CN102199595B - 表达盒、其转基因鱼及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种表达盒，其包含编码报告蛋白的报告核苷酸序列、从青鳉鱼分离的雌激素反应5′-调控核苷酸序列和可操作地连接到所述报告核苷酸序列3′端的3′-调控区，其中所述调控核苷酸序列可操作地连接到所述报告核苷酸序列的5′端，以在雌激素或雌激素样化合物存在下诱导报告蛋白表达。本发明还涉及具有上述表达盒的转基因鱼。本发明还涉及出于各种目的使用所述转基因鱼的方法，所述目的包括例如：(1)鉴定雌激素内分泌干扰物；(2)监测测试样品的雌激素样活性；(3)鉴定抗雌激素内分泌干扰物；和(4)研究内分泌干扰物对肝脏再生的影响。本发明还公开了宿主细胞和水生动物的转基因细胞等。

Description

表达盒、其转基因鱼及应用

技术领域

一般而言，本发明涉及表达盒、转基因鱼及其特别是在检测雌激素和抗雌激素化合物，监测环境中的雌激素样活性以及研究肝脏的再生中的应用。

背景技术

现发现曾被视为安全的很多化学物质具有扰乱内分泌系统的活性，并且在生物体内导致不良反应。这些种类的化学品在环境中的广泛存在已近引起了全世界的关注。因为有关这些物质对雄性生物的雌激素效应的报道越来越多，所以大部分研究工作集中于雌激素样内分泌干扰物。

重要的是获得用于鉴定能够模拟雌激素或干扰雌激素内分泌系统的化学物质的快速、敏感、经济且可定量的方法，此方法能够有助于评估这些化学物质对生物体的生物效应。在现有技术的方法中，已研究了体外细胞系分析和体内转基因鱼分析。细胞系分析能够快速且敏感，但不能提供关于测试物质对生物体的毒理动力学和毒理代谢动力学作用的信息。目前，转基因鱼分析能够克服细胞系分析的一些缺陷。然而，现有转基因鱼的局限性在于它们都是淡水物种，不能在海洋环境中使用。

发明内容

本发明一方面涉及表达盒，其包含：(i)编码报告蛋白的报告核苷酸序列；(ii)从青鳉鱼(medaka fish)分离的雌激素反应5′-调控核苷酸序列，其中所述调控核苷酸序列可操作地连接到所述报告核苷酸序列的5′端，以在雌激素或雌激素样化合物存在下诱导报告蛋白表达；和(iii)可操作地连接到所述报告核苷酸序列3′端的3′-调控区。

本发明的另一方面涉及包含本发明表达盒的转化载体。

本发明的另一方面涉及转导有本发明表达盒的宿主细胞。

本发明的另一方面涉及水生动物的转基因细胞，其中所述转基因细胞包含至少一个本发明的表达盒。

本发明的另一方面涉及包含至少一个本发明表达盒的转基因鱼。在接触到包含雌激素或雌激素样化合物的液体介质时，所述转基因鱼表现出可观测的标记。所述可观测的标记包括由所述至少一个表达盒表达的报告蛋白。

本发明的另一方面涉及用于检测液体介质中存在雌激素或雌激素样化合物的转基因鱼的制备方法。此方法包括使用本发明的表达盒转化非转基因鱼，从而获得包含至少一个所述表达盒的转基因鱼。

本发明的另一方面涉及筛选液体介质中雌激素物质的方法。

本发明的另一方面涉及筛选液体介质中雌激素物质的方法。此方法包括使本发明的转基因鱼接触待测(即用于检测雌激素物质的存在)的液体介质。在此接触步骤后，此方法包括检测所述转基因鱼是否表现出通过诱导(包含在所述转基因鱼体中的)报告基因的表达产生的可观测的标记。存在可观测的标记表明所述液体介质包含雌激素物质。

本发明的另一方面涉及筛选具有抗雌激素活性的化合物的方法。此方法包括以下步骤：(a)提供本发明的第一转基因鱼和第二转基因鱼，其中所述第一转基因鱼和第二转基因鱼为相同的种，并且处于基本相同的发育阶段；(b)使所述第一转基因鱼接触第一液体介质，其中所述第一液体介质包含雌激素或雌激素样化合物；(c)使所述第二转基因鱼接触第二液体介质，其中所述第二液体介质包含第一液体介质和测试化合物；和(d)将所述第一转基因鱼表现出的任何可观测的标记的定量强度与所述第二转基因鱼表现出的任何可观测的标记的定量强度进行比较，其中与所述第一转基因鱼中可观测的标记的定量强度相比，所述第二转基因鱼中可观测的标记的定量强度下降表明所述测试化合物具有抗雌激素活性。

本发明的另一方面涉及用于研究雌激素化合物对肝脏再生的影响的方法。总体而言，此方法包括：对本发明的成体转基因鱼进行部分肝切除，其中所述部分肝切除是有效去除所述转基因鱼的部分肝脏；使所述转基因鱼接触包含测试雌激素化合物的测试液体介质；和分析所述转基因鱼的肝脏以检测肝组织的任何再生。

与研究单一的雌激素化合物相反，本发明的另一方面涉及用于研究不同雌激素化合物对肝脏再生的影响的方法。总体而言，此方法包括以下步骤：(a)提供本发明的第一转基因鱼和第二转基因鱼，其中所述第一转基因鱼和第二转基因鱼为相同种的成体鱼；(b)使所述第一转基因鱼接触包含第一测试雌激素化合物溶液的第一液体介质；(c)使所述第二转基因鱼接触包含第二测试雌激素化合物溶液的第二液体介质；(d)量化所述第一转基因鱼和所述第二转基因鱼表现出的任何可观测的标记的强度；(e)对所述第一转基因鱼和第二转基因鱼进行部分肝切除，其中所述部分肝切除是有效去除所述第一转基因鱼和第二转基因鱼的部分肝脏；(f)重复此方法的步骤(b)到步骤(d)；和(g)分析所述第一转基因鱼和第二转基因鱼的肝脏以比较所述第一液体介质和所述第二液体介质中包含的雌激素化合物对肝组织任何再生的影响。

附图说明

本专利或申请文件包含至少一幅彩色的附图。基于请求并收取必要的费用，专利局可提供带有彩色附图的本专利或专利申请副本。

图1显示通过绿色荧光(GFP)阳性幼体的频率所代表的不同长度的omChgH5’-上游区的相对启动子活性，其中所述GFP阳性幼体源自于注射有核酸序列的胚胎，所述核酸序列包含对17β-雌二醇反应的omChgH启动子-EGFP(增强型绿色荧光蛋白)。

图2显示不同基因的mRNA聚腺苷酸化信号对核酸omChgH启动子-EGFP的相对启动子活性的影响，核酸omChgH启动子-EGFP的相对启动子活性由GFP阳性幼体的频率所代表，其中所述GFP阳性幼体源自于注射有核酸的胚胎，所述核酸包含对17β-雌二醇反应的，侧翼为olChgH、SV40或omChgH3’-侧翼区的omChgH启动子-EGFP(增强型绿色荧光蛋白)。

图3A-3G显示转基因EGFP在通过引入包含omChgH启动子-EGFP转基因的核酸序列而产生的转基因鱼中的天然和诱导表达。GFP的表达仅局限于成体雌鱼的肝脏(图3C)，而不在胚胎(图3A)、幼体(图3B)或雄鱼(图3D)中表达。图3E-3G显示通过17β-雌二醇也可在胚胎、幼体和雄鱼的肝脏中诱导转基因EGFP的表达。

图4显示使用本发明的转基因鱼幼体分析测试溶液的雌激素样活性的一个实施方式的操作流程图。

图5显示孵化后不同天数的转基因鱼幼体的雌激素敏感性。

图6是显示在5～9范围的pH不影响转基因鱼幼体对17β-雌二醇反应的图。

图7是显示0～35ppt的盐度不影响转基因鱼幼体对17β-雌二醇反应的图。

图8显示对雌激素反应转基因幼体中GFP信号强度随时间推移而增加。

图9显示转基因鱼幼体对17β-雌二醇的剂量-反应。

图10显示转基因鱼幼体对合成激素17β-乙炔雌二醇的剂量-反应。

图11显示分别由植物雌激素染料木黄酮、染料木苷、大豆苷原、大豆苷以及从豆浆提取的它们的组合物诱导的肝GFP信号。

图12显示由UV过滤剂BP-3和4-MBC单独及组合诱导的肝GFP信号。使本发明一个实施方式的转基因鱼幼体接触4-MBC(5μM)、HMS(5μM)和以上述一半浓度(2.5μM)混合的这两种化合物的组合。由其混合物诱导的GFP信号显著高于由这两种化合物诱导的GFP信号。

图13显示由单独的17β-雌二醇，或者17β-雌二醇与UV过滤剂B-MDM、OMC或OD-PABA的组合诱导的肝GFP信号。

图14显示HMS能够以剂量依赖的方式提高17β-雌二醇诱导的肝GFP信号。

图15显示多环麝香AHTN能够降低17β-雌二醇诱导的肝GFP信号。

具体实施方式

一方面，本发明涉及包含表达盒的转基因鱼，所述表达盒包含从青鳉鱼分离的雌激素反应5′-调控核苷酸序列，其中所述雌激素反应5′-调控核苷酸序列可操作地连接到所述报告核苷酸序列的5′端。当所述转基因鱼接触包含雌激素或雌激素样化合物的液体介质时，所述报告核苷酸序列表达能够在体内或体外检测的相应报告蛋白。本发明的转基因鱼可用于各种应用，包括但不限于，用于检测雌激素化合物和抗雌激素化合物，监测环境中的雌激素样活性，以及研究肝脏的再生。

本发明的转基因鱼可以是各种淡水、半咸水或咸水(海水)鱼类，包括但不限于青鳉种(Oryzias species)和鲤种(Danio species)的鱼。青鳉属的鱼属于异鳉(Adrianichthyidae)科，包括例如，黑点青鳉(Oryzias melastigma，别名恒河青鳉(Oryzias dancena)(海水或半咸水青鳉)、日本青鳉(Oryzias latipes)、西里伯斯青鳉(Oryzias celebensis)、花斑青鳉(Oryzias marmoratus)、印尼青鳉(Oryzias matanensis)、黑青鳉(Oryziasnigrimas，黑青鮰)、直颌青鳉(Oryziasorthognathus或buntingi)和深青鳉(Oryzias profundicola)。鲤属的鱼属于鲤(Cyprinidae)科，包括例如斑马鱼(Danio rerio)、闪电斑马鱼(Danioalbolineatus)、珍珠斑马鱼(Danio abolineatus)、虹带斑马鱼(Danio choprae)、长须斑马鱼(Danio dangila)、蓝带斑马鱼(Danio erythromicron)、缅甸斑马鱼(Danio feegradei)、克氏斑马鱼(Danio kerri)、Danio kyathit、银河斑马鱼(Daniomargaritatus)、Danio meghalayensis、黑带斑马鱼(Danio nigrofasciatus)和玫瑰斑马鱼(Danio roseus)。

关于黑点青鳉鱼(O.melastigma)，此种是经鉴定属于青鳉属的很多青鳉种之一(上文列出了某些种)。黑点青鳉鱼产于巴基斯坦、印度、缅甸和泰国的近海和淡水水域(K.Naruse，Fish Biol.L.Medaka 8：1-9(1996))，并且生长在盐度在千分之0～35(0～35ppt)的水域中。此外，该黑点青鳉鱼对于转基因开发具有很多优点，包括：(1)体型小(成体鱼为2-3厘米)；(2)传代时间相对短(2-3个月)；(3)性别二态性(例如，雌鱼具有扁平的臀鳍远极面，而雄鱼则由于分离的鳍条较长以致其臀鳍是凸起的)；(4)生长繁殖能力强；(5)半透明的卵和幼体(直至孵化后15天)，其有助于放置DNA微注射针以及观察内部器官；和(6)能适合用于生产其他青鳉种(例如日本青鳉)转基因鱼的各种转基因技术。

关于黑点青鳉鱼的强生产繁殖能力，该鱼可以在全年诱导产卵，在保持的室内环境下(例如，28±1℃，14小时-光/8小时-暗的恒定光循环，饲喂商购的无激素片状食物和卤虫(Artemia salina))，每对雌鱼和雄鱼能够在长达数月的时间内每天产卵20-30枚。卵通常在28±1℃孵化11-15天。

日本青鳉已用于生产携带各种转基因的转基因鱼(例如，K.Ozato et al.，Cell Differ.19：237-244(1986)；K.Inoue et al.，Cell Difer.Dev.27(1)：57-68(1989)；E.Tamiya et al.，Nucleic Acids Res.18：1072(1990)；K.Inoue et al.，CellDiffer.Dev.29(2)：123-128(1990)；J.Lu et al.，Mol.Marine Biol.and Biotechnol.1(4/5)：366-375(1992)；H.J.Tsai et al.，Mol.Mar.Biol.Biotechnol.4(1)：1-9(1995)；R.N.Winn et al.，Marine Env.Res.40(3)：247-265(1995))。研究显示黑点青鳉和日本青鳉这两种青鳉之间具有高度的形态学、生理学和基因组类似性，并且易于将日本青鳉的转基因技术应用于黑点青鳉(X.Chen et al.，Ectoxicol.Environ.Saf.71：200-208(2008)；X.Chen et al.，Comp.Biochem.Physiol.C.Toxicol.Pharmacol.149：647-655(2009))。

在一个实施方式中，对本发明的转基因鱼进行工程化，使其包含一个或多个拷贝的线性化核酸序列，所述核酸序列包含雌激素靶基因的启动子区，其与报告基因(例如，荧光蛋白基因)的编码区可操作地连接，然后侧翼有终止序列(例如，mRNA聚腺苷酸化信号序列)。启动子区序列和终止序列可源自相同的雌激素靶基因，但本发明并不要求它们具有相同的来源。

适合的启动子区可以是源自雌激素依赖性基因的启动子区。在一个实施方式中，本发明涉及的具体雌激素依赖性基因可包括，但不限于来自黑点青鳉的卵壳蛋白H(choriogenin H)基因(此基因缩写为″omChgH″)和来自日本青鳉的卵壳蛋白H基因(此基因缩写为″olChgH″)。

已表征黑点青鳉omChgH基因对雌激素和雌激素样物质高度敏感。已测定出黑点青鳉omChgH基因的完整编码序列，并保藏为GenBank登录号No.EF392365。在本文中使用的omChgH基因编码序列对应于SEQ ID NO.1，如下所示：

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6421ccccaggctc cccagtaccc aactaagcct caagctcctc agtaccctca agctcctcag

