CN102199535A

CN102199535A - 一种非侵入式连续监测动态细胞数量或浓度的装置与方法

Info

Publication number: CN102199535A
Application number: CN2010101306622A
Authority: CN
Inventors: 齐瀚实; 郑琛
Original assignee: SHANGHAI KUNJU TECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI KUNJU TECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd
Priority date: 2010-03-23
Filing date: 2010-03-23
Publication date: 2011-09-28

Abstract

一种非侵入式连续监测动态细胞数量或浓度的装置与方法，尤其涉及一种对贴壁生长细胞培养(如通常情况下的干细胞或其他治疗用细胞培养)或者对细胞组织培养的非侵入式连续在线或离线监测动态生长细胞数量或浓度的装置与方法，其装置包括：细胞培养液供给系统、上游一个/种或多个/种理生化指标探测或连接头、细胞培养装置、下游一个/种或多个/种理生化指标探测或连接头、一个或多个流体控速无菌推动器、废或收获液系统，其间用流体控速无菌推动器推动和控速的液体输送管道体系按序连接而成。上、下游理生化指标探测头或接头与监测控系统和/或计算机连接，以获取、处理和监测数据，并进而通过信号反馈系统对整个细胞培养系统反馈以实施控制。

Description

一种非侵入式连续监测动态细胞数量或浓度的装置与方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域中一种非侵入式连续监测动态细胞数量或浓度的装置与方法，尤其涉及一种对贴壁生长细胞培养(例如通常情况下的干细胞或其他治疗用细胞培养)或者对细胞组织培养的非侵入式连续在线或离线监测动态生长细胞数量或浓度的装置与方法。

背景技术

通常情况下，干细胞或其他治疗用细胞或者细胞组织的体外培养生长均为贴壁或固着式生长，其通常是用平皿或者T瓶或者细胞组织培养装置等在二氧化碳细胞培养箱内进行静态贴壁或固着式培养。培养过程中，细胞较紧密地贴粘在平皿或者T瓶的内壁上生长或者细胞呈细胞组织形式，细胞不能自由游离。因此，使用这种方式培养即会导致培养过程中的非侵入式、非损伤性细胞取样变得极其困难。

在细胞组织培养情形下，获取细胞数量往往导致培养的细胞组织受到直接破坏。组织工程领域中的体外细胞组织培养，其目的通常是获取一定结构和功能的目标细胞组织，而一个完整的连续培养过程往往是获取该目标细胞组织的前提，期间任何侵入式、损伤性取样即可导致该连续培养过程的终结，进而导致其目标细胞组织的获取成为不可能。

在细胞培养情形下，通常只能检测细胞培养过程的始末细胞数量或细胞浓度，即细胞接种时的初始细胞量或浓度，以及在细胞培养过程结束时，经过胰酶消化、机械吹打等处理方式获取细胞样而检测得到终末细胞数量或浓度。胰酶消化、机械吹打等处理手段直接改变或破坏了细胞贴壁生长状态，也不可避免地在一定程度上损伤或影响细胞，其结果往往是中断了一个连续的细胞培养过程，使得细胞培养过程变为非连续的、完全不同于人体内自然生长态的多个周期段。另外，对于敏感而又可变化(例如分化和逆向分化、癌变等)的干细胞来说，任何损伤或者影响，甚至任何非自然状态的环境或过程，都有可能导致细胞非自然态或非正常态的变化或变异(包括种植下潜在的未来变化或变异的危险因素)，其对直接以活细胞导入人体进行医学治疗为主要应用手段的干细胞或其他治疗用细胞的体外培养造成极大的负面因素。

目前，无论是干细胞或其他治疗用细胞的体外培养生长，还是细胞组织的体外培养生长，对复杂生命科学机理愈来愈深入的认识，加上来自法规和临床治疗愈来愈高的要求，使得细胞或细胞组织的培养工艺变得愈来愈复杂和高级；而细胞或细胞组织培养工程中的有关细胞数量或浓度的动态信息和数据是具备较高级控制和检测手段的、相对于静态平皿或者T瓶细胞培养箱培养工艺更复杂的、甚至往往包含生物反应器手段的各种工艺所必须的。而这些有关细胞数量或浓度的动态信息和数据必须是通过保证细胞或细胞组织生长过程的连续性的、非侵入式的、非损伤性的取样方式而获取的。另外，因劳动量和细胞量等在内的很多因素，靠取采细胞体本身来进行检测的手段根本无法连续不断地获取连续动态生长细胞的数量或浓度数据。

