰胺酶或者木聚糖酶。

20.权利要求13-19任一项的用途，其中所述微生物宿主细胞在一个或多个编码D-丙氨酸消旋酶的染色体基因中携带至少一个突变，由此该基因被沉默或编码的D-丙氨酸消旋酶失活。

21.权利要求20的方法，其中所述至少一个突变包含插入、缺失或取代至少一个核苷酸。

22.权利要求21的方法，其中所述至少一个突变包含基因的截短。