6481cagccccagg ctccccagta cccaacaaaa cctcagcagc cccagtaccc aacaaagcct

6541cagtctcctc agtaccctca agatcctaaa aatccaaatc ctcagaatcc tcctcttcat

6601cctccccctg ttaagagctg tgaggtgccc cgcgatgtga gagtcccatg tggagttcca

6661gacatctctc cttctgcatg cgatgccatt gactgctgtc atgatggcca agcctgctac

6721tttggaacag gaggtaagtg gtttctccag ctgctatgat cagaggcttt ttgtaaggtg

6781acggctgatc gtgcaatcgt cgatcccatc tatttcttct agcaaccgtt cagtgcacca

6841aggacggaca cttcatcgtt gtggtggcca aggatgtcac cttaccccat ctcgatcttg

6901aaactatttc acttttggga ccgggtcaag aatgtggagc tgttgactct aattcagctt

6961tcgccatcta ctactttccc gtcactcagt gcggcactca tgtcacggta acactcagtc

7021ttgtttatat cttatagtca taaggtcaat ctttgagatt ctatccttct tattgttaaa

7081ttttgaacca ttaaaaggaa gagcccgggg ttatagtcta tgaaaaccgg atgacatcct

7141catatgaagt tggagttgga ccgcttggag ctattaccag agacagctct tttgagtagg

7201tcatcatttg tgtttagtat caaacagatt tactaatgtc taactaatat ctatcagggg

7261taaacagaat catgcacagt gtattaacac agttcttttt ctcaggctcc tcttccagtg

7321cagataccat gcaacatctg ttgaaactct ggtcgtggaa gtgctgccag tggatagtcc

7381tctttccatt gctgagcttg gacccctcaa tgtgtacttg caaattgcca atggagtatg

7441tcagacaaag ggctgcgacg aaggtcagtg cacggcagtc tggcacagcc agtgtgtttg

7501tcaaacattt gaaaaagctg cctgtcgtaa cgtttgtttg ctcccacagt ggcggcagcc

7561tacacctctt tctacacgga tgccgactat cctgtgacca aagtactgag agaaccagtc

7621tatgtggacg ttcaaatcct tggcagaaca gatccaaatc tggttctgac tcttggacgc

7681tgttgggcaa ccacaagccc caatgctttc agtctgcccc agtgggacat tttgattgac

7741gggtaaaaaa aaaaaaatct accaattcat tccataaaga ccatttttgt tcaaactaag

7801ctccaaatct cacacttttt agccgaatta ctaaatatct aaccaaccat tacttcttct

7861ttaccttttt tccatccaga tgtccatatg aagatgatcg ctacctgtct gcgttggttc

7921caatcgattc ctcctctggt ttgccattcc caactcatca cagacgcttc ttattcaaga

7981tgtttacctt tgttgatcct cattcaatgg aaccactaag ggaaaaggtg ggtactgaat

8041tactcaagta gaggtttaac ttggcttcta acctgtactt ttctttcagg tgtacattca

8101ctgcagcaca gctgcatgcg ttccaggaca gggtaccagt tgtgaaccct catgcagcag

8161aagaagtagg gggctcattt ataaccgttc acatgttttt tttgttgttg taatgaccat

8221gtccactcat cattggccat gttttgtgtc tttttgtaga aggaagagat actgacgctg

8281tatccattag aacggatgaa agaaaggttg tggtatcgtc tggagaagtg ctcatggtgg

8341ccgaagctgc tggacagtct taactgtgaa ccgacagaag ctccagagtt cggaaaaaat

8401aacataacat tatgaaaatc tgtttcatca tggttcagaa ttaaatgcat aaagt

本发明的雌激素反应5′-调控核苷酸序列可以包括，但不限于SEQ IDNO：1所示omChgH基因的启动子区的任何序列。

在一个实施方式中，本发明适合的雌激素反应5′-调控核苷酸序列包含对应于如下所示SEQ ID NO.2的核苷酸序列：

ctcgtacctc caaaacccaa catattttgt ctataaaggt tgagcttaaa aatatatatt    60

ttttcaatta aaagaaaata actgaaaaac tggaatttaa tcttaaaact accaagaagt    120

tatctattta atcattatgt ttacattcaa gtcgtcttag ggccacaagg tacttagcct    180

ttgctgttat ttacaaagac gacaatttaa gtgtatgaag tgatctttat aaatcagtca    240

aatatatttt tttaaatgca ctcattcccc tttggcagca agttgtggcg aaaatccttt    300

ataatcttca aattacaagt atgaacaata ttgtttcctt taaaacaatt agcagtctaa    360

tcattttcta taatatgaaa gttcatatct tatgtagttg aaaagtgtgc tatttttgta    420

attgtatttc tttttatata ttttgcattt agtgaactac tgcattaact agcttgcaat    480

acttttcgca ttgtgtctct cataaaaaat atagatatgg ttatttaaaa aaatgcgttt    540

actcttaatt gttgcctttt ggagtaaaat tttatgcttt tgtctgtatt gcctttttga    600

cattcagaag aggatgcttc tgtatgacgg cgtattaagg ccttgagggt atcatgtctg    660

tggtgtgact gaatgattac attgatgctg ttttacactt tgaaaatcac catttgaaac    720

caagttttgt ctcacaattg catcaaacag aaaaaaaacc atcaaagcaa gctaattgaa    780

tgttgattgg tttaatccaa gtcattacag tttattccac ctgagtctag atgattctaa    840

cagattgttt gactgttgtc aaaatgatcc tacatgaatg caagtccaaa gcaagataaa    900

tgctctttct cttcaaatga tttgacatta atctttccct aaaatttatt attggtcata    960

atattgataa atctttgttt cgtgatgcat gagaccttat cacctaattt tgcagtaaag    1020

agagtcaact aaaaaatttt ctgacactct tttgttactt attatctcat gaaatccttt    1080

gtactgtttt gccttggggt ttttattgac taacatctct ttaatcacac ataattcaac    1140

tgttcataat tccaaatatg ttttagcttt tgttataacg atttaagtta cagcaatgtg    1200

ttttattttt ttctgtattt aactgaacta tgttgccctt ataaacagtt acatgtatgt    1260

aataggagtg gcctgatatt gccacacacc cctcatcgga tgctatgtca tggacaaata    1320

gctccactat atggtcaaac ataagtataa cttaagaaag taacagaaaa atttaattta    1380

aaaaaagttt tttttttttt ttgtcttttc catttcttta ttttatttat ttaaatccaa    1440

aaaaagtcaa atcctttact tctcggcaca taatttttca aacaatcttt ttaaataaaa    1500

ttattaatta aagcaaatat tcattcacaa aaaaaaactt ttagagtttg aaaaatgcga    1560

atttaaagtt gtattattat aatcaatatt gatttaagtt tacaaataga tttaaaaaaa    1620

aaatggaaat ctgctatgtt tccttgacag ccttcaaaag tttccttctg gaaaagttaa    1680

actgttgttt tgtgacggtg ttttttttta aacgctttgt ctggatcaat taaagcatag    1740

ttttttcaca tttgcggttt ttcacggaga gaggaagttt cctttattgt gtatcctgcc    1800

ctgagtacca gtgacattag agcctgtaac gtgtcaaata aagtgacaca gttggccaga    1860

tctaaagtct cggatgttgt gttctggtca aataaacata tgacaatgaa taaaagttga    1920

ggtcacatgg acattttgaa aagggctttt atgacctaga gtttgatttg tagataaacc    1980

cctttatgtc aaactgtcat caaacacaac cctgatccaa cagcgttacc ccttagctat    2040

cacagttcac tttgtaaatt tgtcacaaaa aatgggtcat aatcatcaaa atgaattata    2100

atttctaaga aattatagca tttagatatt gcaccttttt aaacacctca aaattactgg    2160

tttcttttct ttttattatt tctttagttt taagtttgtt ttgaaaatga tcttaatatt    2220

gcagcggagt agcacgtatt taactaaaat taaaactact aaccatgaac atttttcagc    2280

atttgtgtgg tttagttttt gtgacatgtt tgcatgtagt catattttga gtttttgagg    2340

tgctttttaa cagctttcag aagcagttta accatttaaa attaagaaaa ttcaagctca    2400

gattacactt ttcatattat cttagtttgt gaaaaaatag tattataata tattagaaga    2460

ctttcttcta cacaggacta cctgaggttt aaacaacact ttatcaactg agaggtagca    2520

ctgaaatatg tgcgctgcaa gttatttaat tgtttttttt tttttatttt ttagctcttg    2580

ctacctagaa acattgtaaa aaaaattact gaaactttac acattaattt tctgaagacc    2640

tcatcataat ccatgatgtt taacgggttt gaattgcact tatttttact gcatcataat    2700

taccacatcc actctattaa attctattcc aataccagag ttaaggctag agtttggtac    2760

actacgaccg atccacagtt atgcaacgta attctgagaa actatgagtc tcctttatta    2820

ttcctctatc aaaccagtgg tgaaggaagt attttaattt ttacttaaat aaaacttttc    2880

aacattaaac aattcaaatg tgtgtgcgtc tgtctgaatt catttaatta ttcgttaatt    2940

gattttctac acaattaata cttgcatatg ttttgctttt tttaaatgct aactttatta    3000

cattttctga ttggggctaa aaatcaactg gaaagaaaat ggtttttttt acacttcatt    3060

atgtcctgtt tggggttgct ggagcctgtc cgagttacct caggggaaaa gccagagtgc    3120

accctgaaca ttgagaggtc acacacagac acatccatcc atgttcttaa cctgctaaat    3180

cccttattaa gcatgatttt ggactgtctg aagaaaagcc aagcaagaac atgccaagtc    3240

cacgcaaaag ggtcccaacc atgctttcaa ccaggaccag cttactgtga ggtgagaccg    3300

ctaactactg caccacagtg cagcccatat ttagacttaa tgcaatatat tgtgttttgg    3360

ggaagaagct ggagagcctg gagggaacca gtgcatgggg aaaacataca aacctcacac    3420

agcaaggatc acatctgcct cagtatgtat ttttacagct tactgtaatt aaaaacagta    3480

aaaaaaaaaa aactaaaaaa aaaaacatca aattgccaca aaaagtacat gatttaaaaa    3540

aaggtttctg tctacatgtt tacatcttaa tttgatttaa aacactaaaa aatacataag    3600

attgccccca aaaaatgcaa ttataaaaag cacatgattt aaaaaaaaaa aggtatccgt    3660

acgtattttt agatcttaat ttggcttaaa cactaaaaaa tacattagat tgccaaaaaa    3720

tgcaattata aatatacatg ttttttaata aaagccatca gctgcacatg cattttggga    3780

aaaaaaggtt gtcttataga aaaagtccac atccattaca caatttaact gtttactttg    3840

aataaaaaca cattactgtg ctgctttatt attgctctca ctctatgggg ttcaaactaa    3900

tgtgtatttg tcatttttgt gctttgttta gtggatatct aacagtatgt caacagactg    3960

aaagggcaaa agaggtaatt acttcctaaa cagctaacat tagattgttt ctgtcatgga    4020

aaatgcatga aaacatactg caacaattta ttttaatgtt cattaagtgc taaggttttt    4080

aggattcttg aaatcctcaa attgatatgt tagcgacaca tatttgacta taatggtctt    4140

ctgttatttc attcatttat gtaacaaaaa caataacaca aaaatgtaca taacttttca    4200

tttactcgag acctattagt taaaaaaatg tggaggaatg agccttttct ttactacgtc    4260

gaaatataaa atttctgaga cataaatcaa ttataaatat acagtatatg gcctgattaa    4320

aaaaaagaaa aaaacttttc aactgatttt gtaatgcaga aaatcatgct tagcacaacc    4380

agagcattcg ccaacatata catttgatgt ggacatcatc ctaataacct catataaaag    4440

gttttttttg accaaaatgt gtacaatatg aggttttgtt gcagattcag ggaaaagatc    4500

actttgtttg tcattgccta ctatcaaaac aaacatttga ggacagataa gttcgagact    4560

gcaaagaccc tgaaaaggtc tccatgacct ggatgtcaca aaagcctttc attcattcca    4620

acgcaacgac ctgatctggc atttcacgca aaggacagaa tagtccacat gaattacata    4680

aaattgactt aacaaaacac accctgaagc gtttgtgatt gggagctact tggtttgaga    4740

ggtggagttt gaagagcatc aaaggtaaag acacataaat agagcaggag agggaaattt    4800

acacttaggg acccatcggg tcagacagct gtgggacc                            4838

SEQ ID NO：2所示的雌激素反应5′-调控核苷酸序列对应于SEQ ID NO：1所示omChgH基因5′-上游的4827个碱基对。SEQ ID NO：2中的碱基对4828-4838对应于SEQ ID NO：1所示omChgH基因的5′-非翻译区。

在一个实施方式中，本发明适合的雌激素反应5′-调控核苷酸序列包含对应于如下所示SEQ ID NO.3的核苷酸序列：

tttaggattc ttgaaatcct caaattgata tgttagcgac acatatttga ctataatggt    60

cttctgttat ttcattcatt tatgtaacaa aaacaataac acaaaaatgt acataacttt    120

tcatttactc gagacctatt agttaaaaaa atgtggagga atgagccttt tctttactac    180

gtcgaaatat aaaatttctg agacataaat caattataaa tatacagtat atggcctgat    240

taaaaaaaag aaaaaaactt ttcaactgat tttgtaatgc agaaaatcat gcttagcaca    300

accagagcat tcgccaacat atacatttga tgtggacatc atcctaataa cctcatataa    360

aaggtttttt ttgaccaaaa tgtgtacaat atgaggtttt gttgcagatt cagggaaaag    420

atcactttgt ttgtcattgc ctactatcaa aacaaacatt tgaggacaga taagttcgag    480

actgcaaaga ccctgaaaag gtctccatga cctggatgtc acaaaagcct ttcattcatt    540

ccaacgcaac gacctgatct ggcatttcac gcaaaggaca gaatagtcca catgaattac    600

ataaaattga cttaacaaaa cacaccctga agcgtttgtg attgggagct acttggtttg    660

agaggtggag tttgaagagc atcaaaggta aagacacata aatagagcag gagagggaaa    720

tttacactta gggacccatc gggtcagaca gctgtgggac c                        761

SEQ ID NO：3所示的雌激素反应5′-调控核苷酸序列对应于SEQ ID NO：1所示omChgH基因5′-上游的750个碱基对。SEQ ID NO：3中的碱基对751-761对应于SEQ ID NO：1所示omChgH基因的5′-非翻译区。

在一个实施方式中，本发明适合的雌激素反应5′-调控核苷酸序列包含对应于如下所示SEQ ID NO.4的核苷酸序列：

gttgcagatt cagggaaaag atcactttgt ttgtcattgc ctactatcaa aacaaacatt    60

tgaggacaga taagttcgag actgcaaaga ccctgaaaag gtctccatga cctggatgtc    120

acaaaagcct ttcattcatt ccaacgcaac gacctgatct ggcatttcac gcaaaggaca    180

gaatagtcca catgaattac ataaaattga cttaacaaaa cacaccctga agcgtttgtg    240

attgggagct acttggtttg agaggtggag tttgaagagc atcaaaggta aagacacata    300

aatagagcag gagagggaaa tttacactta gggacccatc gggtcagaca gctgtgggac    360

c                                                                    361

SEQ ID NO：4所示的雌激素反应5′-调控核苷酸序列对应于SEQ ID NO：1所示omChgH基因5′-上游的350个碱基对。SEQ ID NO：4中的碱基对351-361对应于SEQ ID NO：1所示omChgH基因的5′-非翻译区。