经过对现有文献的检索发现，Gary L.Gilmore等人2000年7月在《Experimental Hematology》上发表的《Ex vivo expansion of human umbilicalcord blood and peripheral blood CD34⁺hematopoietic stem cells》一文中报告了对人脐带血和外周血造血干细胞的培养，探讨并发现了CD34⁺细胞的体外分离及扩增培养，其工作中对细胞生长数量或浓度的检测存在着以下缺陷：

第一、对细胞数量或浓度的检测是通过胰酶消化、机械吹打、甚至刮刀刮削的手段处理后进行计数，其直接损伤了细胞并且中断了一个完整连续的细胞生长过程。

第二、仅可以获得细胞生长过程的起始接种和最后收获的细胞数量或细胞浓度数据，无发获取细胞生长过程中的数据。

综上所述，非侵入式连续在线或离线监测动态生长细胞的数量或浓度的装置与方法是截至目前为止尚未有的技术空白，其在干细胞或其他治疗用细胞培养或细胞组织培养的众多重要的科学和临床应用中已呈亟待填补的状态，本发明专利即直接填补了这一技术空白。

发明内容

本发明的目的在于提供生物工程领域中一种非侵入式连续监测动态细胞数量或浓度的装置与方法，尤其涉及一种对贴壁生长细胞培养(例如通常情况下的干细胞或其他治疗用细胞培养)或者对细胞组织培养的非侵入式连续在线或离线监测动态生长细胞数量或浓度的装置与方法，以解决和填补现有相关领域和技术过程中，因缺乏非侵入式连续在/离线监测动态生长细胞数量或浓度的装置和方法所带来的技术难题和技术空白。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：具有对细胞培养过程中细胞数量或者细胞浓度等信息进行动态的在线或者离线监测控功能，提供了一种基于生化原理的、简便快速的、在线或离线、非侵入式的动态监测细胞数或细胞浓度等信息的装置与方法。

附图说明

图1为本发明装置的基本结构示意图；

图2为安装有多个或多种理生化指标探测或连接头、多个细胞培养装置混连、以及上游培养液中待监测物质的量或浓度为已知的本发明装置的结构示意图。

具体实施方式

本发明的核心在于，

在通常情况下，处于稳定态的单位量的特定细胞在较短的单位时间内，对某种营养物质的消耗量，或者对某种代谢物质的代谢量，或者对某种细胞自身产物的产生量，即细胞的比消耗率或比代谢率或比产生率是基本不变的；也就是说，一个特定细胞培养体(系统)中的活细胞总数量或活细胞浓度与当时细胞对某种营养物或代谢物或产物的消耗率或代谢率或产生率，成一定的正比关系。由此，通过对上述物质(可以是多于一个目标物质)因细胞对其消耗或代谢或产生而发生的变化的检测，即可以获取整个细胞培养体(系统)中的活细胞数量或活细胞浓度(当同时监测多于一个目标物质时，可以使用包括求均值等方法综合计算得出结论)；同时，配合实时在线的细胞培养装置和检测设置即可以实现非侵入式(毋须取出细胞作样品)、连续在/离线监测动态生长细胞数量或浓度的。例如，在连续灌注细胞培养系统的上游和下游恰当地装置可对某种物质的量或浓度进行在线连续监测的探测头(例如溶氧探头、溶二氧化碳探头、葡萄糖探头等)，对所得到的上、下游目标物质的量或浓度作差，再同时配以细胞培养的连续灌注流速(流量和时间)数据，即可获取该细胞培养体(系统)内全部细胞对该目标物质的消耗率或代谢率或产生率，然后再根据所培养细胞对该种物质的比消耗率或比代谢率或比产生率，便可确定当时刻的生长细胞的数量或浓度。如果上游培养液中上述所监测目标物的量或浓度为已知固定值，则上述的上游探测头可以省却，而只安装下游的探测头，以所得到的下游目标物质的量或浓度监测值与已知不变的上游目标物质的量或浓度值作差，进行计算。