本发明的3′-调控区可包括，但不限于卵壳蛋白H 3′-非翻译区(表示为UTR)的卵壳蛋白H 3′-侧翼区。在一个实施方式中，适合的3′-调控区可包括GenBank登录号No.DQ778335的omChgH 3′-UTR，其对应于SEQ ID NO：5的核苷酸序列，如下所示：

ctgtgaaccg acagaagctc cagagttcgg aaaaaataac ataacattat gaaaatctgt    60

ttcatcatgg ttcagaatta aatgcataaa gtgaaaaatc tgttgcaggt gtttggaatg    120

tattgcaaaa acaaaacaag ttgatacata aaggtagcaa catttcttca catttcatgt    180

aaaaaaaaaa aaaaagtttc ttcacatcag tatagcaggt gtgtagatac agttgacaaa    240

atacaacact tccaccttaa tattctatat ggatcaaatg tgactgtttt cagtgaaacg    300

tcacgacaat aaagtcacat aatacatttc acttttacac aaatttttac tgtctgtttc    360

tgttcttaaa catacaagca ctgaaaacag agatgaatcc agtataacca aacaactcaa    420

acgacaataa aaaaaacaaa aaaattgttt tattatttta aaatgtttaa aaaaagttca    480

atttttaaat caaagtaggt caaccatttt taatactgga tcaacaaaca aaaacaatta    540

acaaaaaaaa tcagagttaa tggaaggtaa acacacacat ccgtgaagac aaaaacacaa    600

gattattatt taaaaactga actagacagc ttacttctca gaaatctgcg actgtaagga    660

aaactgtttt ccttgttgct ttcaatttgt aaaattgaaa gatgtcaata aataatttac    720

cctcttgcat tttgaaaaca attgtacttt cttggaagaa tatttggcat aaatgcatgt    780

ttacatgtgg atgtcgggtt tttaagcacc tgctatggtg agcttgggcc a             831

除非另有说明，可使用本领域技术人员能力范围之内的常规化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学技术来实施本发明。文献中有此类技术的详解。参见，例如J.Sambrook，E.F.Fritsch，and T.Maniatis，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Books 1-3，ColdSpring Harbor Laboratory Press；Ausubel，F.M.et al.(1995and periodicsupplements)Current Protocols in Molecular Biology，ch.9，13，and 16，JohnWiley & Sons，New York，N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree，and A.Kahn，1996，DNAIsolation and Sequencing：Essential Techniques，John Wiley & Sons J.M.Polakand James O’D.McGee，1990，In Situ Hybridization：Principles and Practice；Oxford University Press；M.J.Gait(Editor)，1984，Oligonucleotide Synthesis：APractical Approach，Irl Press；D.M.J.Lilley and J.E.Dahlberg，1992，Methodsof Enzymology：DNA Structure Part A：Synthesis and Physical Analysis of DNAMethods in Enzymology，Academic Press；Using Antibodies：A LaboratoryManual：Portable Protocol NO.I by Edward Harlow，David Lane，Ed Harlow(1999，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ISBN 0-87969-544-7)；Antibodies：A Laboratory Manual by Ed Harlow(Editor)，David Lane(Editor)(1988，ColdSpring Harbor Laboratory Press，ISBN 0-87969-3，4-2)，1855.Handbook of DrugScreening，edited by Ramakrishna Seethala，Prabhavathi B.Fernandes(2001，New York，N.Y.，Marcel Dekker，ISBN 0-8247-0562-9)；和Lab Ref：A Handbookof Recipes，Reagents，and Other Reference Tools for Use at the Bench，EditedJane Roskams and Linda Rodgers，2002，Cold Spring Harbor Laboratory，ISBN0-87969-630-3。上述各篇文献的全文通过引入并入本文。

术语“转化”是指将核酸片段转入宿主细胞的基因组，产生基因稳定的遗传。“宿主细胞”是由异源核酸分子已经转化的或能够转化的细胞。包含转化的核酸片段的宿主细胞被称作“转基因”细胞，而包含转基因细胞的生物体被称作“转基因生物”。

“转化(的)”、“转导(的)”、“转基因(的)”和“重组体”是指已引入异源核酸分子的宿主细胞和生物体。可将核酸分子稳定地整合到本领域公知的基因组中，公开于Sambrook和Russell的文献中，参见下文。还可参见Inniset al.(1995)；和Gelfand(1995)；和Innis and Gelfand(1999)。例如，“转化(的)”、“转化体”和“转基因”细胞已经历转化过程，并且包含整合到其染色体的外源基因。术语“未转化(的)”是指未经转化的正常细胞。

“转基因”生物是具有一个或多个包含表达载体的细胞的生物。

“基因改变的细胞”是指通过引入重组或异源核酸(例如，一个或多个DNA构建体或其RNA对应物)而被修饰的细胞，并且还包括保留了部分或全部所述基因修饰的此类细胞的后代。

本文所用术语“多核苷酸”、“核苷酸”和“核酸”互为同义词。“多核苷酸”通常是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未经修饰的RNA或DNA，或经修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于单链DNA和双链DNA、作为单链和双链区混合物的DNA、单链RNA和双链RNA，作为单链和双链区混合物的RNA、包含DNA和RNA(其可以是单链，或更常是双链，或单链和双链区的混合物)的杂交分子。此外，“多核苷酸”还指包含RNA或DNA或RNA和DNA的三链区。术语多核苷酸还包括包含一个或多个修饰碱基的DNA或RNA，以及带有出于稳定性或其他原因而修饰的骨架的DNA或RNA。“修饰(的)”碱基包括，例如三苯甲基化碱基和不常见的碱基，例如次黄嘌呤核苷。可对DNA和RNA进行各种修饰；因此，“多核苷酸”包括在自然中通常存在的化学、酶促或代谢修饰形式的多核苷酸，以及以病毒和细胞为特征的化学形式DNA和RNA。“多核苷酸”还包括相对较短的多核苷酸，通常被称作寡核苷酸。

本领域技术人员可以理解，由于遗传密码简并性的结果，大量不同的多核苷酸和核酸能够编码相同的多肽。此外，应理解，本领域技术人员可使用常规技术进行不影响本文所述多核苷酸编码的多肽序列的核苷酸取代，以反映待表达所述多肽的任何具体宿主生物体所使用的密码。

本文所述的多核苷酸可包括DNA或RNA。其可以是单链或双链。还可以是内含合成或修饰核苷酸的多核苷酸。本领域已知大量不同类型的寡核苷酸修饰。其包括膦酸甲酯和硫代磷酸酯骨架，在分子的3′和/或5′-端添加吖啶或多聚赖氨酸链。出于本发明的目的，应理解，可通过本领域的任何可用方法修饰本文所述的多核苷酸。可进行此类修饰以增强多核苷酸的体内活性或寿命。

多核苷酸为双链的情况下，双链的两条链，无论是单独的还是其组合均包含在本文所述的方法和组合物中。多核苷酸为单链的情况下，应理解，此多核苷酸的互补序列也包含在本发明之内。

与核苷酸序列相关的术语“变体”、“同源物”或“衍生物”包括对序列中一个(或多个)核苷酸的任何取代、改变、修饰、置换或缺失，或向序列中添加一个(或多个)核苷酸。

如上所述，关于序列同一性，“同源物”与序列表中所示的相关序列具有至少5％的同一性，至少10％的同一性，至少15％的同一性，至少20％的同一性，至少25％的同一性，至少30％的同一性，至少35％的同一性，至少40％的同一性，至少45％的同一性，至少50％的同一性，至少55％的同一性，至少60％的同一性，至少65％的同一性，至少70％的同一性，至少75％的同一性，至少80％的同一性，至少85％的同一性，至少90％的同一性或至少95％的同一性。

具体地，为至少95％的同一性，更具体为至少96％的同一性，更具体为至少97％的同一性，更具体为至少98％的同一性，更具体为至少99％的同一性。可使用本领域公知的技术进行核苷酸同源性比较。一个适合的序列比较程序是本领域公知的GCG Wisconsin Bestfit程序。默认的打分矩阵对每个相同的核苷酸给出10分的匹配值，对每个错配给出-9分。默认的空位产生的罚分为-50分，默认的空位延伸罚分为每个核苷酸-3分。本领域已知如何计算序列同一性的各种其他方法。

在一个实施方式中，本发明的雌激素反应5′-调控核苷酸序列与对应于SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的序列具有至少98.1％或更高的序列同一性。具体地，所述雌激素反应5′-调控核苷酸序列与对应于SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的序列具有98.2％或更高，98.3％或更高，98.4％或更高，98.5％或更高，98.6％或更高，98.7％或更高，98.8％或更高，98.9％或更高，99.0％或更高，99.1％或更高，99.2％或更高，99.3％或更高，99.4％或更高，99.5％或更高，99.6％或更高，99.7％或更高，99.8％或更高，99.9％或更高的序列同一性。

在涉及生产和检测本发明转基因鱼的方法中，可使用聚合酶链式反应(PCR)。已知的PCR方法包括，但不限于使用成对引物、套式引物、单特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物和部分错配引物等的方法。

一方面，本发明还涉及用于生产本发明转基因鱼的表达盒。本发明的表达盒包含以下：(i)编码报告蛋白的报告核苷酸序列；(ii)从青鳉鱼分离的雌激素反应5′-调控核苷酸序列，其中所述调控核苷酸序列可操作地连接到所述报告核苷酸序列的5′端，以在雌激素或雌激素样化合物存在下诱导报告蛋白表达；和(iii)可操作地连接到所述报告核苷酸序列3′端的3′-调控区。

在一个实施方式中，本发明的表达盒包含从黑点青鳉分离的5′-调控核苷酸序列。例如，5′-调控核苷酸序列可源自黑点青鳉卵壳蛋白H基因的启动子区域，其中所述卵壳蛋白H基因具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列。

在一个实施方式中，本发明的表达盒可包含源自黑点青鳉卵壳蛋白H基因的启动子区，其中所述核苷酸序列对应于(i)SEQ ID NO：2(对应于omChgH5’-上游区域的-4827bp)；(ii)SEQ ID NO：3(对应于omChgH5’-上游区域的-750bp)；和(iii)SEQ ID NO：4(对应于omChgH5’-上游区域的-350bp)。

在另一个实施方式中，本发明的表达盒的报告核苷酸序列编码自体荧光蛋白的报告蛋白。自体荧光蛋白的适合实例可包括，但不限于增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、绿色荧光蛋白(GFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和红色荧光蛋白(RFP)等。

在一个实施方式中，本发明的表达盒可包含含有mRNA聚腺苷酸化信号的3′-调控区。适合的mRNA聚腺苷酸化信号可包括，但不限于青鳉鱼(例如，黑点青鳉和日本青鳉)卵壳蛋白H基因的3′-侧翼区。具体地，mRNA聚腺苷酸化信号可包括，但不限于含有卵壳蛋白H基因的3’-UTR(非翻译区)和聚腺苷酸尾序列的卵壳蛋白H基因的3′-侧翼区。更具体地，3′-调控区可包括SEQ IDNO：5的核苷酸序列。

本发明还涉及包含本发明表达盒的转化载体。

本发明还涉及由本发明表达盒转导的宿主细胞。

本发明还涉及水生动物的转基因细胞，其中所述转基因细胞包括至少一个本发明的表达盒。如本文所述，转基因细胞可以是来自淡水、咸水和半咸水鱼的水生动物。本文中讨论了此类鱼的适合的实例，包括例如青鳉种和鲤种。

本发明还涉及包含至少一个本发明表达盒的转基因鱼。当与包含雌激素或雌激素样化合物的液体介质接触时，本发明的转基因鱼表现出可观测的标记。所述可观测的标记包括由所述至少一个表达盒表达的报告蛋白。所述可观测的标记是在体内或体外可见的。转基因鱼可以是淡水、咸水或半咸水鱼。如上所述，本文中讨论了此类鱼的适合的实例，其包括例如青鳉种和鲤种。在具体实施方式中，所述转基因鱼处于包括但不限于胚胎阶段、幼体阶段和/或成体阶段的发育阶段。更具体地，所述转基因鱼可以是雄性成体鱼。

本发明的“表达盒”也可被称作“重组构建体”。本领域中公知重组构建体包含与报告序列可操作连接的表达控制序列(例如雌激素反应5′-调控核苷酸序列)。这意味着将包含目标表达控制序列的多核苷酸克隆到重复构建体中，由此使表达控制序列与报告序列可操作地连接。具体地，所述报告子是异源序列。

用于制备重组构建体的方法是常规方法。此类方法以及与本发明组合使用的很多其他分子生物学方法描述于，例如Sambrook，et al.(1989)，MolecularCloning，a Laboratory Manual，Cold Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.；Ausubel et al.(1995)；Current Protocols in Molecular Biology，N.Y.，John Wiley & Sons Davis et al.(1986)，Basic Methods in Molecular Biology，Elseveir Sciences Publishing，，Inc.，New York；Hames et al.(1985)，Nucleic AcidHybridization，IL Press；Dracopoli et al.Current Protocols in Human Genetics，John Wiley & Sons，Inc.；和Coligan et al.Current Protocols in Protein Science，John Wiley & Sons，Inc。

适合的报告序列对于本领域技术人员而言是显而易见的。例如，适合的报告蛋白可包括自体荧光蛋白和可通过组织化学方法检测的酶。

如上文所述，荧光蛋白可包括，但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、红色荧光蛋白(CFP和Red FP，RFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、黄色荧光蛋白(YFP)，和这些蛋白的荧光变体。异源荧光基因可以是，例如编码DsRed2、ZsGreen1和ZsYellow1的基因。异源荧光基因也可以是这些基因的任何变体或突变体，其编码的荧光蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)、青色荧光蛋白(CFP)和增强型青色荧光蛋白(ECFP)。

根据另一个实施方式，所述可通过组织化学方法检测的酶选自由荧光素酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、碱性磷酸酶、氯霉素乙酰基转移酶和醇脱氢酶组成的组。根据具体实施方式，其为荧光素酶。术语“荧光素酶”是指在所谓荧光素底物存在下催化或启动生物荧光反应的所有蛋白质。本发明的荧光素酶可来自产生生物荧光的很多生物体或系统(参见美国专利No.6,152,358)。例如，本发明的荧光素酶可来自花虫(Renilla)(美国专利No.5,418,155和美国专利No.5,292,658)，或来自北美萤火虫(Rhotinus pyralis)或源氏萤(Luciola cruciata)(美国专利No.4,968,613)。

用于检测报告蛋白的技术，无论其为直接的(例如，通过测量报告mRNA的量)还是间接的(例如，通过测量报告蛋白的量和/或活性)，都是常规技术。这些方法和分析技术中的很多都可以在例如以下的参考文献中找到：CurrentProtocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel et al.，eds.，(a joint venturebetween Greene Publishing Associates，Inc.and John Wiley & Sons，Inc.)，Enzyme Immunoassay，Maggio，ed.(CRC Press，Boca Raton，1980)；LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology，T.S.Work and E.Work，eds.(Elsevier Science Publishers B.V.，Amsterdam，1985)；Principles and Practice ofImmunoassays，Price and Newman，eds.(Stockton Press，NY，1991)等。

例如，可通过聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、Qβ-复制酶扩增、基于核酸序列的扩增(NASBA)和其他转录介导的扩增技术；差异显示技术；RNA印迹分析、酶联试验和微阵列等测定核酸表达的变化。这些技术的实例可见于，例如PCR Protocols A Guide to Methods and Applications(Innis et al.，eds，Academic Press Inc.San Diego，Calif.(1990))。

在具体实施方式中，测量报告表达产物(例如，蛋白质)的量和/或活性。可通过检测其在细胞中(例如黑点青鳉鱼胚胎中)的荧光测定荧光标记，例如EGFP。例如，可在荧光显微镜下观察荧光。优选可直接检测而无需添加外源因子的报告子，例如EGFP，以用于检测或评估基因在鱼胚胎发育期间的表达。携带本发明编码EGFP报告子的重组构建体的转基因鱼胚胎可提供快速实时体内系统，该系统用于分析受发育调控的肝基因的时空表达模式以及用于测定雌激素化合物的存在。

可将本发明的重组构建体克隆到适合的载体中。随后，可将载体用于，例如增殖所述重组构建体。一般地，在将本发明的重组构建体引入到鱼胚胎之前，需要除去载体序列。优选设计载体/构建体，从而可使用一种或两种适合的限制性酶切除重组构建体。

大量适合的载体对本领域技术人员而言都是已知的，并且很多可以商购获得。例如，可提供以下载体：(i)细菌载体，包括pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pBluescript SK、pBSKS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、pTRC99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)；和(ii)真核载体，包括pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT 1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。然而，只要能够在宿主中复制并存活，也可使用任何其他质粒或载体。

一方面，本发明提供了用于检测本发明的雌激素反应5′-调控核苷酸序列在细胞中的启动子活性的方法。该方法可通过将重组构建体引入真核细胞，并检测报告序列在所述细胞中的存在和/或活性来在真核细胞中进行。可使用各种真核细胞，适合的细胞对本领域技术人员而言是显而易见的。在具体实施方式中，报告序列编码EGFP，且所述真核细胞在鱼，例如黑点青鳉鱼中，或来自鱼，例如黑点青鳉鱼，或者在黑点青鳉鱼胚胎中，或来自黑点青鳉鱼胚胎。

可使用很多本领域熟知的方法将多核苷酸，例如本发明的构建体，引入到细胞中。可使用的常规方法包括，例如转染(例如，通过DEAE-Dextran或磷酸钙沉淀介导)，通过病毒载体感染(例如，逆转录酶病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、假型逆转录病毒或痘病毒载体)，注射例如微注射，电穿孔，声致穿孔，基因枪，脂质体递送(例如，5

(GIBCO-BRL，Inc.，Gaithersburg，Md.)、

(Qiagen，Inc.Hilden，德国)和

(Promega Biotec，Inc.，Madison，Wis.)或根据本领域标准方法开发的其他脂质体)，或受体介导的摄取和其他内吞机制。

本文中其他部分更详细地讨论了将重组构建体引入鱼胚胎的方法。

本文所用的“转基因鱼”是指已经引入了外源重组构建体的鱼，或鱼的后代。已引入构建体的鱼包括已从已引入构建体的胚胎细胞发育成的鱼。本文所用外源构建体是人工引入或最初人工引入动物中的核酸。术语人工引入旨在排除通过正常的繁殖或遗传交叉引入构建体。也就是说，旨在排除最初通过杂交向动物系或株中引入基因或特性。

然而，通过正常繁育将外源构建体从包含此构建体的鱼转移而产生的鱼被认为包含外源构建体。此类鱼是已经引入了外源构建体的鱼的后代。本文所用的鱼的后代，是指通过有性繁殖或克隆从所述鱼传代而来，并且继承了遗传物质的任何鱼。在本文中，克隆是指从鱼的DNA、一个或多个细胞产生遗传上相同的鱼。传代产生其他鱼的鱼被称作首代鱼。在本文中，从一个或多个细胞(例如胚胎细胞)到鱼的发育或者一个或多个细胞发育成鱼是指受精卵细胞或胚胎细胞(或其后代)通过生长、分裂和分化成为成体鱼的发育过程。

在一个实施方式中，本发明的转基因鱼是其体细胞和生殖细胞包含至少一个拷贝基因组整合的本发明重组构建体的鱼。本发明还提供了转基因鱼配子，包括转基因鱼卵或精子细胞、转基因鱼胚胎和任何其他类型的转基因鱼细胞或细胞簇，无论其为单倍体、双倍体、三倍体或具有至少一个拷贝基因组整合的本发明重组构建体的其他接合子型(zygosity)。

本文所用术语“胚胎”包括生物体的单细胞受精卵(即合子)阶段。具体地，将重组构建体整合到鱼的体细胞或生殖细胞，从而使其稳定且能够遗传(通过生殖系稳定遗传)。转基因鱼或鱼细胞优选包含多拷贝基因组整合的构建体；更具体地，将多拷贝的构建体以连续的头尾朝向整合到宿主生物体的基因组中。

包含至少一个拷贝基因组整合的构建体的转基因鱼后代，以及从本发明的转基因鱼卵、精子、胚胎或其他鱼细胞衍生而来的转基因鱼也包含在本发明的范围内。如果转基因鱼卵、精子细胞、胚胎或其他细胞向鱼基因组DNA提供了DNA，则所述鱼是从转基因鱼卵、精子、胚胎或其他细胞衍生而来的。例如，本发明的转基因胚胎能够发育成本发明的转基因鱼；本发明的转基因卵可通过受精产生本发明的转基因胚胎，再发育成本发明的转基因鱼；本发明的转基因精子细胞可用于卵的受精以产生本发明的转基因胚胎，再发育成本发明的转基因鱼；和本发明的转基因细胞可用于克隆本发明的转基因鱼。在本发明的一些实施方式中，所述转基因鱼是不育的。本发明还包括从本发明的转基因鱼胚胎或其他转基因鱼细胞衍生而来的细胞系，其包含至少一个拷贝的本发明的重组构建体。分离并繁育此类细胞的方法是常规方法。

在一个实施方式中，通过将本发明的重组构建体引入鱼细胞，特别是引入胚胎细胞，更具体地引入单细胞胚胎，由此生产本发明公开的转基因鱼。将转基因构建体引入胚胎细胞的情况下，通过使胚胎发育成鱼获得转基因鱼。构建体向鱼胚胎细胞的引入以及随后鱼的发育通过胚胎在亲鱼体外发育这一事实来简化。

合的技术将本文公开的重组构建体引入胚胎鱼细胞中。已经在鱼和其他动物内证实了用于引入外源遗传物质的很多技术。这些包括微注射(描述于例如，Culp et al.(1991)Proc Natl Acad Sci USA 88，7953-7957)、电穿孔(描述于例如，Inoue et al.(1990)，Cell.Differ.Develop.29，123-128；Muller et al.(1993)，FEBS Lett.324，27-32；Murakami et al.(1994)，J.10Biotechnol.34，35-42；Muller et al.(1992)，Mol.Mar.Biol.Biotechnol.1，276-281；和Symonds etal.(1994)，Aquaculture 119，313-327)、粒子枪轰击(Zelenin et al.(1991)，FEBSLett.287，118-120)、逆转录病毒(Lu et al(1997).Mol Mar Biol Biotechnol 6，289-95)和脂质体的应用(Szelei et al.(1994)，Transgenic Res.3，116-119)。

通常可通过产卵后立即收集卵来获得胚胎或胚胎细胞。通常优选在收集前或收集时使卵受精。具体地，这通过将雄鱼和雌鱼放置在同一缸中，从而在刺激交配的条件下收集卵来完成。收集卵后，一个技术是通过除去卵壳而暴露胚胎，从而引入遗传物质。这可以通过手工完成，具体地，通过使用蛋白酶例如链霉蛋白酶来完成。在首次细胞分裂之前的受精卵细胞被认为是单细胞胚胎，因此，将受精卵细胞视为胚胎细胞。

在引入转基因构建体后，使胚胎发育成鱼。这通常只需要将胚胎在与用于卵孵化相同的条件下孵化。然而，也可将胚胎细胞在等渗缓冲液中快速孵化。如果需要，可在胚胎发育期间观察引入的转基因构建体的表达。

可通过任何适合的手段鉴定携带转基因的鱼。例如，可探测可能的转基因鱼的基因组以确定构建体序列的存在。为了鉴定实际表达转基因的转基因鱼，可分析是否存在表达产物。用于此类鉴定的多个技术是已知的，并可用于转基因动物，并且其中大部分可用于转基因鱼。可通过DNA或RNA印迹来完成对可能或真实转基因鱼的转基因构建体中存在的或特征在于转基因构建体的核酸序列的探测。此外，可使用聚合酶链式反应(PCR)或其他序列特异性核酸扩增技术完成检测。

在鉴定出“首代(founder)”转基因鱼后，可以使其与野生型鱼交配，以鉴定出其生殖细胞中包含转基因的那些鱼。本发明的转基因鱼可以是雄鱼或雌鱼。本发明的转基因鱼可以是转基因的半合子，其是用于维持转基因鱼系的特殊状态。或者，也可以使半合子鱼相互杂交，以产生纯合鱼或鱼系。也可通过其他方法产生纯合二倍体，例如使用弗氏压碎器通过静水压力中断第二次减数分裂。

可将本文公开的重组构建体整合到鱼的基因组中。然而，也可将本文公开的转基因构建体构建成人工染色体。含有200kb以上的此类人工染色体已在多种生物中使用。人工染色体也可用于向鱼中引入非常大的转基因构建体。该技术是有用的，在于其可以真实再现基因的表达模式，其中所述基因的调控元件与编码序列相隔多个kb。

在另一个实施方式中，本发明包括基因组相同的转基因鱼群体，其中这些转基因鱼的体细胞和生殖细胞各包含至少一个拷贝基因组整合的本发明重组构建体。基因组相同的群体是单性群体，并且可以是雄性或雌性。基因组相同的转基因鱼群体的具体实施方式基本上如对于本发明的转基因鱼所描述的。在另一个实施方式中，本发明包括转基因鱼群体，即自交系，其成员不必具有相同的基因组，但关于基因组整合的构建体方面为纯合的。

本发明还涉及使用本发明转基因鱼的各种方法。在具体实施方式中，这些方法涉及检测介质，特别是液体介质中是否存在雌激素化合物。更具体地，此类方法基于报告基因(本文中也称作报告核苷酸序列)的诱导表达，其中所述报告基因可操作地连接到本发明雌激素反应5′-调控核苷酸序列(如本发明其他部分所述)。通常，当本发明的转基因鱼接触雌激素化合物时，雌激素反应5′-调控核苷酸序列将诱导报告基因的表达。报告基因的表达导致所述转基因鱼出现可观察到的标记，表明雌激素化合物的存在。本文所用“雌激素化合物或物质”是指雌激素或任何雌激素样化合物或物质。

本文所用“液体介质”可指多种不同的液体。例如，其可包括已添加了目标测试物质的液体或水样品。其还可包括未添加目标测试物质的液体或水样品。适合用于本发明方法的液体介质的具体实例可包括来自任何液体或水源(例如，河流、湖泊、海湾、池塘、溪流、海洋等)的淡水、半咸水和咸水，无论这些来源是天然的还是人造的。

使用本发明转基因鱼的多种方法中的一些在下文中概括性地提供，并在本文实施例部分更详细地提供。

本发明的一个方法涉及筛选液体介质中雌激素物质的方法。此方法包括使本发明的转基因鱼接触待测(即用于检测雌激素物质存在)的液体介质。在此接触步骤后，此方法包括检测所述转基因鱼是否表现出通过诱导(包含在所述转基因鱼中的)报告基因表达所产生的可观测的标记。可观测的标记的存在表明所述液体介质包含雌激素物质。

在此方法的一个实施方式中，所述测定步骤可包括体内自体荧光显微镜检查，其中所述报告基因编码自体荧光报告蛋白。

在此方法的另一个实施方式中，此方法可进一步包括对根据测定步骤鉴定为雌激素物质的测试物质的雌激素样活性进行量化，其中，如果所述转基因鱼表现出可观测的标记，则将所述测试物质鉴定为雌激素物质。

在此方法的另一个实施方式中，所述量化步骤包括(i)产生所述可观测的标记的至少一副图像；和(ii)使用图像分析软件处理所述可观测的标记的至少一副图像，以量化所述可观测的标记的信号强度。

本发明的另一个方法涉及筛选具有抗雌激素活性的化合物的方法。此方法包括以下步骤：(a)提供本发明的第一转基因鱼和第二转基因鱼，其中所述第一转基因鱼和第二转基因鱼为相同的种，并且处于基本相同的发育阶段；(b)使所述第一转基因鱼接触第一液体介质，其中所述第一液体介质包含雌激素或雌激素样化合物；(c)使所述第二转基因鱼接触第二液体介质，其中所述第二液体介质包含第一液体介质和测试化合物；和(d)将所述第一转基因鱼表现出的任何可观测的标记的定量强度与所述第二转基因鱼表现出的任何可观测的标记的定量强度进行比较，其中与所述第一转基因鱼中可观测的标记的定量强度相比，所述第二转基因鱼中可观测的标记的定量强度下降表明所述测试化合物具有抗雌激素活性。

本发明的另一个方法涉及用于研究雌激素化合物对肝脏再生的影响的方法。总体而言，此方法包括：对本发明的成体转基因鱼进行部分肝切除，其中所述部分肝切除是有效去除所述转基因鱼的部分肝脏；使所述转基因鱼接触包含测试雌激素化合物的测试液体介质；和分析所述转基因鱼的肝脏以检测肝组织的任何再生。

在此方法的一个实施方式中，所述分析步骤可包括比较取自以下阶段的转基因鱼的肝脏再生参数：(i)部分肝切除之前；(ii)部分肝切除之后且在接触步骤之前；和(iii)部分肝切除之后且在接触步骤之后。适合的肝脏再生参数可包括，但不限于肝脏体积、肝脏形状、肝脏重量和/或肝脏重量与体重的比例。一方面，测定转基因鱼表现出的可观测的标记的存在和/或强度有效地辅助肝脏再生参数的测量。在具体实施方式中，使用共聚焦显微镜并结合图像分析软件，通过产生肝脏的三维图像测量肝脏形状和肝脏体积。