对不同的细胞培养条件，修正细胞对目标物质的比消耗率或比代谢率或比产生率数值的大小，可以对不同条件下的细胞培养进行上述监测。

本发明是通过以下装置与技术方案实现的：其包括：上游的细胞培养液供给系统1、上游理生化指标探测头仓3及无菌密封安装于其中的探测或连接头4(例如：应用于液相的溶氧探测头或葡萄糖探测头或乳酸探测头；或者应用于气相的GC-MS气相色谱质谱仪装置的连接口头)，上述理生化指标探测头仓及无菌密封安装于其中的探测或连接头数量和种类可能大于一，即多个或多种理生化指标探测头仓31、32及对应的探测或连接头41、42、细胞培养装置5(可由一个或多个生物反应器、T瓶、转瓶、培养袋等混合组成)、下游理生化指标探测头仓6及无菌密封安装于其中的探测或连接头7(例如：溶氧探测头或葡萄糖探测头或乳酸探测头或气相色谱质谱仪接头；并可包括多于一个或一种探测头仓61、62及对应的探测或连接头71、72)、流体控速无菌推动器8(例如蠕动泵)，该流体控速无菌推动器数量可能大于一，即多个流体控速无菌推动器81、82、下游的废或收获液系统9，其间用流体控速无菌推动器推动和控速的液体输送管道体系2连接而成。上、下游理生化指标探测头或接头4、7以及流体控速无菌推动器8均经管线或数据线与监测控系统和/或计算机10连接，以即时获取和处理所监测数据，并进而通过信号反馈系统11对整个细胞培养系统反馈以实施控制(例如根据动态生长的细胞数量或浓度值反馈控制调节连续灌注流速、培养液供给、溶氧浓度等等)。另外，如果上游培养液中所监测目标物的量或浓度为已知固定值，则上述的上游理生化指标探测头仓3及无菌密封安装于其中的探测或连接头4则可以省却，而只保留下游理生化指标探测头仓6及无菌密封安装于其中的探测或连接头7。

其连接方式为：上游细胞培养液供给系统1通过可控速液体管道2(如硅胶管)，经上游理生化指标探测头仓3(探测或连接头4无菌密封安装于测头仓3中；可包括多个探测头仓3-1、3-2等和多个或多种探测或连接头4-1、4-2等)，相连至细胞培养装置5入口；细胞培养装置5出口连接可控速液体管道2(如硅胶管)，经下游理生化指标探测头仓6(探测或连接头7无菌密封安装于测头仓6中；可包括多个探测头仓61、62等和多个或多种探测或连接头71、72等)，相连至下游废或收获液系统9；上、下游理生化指标探测头或接头4、7均经管线或数据线与监测控系统和/或计算机10连接，以即时获取和处理所监测数据，并进而通过信号反馈系统11对整个细胞培养系统反馈以实施控制(例如根据动态生长的细胞数量或浓度值反馈控制调节连续灌注流速、培养液供给、溶氧浓度等等)；流体控速无菌推动器8(或81、82等多个)可以串联在细胞培养装置5前或者后的液体管道2上的任何适当位置，以推动和控速培养液或细胞混液无菌封闭式连续流经所述整个装置系统；并同时经数据线与监测控系统和/或计算机10连接，以即时获取培养液或培养混液的流速数据。下游理生化指标探测头仓6须尽量靠近与其连接的细胞培养装置5，以提高探测数据的准确度(下游理生化指标探测或连接头可以直接安装于细胞培养装置内的细胞培养相中)。如果需要，多个细胞培养装置51、52、53等可以串或并联混合连接在上、下游的探测头仓3和6之间，以求培养不同的细胞，或者培养相同细胞但欲增大整体系统的细胞数量而增大所探测目标物浓度值或浓度差值(放大目标物的探测信号)。