与研究单一的雌激素化合物相反，本发明的另一方法涉及用于研究不同雌激素化合物对肝脏再生的影响的方法。总体而言，此方法包括以下步骤：(a)提供本发明的第一转基因鱼和第二转基因鱼，其中所述第一转基因鱼和第二转基因鱼为相同种的成体鱼；(b)使所述第一转基因鱼接触包含第一测试雌激素化合物溶液的第一液体介质；(c)使所述第二转基因鱼接触包含第二测试雌激素化合物溶液的第二液体介质；(d)量化所述第一转基因鱼和所述第二转基因鱼表现出的任何可观测的标记的强度；(e)对所述第一转基因鱼和第二转基因鱼进行部分肝切除，其中所述部分肝切除是有效地去除所述第一转基因鱼和第二转基因鱼的部分肝脏；(f)重复此方法的步骤(b)到步骤(d)；和(g)分析所述第一转基因鱼和第二转基因鱼的肝脏以比较所述第一液体介质和所述第二液体介质中包含的雌激素化合物对肝组织的任何再生的影响。

在此方法的一个实施方式中，所述分析步骤可包括比较取自以下阶段的转基因鱼的肝脏再生参数：(i)部分肝切除之前；(ii)部分肝切除之后且在接触步骤之前；和(iii)部分肝切除之后且在接触步骤之后。适合的肝再生参数可包括，但不限于肝脏体积、肝脏形状、肝脏重量和/或肝脏重量与体重的比例。一方面，测定转基因鱼表现出的可观测的标记的存在和/或强度有效地辅助肝脏再生参数的测量。在具体实施方式中，使用共聚焦显微镜并结合图像分析软件，通过产生肝脏的三维图像测量肝脏形状和肝脏体积。

在此方法的另一个实施方式中，此方法可进一步包括将表现出可观测的标记的肝细胞与未表现出可观测的标记的其他肝细胞分离，其中使用流式细胞计进行分离。

在此方法的另一个实施方式中，此方法可进一步包括对所述第一转基因鱼和第二转基因鱼的肝脏进行肝细胞代谢组学和蛋白质组学分析。

下文给出了本发明各个方面的具体实施方式，其中一些方面已在上文进行了一般性的描述。

克隆源自黑点青鳉的卵壳蛋白H基因

在本发明的具体实施方式中，用于克隆卵壳蛋白H基因(omChgH)的青鳉鱼和用于引入构建的转基因的青鳉鱼没有特别的限制，只要它们属于黑点青鳉(别名恒河青鳉)种即可。本发明的这一实施方式中使用的黑点青鳉鱼来自于台湾的商业孵化场。所得的黑点青鳉鱼可以在淡水、半咸水以及海水中养殖。在本发明的此实施方式中，将鱼养殖在28±1℃，14小时-光/8小时-暗的恒定光周期下的30ppt人造海水中，并饲喂商购的无激素片状食物和卤虫(Artemia salina)。

根据厂商对基因组步移试剂盒(the genome walking kit，BD Biosciences)的说明，在Dra I和EcoR V基因组DNA文库中进行顺次基因组步移后，捕获了在本发明此实施方式中使用的源自黑点青鳉的雌激素反应卵壳蛋白H基因启动子区。

在本发明此实施方式中，卵壳蛋白H 3′-侧翼区包括卵壳蛋白H 3′-非翻译区(表示为UTR)，并且分离了部分下游染色体DNA序列。为了克隆3′-UTR下游基因组序列，鉴定了卵壳蛋白H的外显子-内含子结构。使用反向PCR(聚合酶链式反应)分离卵壳蛋白H 3′-下游基因组核苷酸。分离了从转录终点起约800bp的卵壳蛋白H 3′-侧翼区序列，并保藏在GenBank，登录号为No.DQ778335。

转基因质粒的构建

在本发明的一个实施方式中，将通过上文所述的方法克隆的源自黑点青鳉的卵壳蛋白H启动子区、EGFP cDNA序列(即报告核苷酸序列)和通过上文所述方法克隆的源自黑点青鳉的卵壳蛋白H 3′-侧翼区或其他基因的聚腺苷酸化信号引入载体中。可根据已知的遗传工程方法将这些核苷酸序列引入到载体中。这样，可以构建出插入了与EGFP编码区相连的源自黑点青鳉的卵壳蛋白H启动子区的重组载体。

在本发明的这个和其他实施方式中，只要可操作地插入了启动子序列、编码序列和聚腺苷酸化信号序列，对要使用的载体没有特别的限制。

转基因黑点青鳉鱼的生产

在本发明的一个实施方式中，将如上构建的重组转基因质粒线性化，并转入黑点青鳉受精卵的细胞质中，从而制备能够如同其内源omChgH启动子一样，在插入的omChgH启动子的调控下以雌激素依赖性的方式表达EGFP的转基因黑点青鳉鱼。作为在本发明的这个和其他实施方式中要转化的黑点青鳉受精卵，使用受精后半小时之内的单细胞阶段的胚胎。可通过微注射的方式将重组转基因序列转入单细胞的受精卵种。

为了获得单细胞阶段的黑点青鳉卵，可在进行微注射的前一天使用交配缸系统分离雄鱼和雌鱼。在进行微注射前从交配缸抽出隔板，释放雄鱼和雌鱼以进行交配。在本发明的实施方式中，将经微注射的受精卵在28±1℃下培养2-3个月，直至其发育成为成体鱼。

可通过以下方法筛选其基因组中整合了引入基因的成体鱼。第一种方法：使成体鱼与野生鱼交配，并从其卵中提取DNA。随后，使用EGFP特异性引物进行PCR扩增提取的DNA，并对扩增产物进行电泳。第二种方法，使成体鱼与野生鱼交配。使其卵孵化，随后接触雌激素或雌激素样化合物物质过夜或更长时间。随后，在装配GFP过滤器的荧光显微镜下检查这些幼体的肝脏中是否有GFP表达。通过这两种方法可成功地鉴别出生殖细胞(精子或卵)的基因组中整合了引入核苷酸序列的黑点青鳉鱼。

随后，使生殖细胞的基因组中整合了引入核苷酸序列的黑点青鳉鱼与野生型鱼交配。其后代继承了引入的核苷酸序列，并且可以通过上述两种方法筛选引入的核苷酸序列。该鱼可将转基因从一代传递至下一代。此类鱼包括含本发明期望的转基因黑点青鳉鱼。

在没有任何处理的情况下，转基因黑点青鳉中引入的EGFP的表达局限于合成高浓度雌激素的繁殖雌鱼的肝脏，而在胚胎、幼体和雄鱼的肝脏没有观察到EGFP表达。然而，当转基因黑点青鳉鱼接触雌激素或雌激素样化学物质时，也可在胚胎、幼体和雄鱼的肝脏中诱导EGFP转基因表达。引入的EGFP的表达谱与omChgH在此黑点青鳉中的内源表达谱一致(X.Chen et al.Ectoxicol.Environ.Sa f.71：200-208(2008))，区别在于omChgH蛋白是分泌蛋白，其在肝脏中合成后将通过血液循环转运到卵巢，而EGFP不是分泌蛋白，其合成后将留在肝脏。由于转基因黑点雌青鳉鱼在没有外界诱导的情况下表达EGFP，因此优选使用不表达EGFP的转基因黑点青鳉鱼胚胎、幼体和雄鱼检测雌激素样活性。

由于黑点青鳉鱼在胚胎和幼体早期的高度透明性，可使用荧光显微镜容易地在体观察转基因黑点青鳉鱼在这些阶段中对雌激素或雌激素样物质的反应。最透明的早期幼体阶段(受精后15天之前)是用于测试体内雌激素样活性的特别好的阶段。此外，如果将经雌激素或雌激素样化学品处理的转基因黑点青鳉鱼转移到净水中，所诱导的GFP信号将在约1周内逐渐消失，并且如果将鱼放回到包含雌激素或雌激素样化学物质的溶液中，可以重新诱导出EGFP。

检测雌激素样活性的方法

在本发明的一个实施方式中，关于测试水样中是否存在雌激素或雌激素样物质，其可通过使本发明的转基因黑点青鳉鱼接触测试水样一段时间，随后在荧光显微镜下观察所接触的转基因鱼来观察是否诱导了EGFP在肝脏中的表达，从而容易地测定。

本文所用“测试水样”可以是，但不限于从环境中收集的水(例如，河流、河口、半咸水等)，其可包含一种或多于一种的雌激素样物质，或者是添加了一种物质(例如药物、化妆品、食品等)的水，其可包含雌激素或雌激素样物质，或者添加了一种或不止一种待测化学品的水，其可分别或组合地发挥如雌激素的作用。

当检测可能的雌激素化学品或混合物时，在本发明的一个实施方式中，由于每种化学物质具有不同的毒性和可能的雌激素样活性，因此可在一系列浓度下进行测试；此外，包含接触已知浓度的雌激素(E2)以作为测量雌激素样活性和计算测试化学物质雌激素等效性的参考，也是适合且有用的。使转基因黑点青鳉鱼接触测试水样1-2天对于大多数样品是足够长的。接触条件可以是与培养黑点青鳉鱼的条件相同。

此方法的一个优点在于可通过测量肝脏中诱导的EGFP信号的强度量化测试水样的雌激素样活性。在接触恰当的时间后，接触雌激素样活性不同的测试水样的鱼将在肝脏中表达不同量的EGFP，可以通过荧光显微镜下的观察简单地分别出所述不同量的EGFP。在一个实施方式中，为了量化诱导的EGFP信号，可使用与荧光显微镜相连的照相机记录表达EGFP的肝脏的荧光图像，并且可以通过图像分析软件分析肝脏区域的EGFP信号强度。在还包含接触已知浓度的雌激素作为对照时，可将测试水样的雌激素样活性转化成雌激素功效的等价物。

由于本发明的转基因黑点青鳉鱼的实施方式可被用于容易地检测测试水样的雌激素样活性，因此此方法可被用于快速筛选潜在的雌激素化学物质，以及评估化学混合物的组合雌激素样活性。当单独或组合测试化学物质时，可预测化学物质的作用方式。例如，一些化学物质可发挥雌激素作用，而另一些则发挥抗雌激素作用。当作用模式相同，例如雌激素模式的化学物质在一起测试时，其总雌激素样活性将高于其中任何一种单独的活性。然而，当雌激素和抗雌激素化学物质混合在一起时，混合物的最终雌激素样活性将低于雌激素化学物质的活性。

转基因黑点青鳉鱼检测系统的优点

本发明的各个方面提供了很多优点。下文描述了其中一些优点，但这些描述并不意味着包含了所有的优点。

首先，使用本发明的转基因鱼检测雌激素试剂或事件有很多优点。水环境是天然和人造化学品的最终接收器(J.P.Sumpter，Toxicol.Lett.102-103：337-342(1998))。水中鱼抑制是用于水环境健康风险评估的环境相关模型。尽管鱼和人之间存在进化距离，但大部分发育途径、生理机制和器官系统都是鱼和人共有的(A.R.Cossins and D.L.Crawford，Nature Rev.Genet.6：324-333(2005))；因此，鱼在毒物学、发育学和生物医学研究领域占有主要地位。鱼易于掌控、操作和观察，并且越来越多地作为可选的非哺乳动物模型以减少或替代研究和测试中使用的传统哺乳动物模型。鱼，特别是小型鱼，例如日本青鳉(Oryzias latipes)和斑马鱼(Danio rerio)已经在不同研究领域中作为实验室模型物种得到广泛使用。这两种水生鱼模型具有的优点，促使人们完成了其基因组的完整测序(E.Ekker et al.，Zebrafish 4，239-251(2003)；M.Kasahara et al.，Nature，447：714-719(2007))，并且建立了用于这两种研究模型的大量转基因鱼株，其中多个转基因鱼株的目的与本发明相同是用于检测雌激素样活性：(T.Kawamura，Zoolog.Sci.19(2)：1355-1361(2002)；T.Ueno et al.，Mech.Dev.121(7-8)：803-15(2004)；K.Krauchi et al.，Environ.Sci.Technol.39(8)：2762-8(2005)；Z.Zeng et al.，Environ.Sci.Technol.39(22)：9001-8(2005)；T.Hano et al.，Environ.Sci.Technol.41(4)：1473-9(2007)；M.A.Salam et al.，JEnviron Sci Health A Tox Hazard Subst Environ Eng.43(3)：272-7(2008)；J.Legler et al.，Environ.Sci.Technol.34：4439-4444(2000)；S.K.Tong et al.，Genesis，47(2)：67-73(2009))。

其次，优点还在于使用荧光蛋白基因作为报告基因，由此可以通过报告基因表达的在体测量监测雌激素样活性，而无需杀死鱼。在所开发用于检测雌激素样活性的这些转基因株中，3个株使用了荧光蛋白报告基因(T.Ueno etal.，Mech.Dev.121(7-8)：803-15(2004)；K.Krauchi et al.，Environ.Sci.Technol.39(8)：2762-8(2005)；Z.Zeng et al.，Environ.Sci.Technol.39(22)：9001-8(2005))，并且证明了其用于体内监测的无与伦比的优点。然而，这些株的敏感度都不足以在不进行任何浓缩处理的情况下检测环境水样的雌激素样活性。

第三，可选择宿主生物以提供各种优点。例如，黑点青鳉(Oryziasmelastigma)具有实验室模型斑马鱼(Danio rerio)和日本青鳉(Oryzias lattipes)的大部分优点，并且还具有在淡水至海水的不同盐度环境中存活的优点。对宽范围的盐度的适应性使得这类鱼成为用于淡水和海水研究的通用模型。此前的研究表明，可以简单地改进用于已很好建立的模型，例如斑马鱼和日本青鳉的研究技术和资源，以用于这个新模型(X.Chen et al.，Comp.Biochem.Physiol.C.Toxicol.Pharmacol.149：647-655(2009))。

第四，本发明鉴定了雌激素依赖性肝脏特异性基因omChgH，并在本发明的多个实施方式中使用。omChgH是卵膜蛋白。本文所用术语“雌激素依赖性”是指此基因仅在雌激素或雌激素氧化学物质存在下表达。本文所用术语“肝脏特异性”是指此基因的表达仅局限于肝脏，而不在任何其他器官表达。在正常环境下(未经任何处理的净水)，此基因仅在内源雌激素浓度高的繁殖期雌鱼中表达，但不在内源雌激素水平几乎检测不到的胚胎、幼体和雄鱼中表达(X.Chen et al.Ectoxicol.Environ.saf.71：200-208(2008))。然而，在外源雌激素或雌激素样化学物质的存在下，也可在无表达的胚胎、幼体和雄鱼内诱导此基因表达。因此，使用受omChgH启动子调控的荧光蛋白基因作为报告标记，omChgH基因的诱导表达将由肝脏中可容易地在荧光显微镜下检测到的荧光蛋白表示。

如上所述，本发明一方面涉及研发包含基因组整合的核苷酸序列的转基因鱼，其中所述核苷酸序列包含受雌激素反应启动子调控的荧光蛋白基因作为报告标记。

实施例

以下实施例是作为本发明的示例，而非用于具体限制本发明。因此，在本领域技术人员预期范围内的各种变式和等价方式，无论其为已知的还是随后开发的，均视为落入本发明的范围。

实施例1

转基因鱼的开发

黑点青鳉基因组DNA的制备

从剖去肠的成体雌鱼提取基因组DNA(表示为gDNA)。将样品在液氮中研磨成小颗粒，并在45℃与10ml DNA提取溶液(150mM NaCl、0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)、25mM乙二胺四乙酸(EDTA)、10mM Tris-HCl，pH 8.0)和1％蛋白酶K一起温育4小时以上。向溶液中加入等体积的苯酚，并通过缓慢旋转混合0.5小时。在2,000rpm离心10分钟后，将包含gDNA的水相转移到新的polytron管(50ml)中，并在旋转器上与等体积的苯酚/氯仿混合10分钟。随后，将溶液在2,000rpm离心10分钟，将水相转移到新管中。使用等体积的氯仿进一步纯化gDNA溶液，随后在2,000rpm离心5分钟。将水相转移到新管中，并使用无水乙醇沉淀gDNA。小心地使用移液器吸头(transfer tip)管取出gDNA，溶解于无核酸酶的水中，并在-20℃保存。

克隆源自黑点青鳉的omChgH基因启动子区

根据厂商的说明(BD Biosciences)，进行两轮基因组步移后捕获到卵壳蛋白H基因的5′-侧翼区。使用两个接头特异性引物(试剂盒中提供的外引物GW-AP 1：5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’(SEQ ID NO：6)和内引物GW-AP2：5’-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3’(SEQ ID NO：7))和两个反义基因特异性引物(表示为GSP)的组合进行套式PCR扩增。在DraI gDNA文库中进行首次基因组步移的GSP  为：外引物5’-AACGTGTTGAGGGTCCTGCGGCTTC-3’(SEQ ID NO：8)和内引物：5’-CTGTGGATAGTATGGAGGGTATGGAACC-3’(SEQ ID NO：9)；基于首次基因组步移的结果设计在EcoRV gDNA文库中进行第二次基因组步移的GSP，其外引物：5’-GTGTAATGGATGTGGACTTTTTCTATAAGACAACC-3’(SEQ ID NO：10)和内引物：5’-CCCAAAATGCATGTGCAGCTGATGGC-3’(SEQ ID NO：11)。50-μl的PCR反应物包含5μl10×PCR缓冲液、1μl dNTP(10mM)、1μl GSP(10μM)、1μl接头引物(10μM)、5μl1/50稀释的连接接头的基因组文库(用于首次PCR)或1/500稀释的首次PCR产物(用于二次PCR)和1μl 50×BD Advantage 2聚合酶混合物(BD Biosciences)。用于首次和二次PCR的扩增模式由94℃15秒和72℃3分钟的5个循环；94℃15秒和70℃3分钟的5个循环；和94℃15秒和68℃3分钟的25个循环组成。通过电泳分离二次PCR产物，并且分离最锐利的条带，使用

SV Gel和PCR Clean-up System(Promega)进行纯化，克隆到pGEM-T Easy Vector(Promega)中，并通过商业测序服务(Tech Dragon)鉴定。

克隆源自黑点青鳉的omChgH基因3′-侧翼区

进行反向PCR以克隆omChgH 3′-侧翼区。在对克隆的omChgH基因编码区基因组DNA序列(GenBank登录号No.EF392365)进行限制性内切酶分析后，通过Nde I(Takara)酶切，随后T4DNA连接酶(Takara)连接构建Nde IgDNA文库。分别设计接近omChgH编码区3′-端和上游5′-NdeI切割位点的正向引物(5’-GAAAATCTGTTTCATCATGGTTCAG-3’)(SEQ ID NO：12)和反向引物(5’-TTCACAACTGGTACCCTGTCCTGG-3’)(SEQ ID NO：13)。在包含5μL10×PCR缓冲液、1μLdNTP(10μM)、每种引物各1μL(10μM)和1μLTaq酶(5U/μL；Takara)的50-μl体积中进行反应。PCR热模式由95℃4分钟的初始变性和之后的95℃30秒、60℃30秒和72℃1分钟的35个循环组成。使用与omChgH5′-侧翼区相同的方法鉴定扩增子。

转基因质粒的制备

omChgH5’-EGFP-olChgH3’质粒的构建：在Dra I和EcoR V gDNA文库中的顺次基因组步移后，从转录起始位点捕获了总长为6595bp的卵壳蛋白H 5′-上游区(GenBank登录号No.EF392365)。在此实施方式中，将质粒ChgH-GFP(K.Krauchi et al.，Environ.Sci.Technol.39(8)：2762-8(2005))作为载体使用。在此载体中整合了源自日本青鳉(Oryzias latipes)的卵壳蛋白H启动子区(表示为olChgH5′)和3′-侧翼区(表示为olChgH3′)，并在此二者之间连接了EGFP编码区。为了便于下文陈述，将此载体表示为olChgH5’-EGFP-olChgH3’。在对载体和omChgH 5’-上游区进行限制性位点分析后，使用以下嵌入限制性位点的引物扩增了自转录起始位点起-4827至+15的omChgH 5’-上游区：正向引物(5’-TGCATG GCATGC TTAATTAACTGCAG CCCGGG GTCGAC TCGTACCTCCAAAACCCAAC-3’)(SEQ IDNO：14)，其中SphI、Pac I、Pst I、Sma l和Sal I限制性位点被依次标记下划线)和反向引物(5’-CTCCAGTGCCTTG CC

GT-3’)(SEQ ID NO：15)；其中标记下划线的为Nco I位点，加粗的为翻译起始密码)。将PCR片段亚克隆到olChgH5’-EGFP-olChgH3’载体中SphI和Nco I限制酶的切割位点，从而构建质粒omChgH5’-EGFP-olChgH3’。

此外，还使用omChgH5’-EGFP-olChgH3’质粒作为模板，通过PCR扩增和酶切分别构建包含从-750至+15，以及从-350到+15的omChgH 5’-上游区的两个缺失突变体。用于PCR  扩增的引物为5’-TCGACTGCAGTGCTCTCACTCTATGGGGTTC-3’(SEQ ID NO：16)(正向引物，Pst I位点标有下划线)和5’-CTCCAGTGCCTTGCCATGGT-3’(SEQ IDNO：17)(反向引物，Nco I位点标有下划线)。随后，由复制子替换在omChgH5’-EGFP-olChgH3中Pst I和Nco I位点的omChgH5’-EGFP-olChgH3’的-4827omChgH5’区。通过使用Xho I和EcoR I切割-4827omChgH5’-EGFP-olChgH3′质粒，获得了-350omChgH 5’-EGFP-olChgH3’片段。

omChgH5’-EGFP-SV40质粒的构建：通过5’-AGCTACTAGTCCATCTACATGGCCAAGAAG-3’(SEQ ID NO：18)(正向)和5’-ATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGT-3’(SEQ ID NO：19)(反向)引物从DsRed2-1载体(Clontech)扩增SV40聚腺苷酸化信号(表示为SV40polyA)，并将其连接到用于扩增的

-T Easy载体。在用Not I和EcoR I酶切后，由SV40polyA替换omChgH5’-EGFP-olChgH3’质粒中的olChgH3’区，从而构建质粒omChgH5’-EGFP-SV40。

omChgH5′-EGFP-omChgH3’质粒的构建：通过以上描述的反向PCR克隆了从转录终点起长800bp的omChgH 3′-侧翼区序列(GenBank登录号No.DQ778335)。对于omChgH5’-EGFP-omchgH3’构建体，使用正向引物(5’-TGCAGCGGCCGCCTGTGAACCGACAGAAG-3’)(SEQ ID NO：20)和反向引物(5’-CACGGATGTGTGTGTTTACC-3’)(SEQ ID NO：21)扩增omChgH3’-UTR，并通过正向引物(5’-GAAAATCTGTTTCATCATGGTTCAG-3’)(SEQID NO：22)和反向引物(5’-TTCACAACTGGTACCCTGTCCTGG-3’)(SEQ IDNO：23)克隆3’-侧翼区。随后，根据说明书，使用BD In-Fusion^TM Dry-DownPCR克隆试剂盒(Clontech)连接3’-UTR和3’-侧翼区。通过正向引物(5’-TGCAGCGGCCGCCTGTGAACCGACAGAAG-3’)(SEQ ID NO：24)和反向引物(5’-TTCACAACTGGTACCCTGTCCTGG-3’)(SEQ ID NO：25)的组合PCR扩增omChgH翻译终止密码的下游区。随后将扩增子连接到用于扩增的

-T Easy载体中。然后，将此序列亚克隆到omChgH5’-EGFP-omChgH3’或omChgH5’-EGFP-SV40质粒的NotI和EcoR I位点，以形成omChgH5’-EGFP-omChgH3’质粒。

鱼胚胎的微注射

总体而言，根据Kinoshita等人的方法(Aquaculture，143(3-4)：267-276(1996))对鱼胚胎进行微注射，但有一定改进。为了使转基因的插入频率最大化并降低首代鱼的嵌合性，将转基因溶液微注射到处于单细胞阶段的受精卵的细胞质中。为了便于收集新鲜受精卵，在微注射前一天使用隔板将雄鱼和雌鱼分隔在各自的交配缸中。在微注射之前，除去隔板，并使用塑料滴管直接从雌鱼的腹部收集刚刚受精的卵。通过使用两支精细镊抓住胚胎的细丝并相对旋转而将卵彼此分离。尽可能快速地进行微注射，并且将注射的时间严格地限制在受精后30分钟以内。

借助立体显微镜或复式显微镜、显微操纵器和油压或气压注射装置进行注射。将胚胎保持在载玻片上的自制玻璃粘合剂固定器的空隙中。使转基因DNA构建体线性化，并溶于包含1mM EDTA、137nM NaCl、3mM KCl的10mM磷酸缓冲液(pH 7.5)中。以10～50ng/μL的浓度范围注射线性化的转基因DNA片段。

omChgH 5’-上游区的启动子活性

为了分析负责调控omChgH基因的区域，向单细胞黑点青鳉胚胎中注射包含与EGFP报告基因融合的三种在4827bp到350bp范围的大小不同的omChgH 5’-上游区。在注射后起第3天，在大多数胚胎中观察到GFP瞬时表达。使从微注射的胚胎存活的鱼苗与5.1nM E2接触24小时，并使用荧光立体显微镜观察GFP的表达。对于每种构建体，计算表达GFP的鱼苗的发生率(incidence)。尽管GFP荧光阳性鱼的百分比略有变化，但表明分别包含omChgH基因的4827bp(-4827)和758bp(-758)5’-上游区的omChgH5’-EGFP-olChgH3’构建体在促进下游EGFP基因的雌激素依赖性肝脏特异表达方面具有相同的活性。然而，在-758至-350omChgH5’-EGFP-olChgH3’构建体观察到启动子活性的明显下降，表明存在位于omChgH5’-上游区的-758至-350之间的特定顺式调控元件。尽管如此，GFP阳性鱼苗的存在证明了350bp omChgH 5’-上游区具有调控其下游基因的雌激素依赖性肝脏特异表达的能力。

计算机分析确定推定的顺式元件分别包括：一个5’-ERE-half位点(位于nt.-18位)、一个C/EBP结合位点(位于nt.-158位)和一个位于第一350bp 5’-上游区内的雌激素反应元件(ERE；位于nt.-253位)，以及位于omChgH基因-758和-350区之间的另一个C/EBP结合位点(位于nt.-494位)。通过-350omChgH5’-EGFP-olChgH3’构建体证实的启动子活性表明第一350bp 5’-上游区内鉴定的部分或所有三个推定顺式元件对于调控下游基因的雌激素依赖性肝脏特异表达具有重要意义。尽管如此，从-758到-350omChgH5’-EGFP-olChgH3’构建体的启动子活性的明显下降表明在omChgHnt.-494位的C/EBP结合位点对于下游基因的雌激素依赖性肝脏特异表达的高度顺式调控具有重要意义。

omChgH 3’-侧翼区的调控作用

对于一些基因(例如，vasa，nano)，3’-侧翼区是其mRNA稳定性和定位必不可少的(M.Tanaka et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，98(5)：2544-2549(2001)；M.Koprunner et al.，Genes Dev.15(21)：2877-2885(2001)；H.Kurokawaet al.，Dev.Growth Differ.48(3)：209-221(2006))。在此实施方式中，分析了纯合3’-侧翼区在omChgH转基因研究中的重要性。将omChgH5’-EGFP-olChgH3’片段的olChgH3’分别替换成SV40polyA和omChgH3’-侧翼区。随后，将这些片段注射到单细胞黑点青鳉胚胎中，并按照上文所述观察孵化期(hatchling stage)中雌激素依赖性GFP的表达，结果总结在图2中。侧翼为SV40polyA时，-4728omChgH5’-EGFP DNA片段表现出调控GFP荧光的雌激素依赖性肝脏特异表达的能力，而GFP阳性鱼苗的发生率甚至略高于侧翼为olChgH3’的情况，但低于侧翼为omChgH3’的情况。此外，还在-750和-350omChgH5’-EGFP-omChgH3’构建体中观察到高于其相应omChgH5’-EGFP-olChgH3′构建体的GFP-阳性鱼苗发生率(图1)。这些强烈地表明，纯合3’-侧翼区对于omChgH5’-EGFP转基因构建体的高启动子活性的重要性，在3’-侧翼区鉴定出的推定元件可解释此差别。

此外，结果显示在-4728和-758omChgH5’-EGFP-omChgH3’构建体之间观察到类似的启动子活性，而在-350omChgH5’-EGFP-omChgH3’构建体中观察到启动子活性的明显下降(图1)。这进一步证实了此前的结果(图1)，即350bp omChgH 5’-上游区足以调控其下游基因的雌激素依赖性肝脏特异表达，而omChgH的nt.-494位的C/EBP结合位点增强了启动子活性。

转基因鱼的鉴定

饲养经注射的胚胎约2-3个月直至成体鱼。随后，使这些首代鱼(F0)分别与野生型鱼交配。收集其胚胎，并使用Accuprep基因组DNA提取试剂盒(Bionner，Korea)提取基因组DNA，并使用EGFP特异性引物(正向引物：5’-TGCTGCCCGACAACCACTACC-3’(SEQ ID NO：26)和反向引物5’-TTACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3’(SEQ ID NO：27))通过PCR测定EGFP转基因的存在。收集EGFP阳性首代鱼(F0)的更多胚胎，并在孵化期间接触雌激素(17β-雌二醇，5.1nM)后通过绿色荧光标记筛选携带EGFP转基因的后代(F1)。对雌激素反应表达EGFP的F1鱼是能够将转基因转移到其后代的稳定转基因鱼种系。总共鉴定出11个转基因鱼种系。在接触相同浓度雌激素后，选择显示对雌激素最敏感的转基因鱼株进行详细分析。