所述可控速液体流动管道2是可以配合安装滑动控制阀或夹子来控制管内培养液流速的密封无菌、无毒管线，例如细胞培养用硅胶管。

所述理生化指标探测头或连接头4、7可监测细胞培养体的液相或气相中目标物(可使用多种理生化指标探测头或连接头同时监测多于一个目标物质)浓度或量或活性，例如应用于监测液相中目标物的溶氧探测头或葡萄糖探测头或乳酸探测头；或者应用于气相中目标物的GC-MS气相色谱质谱仪装置的连接口头。探测头或连接头可无菌、密封地插装在理生化指标探测头仓3、6内。

所述理生化指标探测头仓3、6为可密封装插上述监测细胞培养体的液相或气相中目标物浓度或量或活性的探头或连接头4、7的装置，理生化指标探测头仓3、6与探头或连接头4、7的连接是密封无菌连接。

所述上游理生化指标探测头仓3及无菌密封安装于其中的探测或连接头4，在上游培养液中所监测目标物的量或浓度为已知固定值时，可以省却，而只保留所述下游理生化指标探测头仓6及无菌密封安装于其中的探测或连接头7。

所述细胞培养装置5为上下游分别有液体入口、液体出口的各种细胞生物反应器、细胞培养wave装置、cell factories、细胞培养T瓶、细胞培养转瓶、细胞培养培养袋等可重复使用或者一次性使用的细胞培养装置；其可以是单一一种和一个，也可以是多种或多个细胞培养装置混合组合而成。

所述流体控速无菌推动器8可以是各种可控速的无菌推进培养液流动的装置，例如细胞培养蠕动泵。其数量可以是一个，也可以是多于一的多个(81、82等多个)。流体控速无菌推动器8可以串联在细胞培养装置5前或者后的液体管道2上的任何适当位置，以推动和控速培养液或细胞混液无菌封闭式连续流经所述整个装置系统；并同时经数据线与监测控系统和/或计算机10连接，以即时获取培养液或培养混液的流量数据(也可以另外使用独立的流量计读取流量数据)。

所述上、下游理生化指标探测头或接头4、7均经管线或数据电线与监测控系统和/或计算机10连接，以离线(例如人工输入数据)和在线地即时获取和处理所监测数据，并进而通过信号反馈系统11对整个细胞培养系统反馈以实施控制(例如根据动态生长的细胞数量或浓度值反馈控制调节连续灌注流速、培养液供给、溶氧浓度、细胞生物反应器搅拌转速等等)

发明方法

本发明方法和装置工作时，细胞培养液或细胞混液无菌封闭式连续流经所述整个装置系统，上、下游理生化指标探测或连接头4、7或41、42、71、72(例如：应用于液相的溶氧探测头或葡萄糖探测头或乳酸探测头；或者应用于气相的GC-MS气相色谱质谱仪装置的连接口头)，即可动态、实时地检测到一个或多个选定监测的目标细胞营养物或细胞代谢物或细胞产生物的浓度或总量或活性、进而通过监测控系统和/或计算机系统10，离线(例如人工输入数据)或者在线地定量计算出细胞的数量或浓度等相关信息，即根据所测浓度或总量或活性的差值或变化，配以细胞培养的连续灌注流速数据，获取该细胞培养体(系统)内全部细胞对该目标物质的消耗率或代谢率或产生率，然后再根据所培养细胞对该种物质的比消耗率或比代谢率或比产生率，便可确定当时刻的生长细胞的数量或浓度。当同时监测多于一个目标物质时，可以使用包括求均值等方法的综合计算得出结论。最后，通过信号反馈系统11对整个细胞培养系统反馈以实施控制(例如根据动态生长细胞的当时数量或浓度值反馈控制调节连续灌注流速、培养液供给、溶氧浓度、细胞生物反应器搅拌转速等等)。上述方法也包括离线式的操作方法，即可以在细胞培养相上、下游人工取采培养液样，送到监测仪器中检测，然后把检测的数据输入检测控装置或计算机中，进行计算和控制。

本发明的一个实施例的具体操作步骤如下：

第一步.使用各种细胞培养用连接插头、栓、塞等以及硅胶管热熔切割焊接工具，配合无菌通气过滤器(例如0.2微米孔的filter)、滑动控制阀或夹子等，将本发明装置的3、4、5、6、7、8、9、10、11，通过本发明装置的液体输送管道体系2，按序连接成工作系统；

第二步.通过气压检查密封性合格后，将整个装置系统进行高温蒸汽灭菌，保证系统内呈无菌状态；

第三步.通过无菌过滤等方式制备连接成本发明装置的无菌态上游细胞培养液供给系统1；

第四步.将本发明的上游细胞培养液供给系统1，通过本发明装置的液体输送管道体系2，与灭菌后的整体系统连接，以达成完整的、呈可启动工作态的系统；

第五步.根据本发明装置的细胞培养装置5的种类和性质，选择使用二氧化碳细胞培养箱；或者使用细胞培养装置5自身具备的控温、控溶氧、控酸碱度等功能；

第六步.启动本发明装置的流体控速无菌推动器8(例如细胞培养蠕动泵)，使用洁净水灌注清洗整个系统后，灌注细胞培养液，静置1-3日，以监测无菌态；

第七步.启动本发明装置的流体控速无菌推动器8(例如细胞培养蠕动泵)，灌注新鲜细胞培养液，在本发明装置的细胞培养装置5中接种细胞，开始静态(非灌注)培养；

第八步.根据细胞生长状态，启动灌注连续培养。调节细胞培养蠕动泵速度以满足细胞生长以及目标物上下游理生化指标探测敏感度的需求；

第九步.启动或打开本发明装置的上游理生化指标探测头仓3及无菌密封安装于其中的探测或连接头4、下游理生化指标探测头仓6及无菌密封安装于其中的探测或连接头7、上下游理生化指标监测控系统和/或计算机10、信号反馈系统11，开始对细胞培养过程中动态生长细胞的数量或者浓度等信息进行定量的、动态的在线或者离线监测和反馈控制。

本发明的另一个实施例的方法如下：

在脐带间充质干细胞培养过程中，上游培养液监测头监测得到葡萄糖的浓度为2mg/ml，而在下游监测头监测到的葡萄糖浓度为0.3mg/ml，而通过读取可控流量的培养液或混液流速为10ml/hr，上下游监测点间灌注流经时间(其基本等于培养液流经细胞培养装置中细胞相的时间)为0.5hr，而脐带间充质干细胞的比葡萄糖细胞消耗率为1.83mg/10⁸cells-hr，根据上、下游监测的葡萄糖浓度差为(2-0.3)mg/ml，得出消耗的葡萄糖的量为(2-0.3)mg/ml×10ml/hr×0.5hr＝8.5mg，所以可以得出细胞数量为8.5mg/(1.83mg/10⁸cells-hr×0.5hr)＝9.29×10⁸cells。

以上公开的仅为本发明的具体实施例，但本发明并非局限于此，任何相关的变化，都应落在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种非侵入式连续监测动态细胞数量或浓度的装置，用于监控非侵入式连续监测动态细胞数量或浓度，尤其涉及一种对贴壁生长细胞培养或者对细胞组织培养的非侵入式连续在线或离线监测动态生长细胞数量或浓度，其特征在于，包括：上游的细胞培养液供给系统、上游一个/种或多个/种理生化指标探测或连接头、细胞培养装置、下游一个/种或多个/种理生化指标探测或连接头、一个或多个流体控速无菌推动器、下游的废或收获液系统，其间用流体控速无菌推动器推动和控速的液体输送管道体系根据功能按序连接而成，上游理生化指标探测头或接头和/或下游理生化指标探测头或接头与监测控系统和/或计算机连接，所述监测控系统和/或计算机用于通过该些探测头或接头所得到的上游目标物质的量或浓度作差和/或下游目标物质的量或浓度作差，再同时配以细胞培养的连续灌注流速数据，即可获取该细胞培养体内全部细胞对该目标物质的消耗率或代谢率或产生率，然后再根据所培养细胞对该种物质的比消耗率或比代谢率或比产生率，便可确定当时刻的生长细胞的数量或浓度，据此并进而通过信号反馈系统对整个细胞培养系统反馈以实施控制。