转基因EGFP表达

在没有任何处理的情况下，转基因黑点青鳉中引入的EGFP的表达局限于合成高浓度雌激素的繁殖的雌鱼，而在胚胎、幼体和雄鱼的肝脏没有观察到EGFP表达(图3)。然而，当转基因黑点青鳉鱼接触雌激素或雌激素样化学物质时，也可在胚胎、幼体和雄鱼的肝脏中诱导EGFP表达(图3)。引入的EGFP的表达谱与omChgH在此黑点青鳉中的内源表达谱一致(X.Chen et al.Ectoxicol.Environ.Saf.71：200-208(2008))，区别在于omChgH蛋白是分泌蛋白并将在肝脏中合成后通过血液循环转运到卵巢，而EGFP不是分泌蛋白，并在其合成后将停留在肝脏。由于转基因黑点雌青鳉鱼在没有外界诱导的情况下表达EGFP，区分内源EGFP表达和通过雌激素样化学物质诱导的EGFP表达并不容易。然而，不表达EGFP的胚胎、幼体和雄性转基因黑点青鳉鱼作为监测雌激素样活性(其以绿色荧光表示)的优异候选物，，特别是泳动、未喂食且最透明的新孵化幼体是用于雌激素样活性监测的最佳阶段。

实施例2

雌激素接触试验

现有技术中建立了通用的接触方法。图4显示了使用转基因鱼幼体分析测试溶液雌激素样活性的实施例。转基因黑点青鳉鱼(优选卵黄囊期幼鱼)与测试溶液(包含雌激素或雌激素物质)的接触在28℃进行。此接触通常需要24-48小时。接触后，将鱼放置在具有小滴测试溶液的皮氏培养皿(petri-dish)盖内侧上。在荧光显微镜下观察鱼肝脏中诱导的EGFP表达。卵黄囊期幼鱼很小，可以在如96孔板、24孔板、皮氏培养皿等器具中进行接触，以节省测试试剂。此外，新孵化的幼体是最透明的阶段，其透明度可保持至孵化后第15天。15天后，由于肌肉的发育，幼体的透明度将逐渐减小。孵出后1-15天的转基因鱼幼体具有类似的雌激素敏感性(图5)。

转基因鱼对不同浓度的雌激素或雌激素样化学物质反应而表达不同量的EGFP蛋白，其由荧光显微镜下的不同GFP信号强度表示。只要雌激素或雌激素样化学物质没有达到导致致死毒性的浓度，GFP信号强度便随这些物质的浓度增大而增大。为了量化测试溶液的雌激素样活性，使用与荧光显微镜相连的照相机记录鱼肝脏的荧光图像。随后，可使用一些图像分析软件，例如Metamorph(Universal Imaging)测量肝GFP信号强度。为了减少鱼自体荧光的干扰，仅选择鱼肝脏区域进行分析。将使用相同软件计算的手动标记区域的平均信号强度视为GFP信号强度。可使用GFP信号强度直接比较使用相同图像参数设定记录的鱼肝脏图片，也可比较使用不同图像参数设定记录的图片，只要每组包含共同的参考对照。

考虑到环境水样和其他测试试剂可能具有不同的盐度和pH值，研究了不同盐度和pH对转基因黑点青鳉鱼的雌激素敏感性的影响。使用不同pH值(例如，6.0、7.0、8.0和9.0)或不同盐度(例如，＜5ppt，淡水；15ppt，半咸水；30ppt，通常海水和35ppt，高盐度海水)的水作为测试溶液，并向其中添加相同浓度的雌激素(例如5.1nM)。使新孵化的转基因黑点青鳉鱼接触这些溶液一段时间(例如24小时)。记录了5份鱼肝脏，并按照上文所述测量了其GFP信号强度。对雌激素诱导的肝GFP信号强度的统计分析证明，不同的pH(6.0～9.0的范围；图6)和不同的盐度(0～35ppt；图7)都没有影响此转基因黑点青鳉鱼监测雌激素样活性的敏感度。

实施例3

雌激素样活性分析

天然雄激素

雌酮(E1)、17β-雌二醇(E2)和雌三醇(E3)是天然的类固醇雌激素。这三种雌激素都能在nM水平诱导本发明转基因黑点青鳉幼鱼肝脏中的GFP表达。其中，E2已得到深入研究，并且通常为评估测试试剂雌激素样活性的标准雌激素。使用本发明的转基因幼鱼，通常能够在24小时内观察到由E2诱导的GFP信号，并且GFP信号随E2浓度的增大而增大。在较高的E2浓度(例如，102或1020nM)下，甚至可以在接触开始后4小时内观察到诱导的GFP信号强度，而且信号随暴露时间的延长而增加(图8)，并在24小时内达到饱和。然而，在低E2浓度下，将需要累积较长的时间使能检测到诱导的GFP信号。因此，通过使转基因黑点青鳉鱼幼体接触不同浓度E2一段时间(例如24小时)，使表达GFP的肝脏成像，随后使用图像分析软件测量诱导的肝脏GFP信号强度，就能够建立GFP信号强度和E2浓度之间关系的标准曲线(GFP-E2标准曲线；图9)。随后，使用相同的方法并包含一种已知E2浓度接触作为参照，通过将诱导肝GFP信号与GFP-E2标准曲线进行比对，能够评估作为雌激素功效等价物的测试试剂的雌激素样活性。

合成雌激素

避孕药中的活性化合物17α-乙炔雌二醇(EE2)和乙炔雌二醇3-甲基醚是合成雌激素。EE2已经得到广泛研究，并且其雌激素活性甚至高于E2的雌激素活性(K.Kurauchi et al.，Environ.Sci.Technol.39(8)：2762-8(2005)；J.Legler et al.，Environ.Technol.36：4410-4415(2002)；参见图9和图10)。通过使转基因幼鱼接触相同浓度(例如，nM水平)的EE2和乙炔雌二醇3-甲基醚一段相同的时间(例如，24小时)，所诱导的肝GFP信号在EE2和乙炔雌二醇3-甲基醚之间几乎相同，均高于E2所诱导的肝GFP信号。图10显示了本发明的肝GFP信号对EE2的剂量依赖性反应。

豆浆植物雌激素

豆浆包含高浓度的植物雌激素，例如染料木黄酮、染料木苷、黄豆苷原(daidzein)和黄豆苷(daidzin)。日常食用的豆浆被认为在很多方面有利于人类健康，特别是围绝经期和绝经后的妇女(E Lydeking-Olsen et al.Eur J Nutr.43(4)：246-257(2004)；MS Kurzer.J Nutr.133：1983S-1986S(2003))。由于植物雌激素例如染料木黄酮、染料木苷、黄豆苷原和黄豆苷是弱雌激素，此前的转基因鱼研究曾尝试，但没能检测到染料木黄酮的雌激素活性(S Scholz et al.Environ Toxicol Chem.24(10)：2553-2561(2005))。一个近期研究发现纯染料木黄酮，或染料木黄酮与黄豆苷原组合的雌激素样活性不如豆浆的雌激素样活性高(G Rando et al.Toxicol Appl Pharmacol.237(3)：288-297(2009))。由于豆浆的药物作用取决于其雌激素样活性，因此测量豆浆的雌激素样活性是重要的。使用本发明的转基因黑点青鳉幼鱼，能在将幼鱼分别接触高浓度的这四种植物雌激素一段时间(例如，48小时)后，在肝脏中观察到弱GFP信号。为了测试豆浆的雌激素样活性，首先根据我们此前建立的方法从豆浆提取植物雌激素。简要而言，将豆浆冻干，并使用甲醇提取其植物雌激素。随后，将提取溶液的水蒸发至干，并将植物雌激素复溶在甲醇中。随后，可通过HPLC(高效色谱)量化每种植物雌激素的浓度，并可通过测量转基因幼鱼在接触其水稀释液后诱导的GFP信号强度来容易地评估所提取的植物雌激素的雌激素样活性。我们发现不同品牌的豆浆具有不同的雌激素样活性，并且大多数豆浆的雌激素样活性高于所述四种植物雌激素中任何一种单独的雌激素样活性(例如，图11)。

工业雌激素内分泌干扰物

4-壬基酚(NP)和双酚A(BPA)是在工业活动中产生的公知内分泌干扰物。它们能够模拟雌激素诱导雌激素反应基因，例如雌激素受体、卵黄蛋白原和卵壳蛋白基因的表达(C.Lee et al.，J Health Sci，48(5)：441-445(2002))。我们此前的研究也显示这两种化学品能够诱导卵壳蛋白基因在本发明的宿主生物体黑点青鳉(Oryzias melastigma)中表达(X.Chen et al.Ectoxicol.Environ.Saf.71：200-208(2008))。现已报道使用转基因鱼检测NP(K.Kurauchi et al.，Environ Sci Technol，39：2762-2768(2005))和BPA(但非NP，Z.Zeng et al.，Environ Sci Technol，39：9001-9008(2005))。这两种化学品也能够在本发明的转基因鱼中诱导GFP表达。

化妆品雌激素化学品

苯甲酮-3(BP3)、3-(4’-甲基苯亚甲基-樟脑)(4-MBC)、水杨酸三甲环己酯(homosalate，HMS)、辛基二甲基PABA(OD-PABA)、4-叔丁基-4’-甲氧基二苯酰甲烷(BMDM)和辛基-甲氧基肉桂酸酯(OMC)是防晒霜和化妆品(包括唇膏、润肤液、染发剂、香波)和大量其他产品例如模制品(moldings)、喷墨、轮胎和织物中最常用的UV阻断剂。通常在产品中添加高百分比的UV过滤剂(例如，高达10％的BP-3和6％的4-MBC，NR Janjua et al.，J Eur Acad DermatolVenereol.22(4)：456-61(2008))，并且用于吸收UVA、UVB和UVC光线的不同UV过滤剂组合的应用不断增加。UV过滤剂在施用后不久即进入人体血液(NR Janjua et al.，J Eur Acad Dermatol Venereol.22(4)：456-61(2008))，并且在使用了包含化妆品UV过滤剂的妇女的乳汁中存在(M Schlumpf et al.，Int JAndrol，31(2)：144-151(2008))。最近的研究显示很多UV过滤剂通过诱导雌激素受体显示出雌激素活性(PY Kunz&K Fent.Toxicol Appl Pharmacol.217(1)：86-99(2006)；PY Kunz & K Fent.Toxicol Appl Pharmacol.234(1)：77-88(2009)。然而，使用转基因斑马鱼的研究无法检测UV过滤剂的雌激素样活性(R Schreurs et al.Arch Toxicol.76：257-261(2002))。使用本发明的转基因黑点青鳉幼鱼，我们发现BP-3和4-MBC能够在高于0.65μM的浓度下接触一段时间(例如，24小时)后在肝脏诱导GFP表达，并且BP-3和4-MBC混合物的雌激素活性显著高于这两种化合物单独的活性(图12)。尽管BMDM、OMC、OD-PABA和HMS不能在转基因黑点青鳉幼鱼的肝脏中诱导GFP表达，但是通过与E2的二元接触可容易地鉴定出BMDM、OMC和OD-PABA的雌激素激活性，而HMS能够以剂量依赖的方式增强17β-雌二醇的雌激素活性(图14)。

实施例4

抗雌激素活性分析

多环麝香

6-乙酰基-1，1，2，4，4，7-六甲基四氢化萘(AHTN)是最常用的多环麝香之一。此化合物在化妆品和家用清洁产品中作为芳香成分使用。根据2004年HERA风险评估报告，AHTN在一家荷兰和UK工厂的年生产体积分别为1000～5000吨。根据HERA风险评估，基于目前的日常消费，AHTN对人没有毒性。然而，其广泛发布，在环境中的高度累积(A Peck et al.Environ Sci Technol.40：5629-5635(2006))，以及在包括人在内的生物体内的生物累积(H Nakata et al.Environ Sci Technol.41：2216-2222(2007)；S Lignell et al.Environ Sci Technol.42：6743-6748(2008))引起了科学家的关注。发现AHTN是雌激素拮抗剂(RHMM Schreurs et al.Environ SciTechnol.38：997-1002(2004)；RHMMSchreurs et al.Toxicol Sci.83：264-272(2005))。使用本发明的转基因黑点青鳉鱼还能够非常容易地评估AHTN的雌激素拮抗活性。只要使转基因黑点青鳉幼鱼接触E2(例如，0.04μM)或E2与AHTN(例如，5μM)的组合一段时间(例如，24小时)，随后测量在AHTN存在/不存在下，由E2诱导的GFP信号强度。在AHTN存在下，由E2诱导的GFP信号较弱表明此化学品是雌激素拮抗剂(图15)。

实施例5

转基因黑点青鳉鱼在肝脏再生研究中的应用

肝脏在通过营养物、碳水化合物、脂肪和维生素的代谢、合成、储存和再分布在代谢动态平衡中发挥核心作用。同时，肝脏还是体内通过代谢转化和胆汁排泄去除废物和外源物的主要解毒器官。高等脊椎动物，包括人的肝脏能够精确地调节其生长和质量，并且具有强的损伤后再生的能力。最近的研究发现，鱼肝脏在部分肝切除后也通过与对哺乳动物高度类似的方式再生(NG Kan et al.FASEB J.fj.09-131730v1(2009))。由于鱼与人共有大部分发育途径、生理机制和器官系统(AR Cossins and DL Crawford.Nature Rev Genet.6：324-333(2005))，将鱼作为肝脏再生研究的模型生物体可有助于理解肝脏再生的分子和细胞机制。使用包含对雌激素内分泌干扰物反应的肝细胞GFP标记的本发明转基因黑点青鳉鱼，对于揭示不同雌激素内分泌干扰物对肝脏再生的影响是非常有用的。

通过使用在此前斑马鱼肝脏再生研究中采用的方法(NG Kan et al.FASEB J.fj.09-131730v1(2009))进行由全肝叶、部分肝叶和小划痕手术(smallscratch surgery)导致的部分肝切除所引起的创伤。为了研究肝再生，可使用本发明的转基因成体鱼。简要而言，使成体转基因黑点青鳉鱼禁食一天，并在手术前用0.015％三卡因溶液麻醉。随后，通过3-4mm的切口打开鱼的腹腔，小心地将腹侧肝叶从腹腔中拨出，并特别小心地从肝叶根部进行切除。为了进行部分肝叶切除和表面划痕手术，暴露腹侧肝叶并使用锋利的镊子进行小片肝尖组织或小划痕。随后，小心地将剩余的肝脏放回到腹腔中，并使用GLUture(Abbott Laboratories)关闭体壁。随后，将鱼放回到淡水中恢复。伪处理的鱼也接受相同方法的处理，但不进行肝切除。

为了分析内分泌干扰物对肝脏再生过程的影响，使用/不使用E2或其他内分泌干扰物处理鱼。记录例如全鱼体重和肝脏重量的参数，并使用共聚焦显微镜记录取决于其GFP信号的肝脏形状，并可使用图像分析软件(例如，Metamorph，Universal Imaging)测量其体积。