2.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述理生化指标探测头或连接头可监测细胞培养体的液相或气相中目标物，可使用多种理生化指标探测头或连接头同时监测多于一个目标物的浓度或量或活性。

3.如权利要求2所述的装置，其特征在于，所述理生化指标探测头或连接头包括应用于监测液相中目标物的溶氧探测头或葡萄糖探测头或乳酸探测头；或者应用于气相中目标物的GC-MS气相色谱质谱仪装置的连接口头，所述探测头或连接头可无菌、密封地插装在理生化指标探测头仓内。

4.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述细胞对目标物质的比消耗率或比代谢率或比产生率，在因种种原因而发生较明显变化时，可以对其标准值进行修正，以保证对不同条件下的细胞培养进行上述监测。

5.如权利要求1所述的装置，其特征在于，

所述上游理生化指标探测头仓及无菌密封安装于其中的探测或连接头，在上游培养液中所监测目标物的量或浓度为已知固定值时，可以省却，而只保留所述下游理生化指标探测头仓及无菌密封安装于其中的探测或连接头，

所述下游理生化指标探测或连接头须与其上游所连接细胞培养装置靠近以增大所测数据的准确性。另外，所述下游理生化指标探测或连接头可以直接安装于细胞培养装置中的细胞相内。

6.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述细胞培养装置为上下游分别有液体入口、液体出口的各种细胞生物反应器、细胞培养wave装置、cellfactories、细胞培养T瓶、细胞培养转瓶、细胞培养培养袋在内的可重复使用或者一次性使用的细胞培养装置；其是单一一种和一个，或是多种或多个细胞培养装置混合组合而成。

7.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述流体控速无菌推动器可以是各种可控速的无菌推进培养液流动的装置，流体控速无菌推动器可以串联在细胞培养装置前或者后的液体管道上的任何适当位置，以推动和控速培养液或细胞混液无菌封闭式连续流经所述整个装置系统；并同时经数据线与监测控系统和/或计算机连接，以即时获取培养液或培养混液的流量数据。

8.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述监测的目标物是多个，当同时监测多于一个目标物时，可以使用包括求均值在内的方法综合计算得出活细胞数量或活细胞浓度。

9.一种非侵入式连续监测动态细胞数量或浓度的方法，尤其涉及一种对贴壁生长细胞培养或者对细胞组织培养的非侵入式连续在线或离线监测动态生长细胞数量或浓度的方法，其特征在于，包括：处于稳定态的特定细胞对某种营养物或代谢物或产物的比消耗率或比代谢率或比产生率是基本不变的；即一个特定细胞培养体/系统中的活细胞总数量或活细胞浓度与当时细胞对该目标营养物或代谢物或产物的消耗率或代谢率或产生率，成一定的正比关系。由此，通过对上述一个或多个目标物质因细胞对其消耗或代谢或产生而发生的变化的检测，来获取整个细胞培养体/系统中的活细胞数量或活细胞浓度；同时，配合实时在线的细胞培养装置和检测设置来实现毋须取出细胞作样品的非侵入式、连续在/离线监测动态生长细胞数量或浓度的。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述对动态细胞数量或浓度的监测采用了在线理生化指标探测头或连接头，以连续监测细胞培养体的液相或气相中目标物的浓度或量或活性。

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述对动态细胞数量或浓度的监测可以包括离线式的操作，即在细胞培养相上、下游人工取样，送到监测仪器中检测，然后把检测的数据输入检测控装置或计算机中，进行计算和控制。

12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)装接好至少有细胞培养液供给系统、细胞培养装置、理生化指标探测或连接头、流体控速无菌推动器、废或收获液系统、监测控系统和/或计算机等在内的完整系统；

(2)连续、定期或事件触发式地离线或在线检测流入和流出细胞培养相的一种或多种营养或代谢或产生物质的量或浓度，以其差值配以细胞培养液或混合液流速，获得目标营养或代谢或产生物质的消耗率或代谢率或产生率；然后根据所培养细胞对该种目标物的比消耗率或比代谢率或比产生率，得到细胞培养装置中动态生长细胞的数量或浓度。