还研究了肝脏再生期间的肝形态学变化。对不同再生阶段的鱼肝脏进行切片，并在4℃的4％多聚甲醛(PFA)/磷酸缓冲盐(PBS)中固定过夜，使用包含0.1％Tween 20的PBS清洗，在O.C.T.介质(Tissue Tek)中预浸2小时，随后包埋在O.C.T.中，并使用Leica低温恒温器在-80℃冷冻3小时以上，随后以10μM的厚度切片。根据标准方法进行切片的免疫组织化学染色。包含抗体例如抗增殖细胞核抗原(PCNA)、抗prox1、抗β-连环素(β-catenin)和抗微管蛋白。

还研究了肝细胞的代谢组学和蛋白质组学的改变，以理解肝脏再生和内分泌干扰物对肝脏再生机制的影响。用三卡因溶液深度麻醉从部分肝切除恢复的鱼，切除肝脏，并在0.25％胰蛋白酶/PBS溶液中温育5分钟。通过温和的抽吸将肝脏粉碎成单细胞悬液，并通过离心收集(1000g，7min)。使细胞悬液通过流式细胞器，收集GFP标记的肝细胞，并根据标准蛋白提取法进行蛋白提取。随后，使用NuPAGE Novex Bis-Tris Gels(Invitrogen)在200V电泳15分钟以分离提取的蛋白，并用Colloidal Blue Kit(Invitrogen)染色。切出蛋白带，使用脱色液(60％水、30％甲醇和10％乙酸)脱色。在Speed Vac(Savant)中干燥后，使用Trypsin Profile IGD Kit(Sigma)降解凝胶。通过Speed Vac干燥经胰蛋白酶处理的蛋白降解产物，并重悬在含0.1％甲酸的水中。通过HPLC-MS/MS(HPLC：高效液相色谱；DIONEX Ultimate 300系统；MS/MS：串联质谱；BRUKER MicrOTOF-QII)分析肽。此外，采用iTRAQ(用于相对和绝对定量的同位素标签)技术进行蛋白定量分析。根据公开的NatureProtocol(RY Tweedie-Cullen and M Livingstone-Zatchej.Nat Proc.DIO：10.1038/nprot.2008.89(2008))进行iTRAQ分析。作为支持技术，还使用二维荧光差异凝胶电泳(2-D DIGE)分析肝脏再生期间肝细胞的蛋白组学变化。根据Nature Protocol(NS Tannu and SE Hemby.Nat Protoc.1(4)：1732-1742(2006))进行此分析。

尽管上文详细描述了本发明的具体实施方式，但本领域技术人员清楚，在不脱离本发明的精神的前提下，能够进行各种改变、添加和替换等，因此这些改变、添加和替换等均被视为在权利要求书中定义的本发明的范围之内。

参考文献

本文中引用的文献不应被解释为承认这些参考文献是本发明的现有技术。本文中引用的所有文献均通过引用全文并入。以下为本文引用的参考文献列表。

Legler J，Van den Brink CE，Brouwer A，Murk AJ，Van der Saag PT，VethaakAD，Van der Burg B.Development of a stably transfected  estrogenreceptor-mediated luciferase reporter gene assay in the human T47D breast cancercellline.Toxicol Sci，1999，48：55-66.

Chen X，Li VW，Yu RM，Cheng SH.Choriogenin mRNA as a sensitivemolecular biomarker for estrogenic chemicals in developing brackish medaka(Oryzias melastigma).Ecotoxicol Environ Saf，2008，71：200-208.

Chen X，Li L，Wong CKC，Cheng SH.Rapid adaptation of molecularresources from zebrafish and medaka to develop an estuarine/marienmodel.Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol，2009，149：647-655.

Ekker SC，Stemple DL，Clark M，Chien CB，Rasooly RS，Javois LC.Zebrafish genome proj ect：bringing new biology to the vertebrate genome field.Zebrafish，2007，4：239-251.

Kasahara M，Naruse K，Sasaki S，Nakatani Y，Qu W，Ahsan B，Yamada T，Nagayasu Y，Doi K，Kasai Y，Jindo T，Kobayashi D，Shimada A，Toyoda A，Kuroki Y，Fujiyama A，Sasaki T，Shimizu A，Asakawa S，Shimizu N，Hashimoto S，Yang J，Lee Y，Matsushima K，Sugano S，Sakaizumi M，Narita T，Ohishi K，HagaS，Ohta F，Nomoto H，Nogata K，Morishita T，Endo T，Shin IT，Takeda H，Morishita S，Kohara Y.The medaka draft genome and insights into vertebrategenome evolution.Nature，2007，447：714-719.

Inoue K，Takei Y. Diverse adaptability in oryzias species to highenvironmental salinity.Zool Sci，2002，19：727-734.

Naruse K.Classification and phylogeny of fishes of the genus Oryzias andits relatives.Fish Biol J Medaka，1996，8：1-9.

Ozato K，Kondoh H，Inohara H，Iwamatsu T， Wakamatsu Y，Okada TS.Production of transgenic fish：introduction and expression ofchicken.delta.-crystallin gene in medaka embryos.Cell Differ，1986，19：237-244.

Inoue K，Ozato K，Kondoh H，Iwamatsu T，Wakamatsu Y，Fujita T，Okada TS.Stage-dependent expression of the chicken δ-crystallin gene in transgenic fishembryos.Cell Differ Dev，1989，27：57-68.

Inoue K，Yamashita S，Hata J，Kabeno S，Asada S，Nagahisa E，Fujita T.Electroporation as a new technique for producing transgenic fish.Cell Di ffer Dev，1990，29(2)：123-128.

Tamiya E，Sugiyama T，Masaki K，Hirose A，Okoshi T，Karube I.Spatialimaging of luciferase gene expression in transgenic fish.Nucleic Acids Res，1990，18(4)：1072.

Lu JK，Chen TT，Chrisman CL，Andrisani OM，Dixon JE.Integration：expression，and germ-like transmission of foreign growth hormone genes inmedaka(Oryzias latipes).Mol Mar Biol Biotechnol，1 992，1(4/5)：366-375.

Tsai HJ，Wang SH，Inoue K，Takagi S，Kimura M，Wakamatsu Y，Ozato K.Initiation of the transgenic lacZ gene expression in medaka(Oryzias lattipes)embryos.Mol.Mar Biol Biotechnol，1995，4(1)：1-9.

Winn RN，Van Beneden RJ，Burkhart JG.Transfer，Methylation andSpontaneous Mutation Frequency of ΦX174am3cs70 sequences in Medaka(Oryzias latipes)and Mummichog(Fundulus heteroclitus)：Implications for GeneTransfer and Environmental Mutagenesis in Aquatic Species.Marine EnvironRes，1995，40(3)：247-265.

Cossins AR，Crawford DL.Fish as models for environmental genomics.Nature Rev Genet，2005，6：324-333.

Sumpter JP，Xenoendocrine disrupters——environmental impacts.Toxicol Lett，1998，102-103：337-342.

Kawamura T，Sakai S，Omura S，Hori-e R，Kawahara T，Kinoshita M，Yamashita I.Estrogen inhibits development of yolk veins and causes bloodclotting in transgenic medaka fish over expressing estrogen receptor.Zoolog Sci，2002，19(12)：1355-61.

Ueno T，Yasumasu S，Hayashi  S，Iuchi I.Identification of choriogenincis-regulatory elements and production of estrogen-inducible，liver-specifictransgenic Medaka.Mech Dev，2004，121(7-8)：803-15.

Kurauchi K，Nakaguchi Y，Tsutsumi M，Hori H，Kurihara R，Hashimoto S，Ohnuma R，Yamamoto Y，Matsuoka S，Kawai S，Hirata T，Kinoshita M.In vivovisual reporter system for detection of estrogen-like substances by transgenicmedaka.Environ Sci Technol，2005，39(8)：2762-8.

Zeng  Z，Shan T，Tong Y，Lam SH，Gong Z.Development ofestrogen-responsive transgenic medaka for environmental monitoring ofendocrine disrupters.Environ Sci Technol，2005，39(22)：9001-8.

Hano T，Oshima Y，Kinoshita M，Tanaka M，Mishima N，Ohyama T，Yanagawa T，Wakamatsu Y，Ozato K，Honjo T.Quantitative bioimaging analysisof gonads in olvas-GFP/ST-II YI Medaka(transgenic Oryzias latipes)exposed toethinylestradiol.Environ Sci Technol，2007，41(4)：1473-9.

Salam MA，Sawada T，Ohya T，Ninomiya K，Hayashi S.Detection ofenvironmental estrogenicity using transgenic medaka hatchlings(Oryzias latipes)expressing the GFP-tagged choriogenin L gene.J Environ Sci Health A ToxHazard Subst Environ Eng，2008，43(3)：272-7.

Legler J，Broekhof JLM，Brouwer A，Lanser PH，Murk AJ，van der Saag PT,Vethaak AD，Wester P，Zivkovic D，van der Burg B. A novel in vivo bioassay for(xeno-)estrogens using transgenic zebrafish.Environ Sci Technol，2000，34：4439-4444.

Legler J.Zeinstra LM，Lanser PH，Bogerd J，Brouwer，Vethaak ADVoogt PD，Murk AJ，van der Burg B.Comparison of in vivo and in vitro reporter gene assayfor short-term screening of estrogenic activity.Environ Sci Technol，2002，36：4410-4414.

Tong SK，Mouriec K，Kuo MW，Pellegrini E，Gueguen MM，Brion F，Kah O，Chung BC.A cyp 19a1b-gfp(aromatase B)transgenic zebrafish line that expressesGFP in radial glial cells.Genesis，2009，47(2)：67-73.

Kinoshita M，Toyohara H，Sakaguchi M，Inoue K.A stable line of transgenicmedaka(Oryzias latipes)carrying the CAT gene.Aquaculture，1996，143(3-4)：267-276.

Tanaka M，Kinoshita M，Kobayashi D，Nagahama Y.Establishment ofmedaka(Oryzias latipes)transgenic lines with the expression of green fluorescentprotein fluorescence exclusively in germ cells：A useful model to monitor germcells in a live vertebrate.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(5)：2544-2549.Koprunner M，Thisse C，Thisse B，Raz E.A zebrafish nanos-related gene isessential for the development of primordial germ cells.Genes Dev，2001，15(21)：2877-2885.

Kurokawa H，Aoki Y，Nakamura S，Ebe Y，Kobayashi D，Tanaka M.Time-lapse analysis reveals different modes of primordial germ cell migration inthe medaka Oryzias latipes.Dev Growth Differ，2006，48(3)：209-221.

Lee C，Jeon SH，Na JG，Choi YJ，Park K.Sensitive of mRNA expression ofvitellogenin，choriogenin  and  estrogen  receptor  by  estrogenic  chemicals  inmedaka Oryzias latipes.J Health Sci，2002，48(5)：441-445.

Janj ua NR，Kongshoj B，Andersson AM，Wulf HC.Sunscreens in humanplasma and urine after repeated whole-body topical application.J Eur AcadDermatol Venereol，2008，22(4)：456-61.

Schlumpf M，Durrer S，Faass O，Ehnes C，Fuetsch M，Gaille C，Henseler M，Hofkamp L，Maerkel K，Reolon S，Timms B，Tresguerres JA，Lichtensteiger W.Developmental toxicity of UV filters and environmental exposure：a review.Int JAndrol，2008，31(2)：144-51.

Kunz PY，Fent K.Estrogenic activity of UV filter mixtures.Toxicol ApplPharmacol，2006，217(1)：86-99.

Kunz PY，Fent K.Estrogenic activity of ternary UV filter mixtures in fish(Pimephales promelas)-an analysis with nonlinear isobolograms.Toxicol ApplPharmacol，2009，234(1)：77-88.

Peck AM.Linebaugh EK Hornbuckle KC.Synthetic musk fragrances inLake Erie and Lake Ontario sediment ores.Environ Sci Technol，2006，40：5629-5635.

Lignell S.Darnerud P.Aune M.Cnattingius S.Hajslova J.Setkova L.GlnnA.Temporal trends of synthetic musk compounds in mother’s milk andassociations with personal use of perfumed products.Environ Sci Technol，2008，42：6743-6748.

Kurzer MS.Phytoestrogen supplement use by women.J Nutr，2003，133：1983S-1986S.

Lydeking-Olsen E，Beck-Jensen JE，Setchell KD，Holm-Jensen T.Soymilkor progesterone for prevention of bone loss--a 2year randomized，placebo-controlled trial.Eur J Nutr，2004，43(4)：246-57.

Rando G，Ramachandran B，Rebecchi M，Ciana P，Maggi A.Differentialeffect of pure isoflavones and soymilk on estrogen receptor activity in mice.Toxicol Appl Pharmacol，2009，237(3)：288-97.

Kan NG，Junghans D，Izpisua Belmonte JC.Compensatory growthmechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration inzebrafish after partial hepatectomy.FASEB J，2009.fj.09-131730v 1.

Cossins AR，Crawforrd DL.Fish as models for environmental genomics.Nature Rev Genet，2005，6：324-333.

Tweedie-Cullen RY，Livingstone-Zatchej M.Quantitative analysis of proteinexpression using iTRAQ and mass spectrometry.Nat Protoc，2008，DIO：10.1038/nprot.2008.89.

Tannu NS，Hemby S E.Two-dimensional fluorescence difference gelelectrophoresis for comparative proteomics profiling.Nat Protoc，2006，1(4)：1732-1742

Claims (10)

1.一种表达盒，其包含：

编码报告蛋白的报告核苷酸序列；

从青鳉鱼分离的雌激素反应5'-调控核苷酸序列，其中所述5'-调控核苷酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成的组，其中所述调控核苷酸序列可操作地连接到所述报告核苷酸序列的5'端，以在雌激素或雌激素样化合物存在下诱导报告蛋白表达；和

可操作地连接到所述报告核苷酸序列3'端的3'-调控区,所述3'-调控区的核苷酸序列为SEQ ID NO:5。

2.如权利要求1所述的表达盒，其中所述5'-调控核苷酸序列分离自黑点青鳉鱼。

3.如权利要求1所述的表达盒，其中所述报告蛋白是自体荧光蛋白。

4.如权利要求3所述的表达盒，其中所述自体荧光蛋白选自增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、绿色荧光蛋白(GFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和红色荧光蛋白(RFP)组成的组。

5.一种转化载体，其包含权利要求1-4中任一项所述的表达盒。

6.一种宿主细胞，其是由权利要求1-4中任一项所述的表达盒转导的宿主细胞。

7.一种水生动物的转基因细胞，所述转基因细胞包含至少一个权利要求1-4中任一项所述的表达盒。

8.如权利要求7所述的转基因细胞，其中所述水生动物为黑点青鳉鱼。

9.一种用于检测液体介质中雌激素或雌激素样化合物存在的转基因鱼的制备方法，所述方法包括：

使用权利要求1-4中任一项所述的表达盒转化非转基因鱼，从而获得包含至少一个所述表达盒的转基因鱼。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述鱼是黑点青鳉鱼。

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